發(fā)酵桔皮對釀酒酵母生長性能的影響研究

■ 馬吉喆 吳雨來 張林梅 葉倩穎 陸筑鳳 李加友* 徐 濤

(1.浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院，浙江杭州 310018；2.嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314001)

隨著生物工程技術、畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的發(fā)展以及中國居民對高蛋白類食品需求量的增加[1]，酵母類產(chǎn)品的開發(fā)利用已成為飼料工業(yè)的重中之重。中國飼料工業(yè)協(xié)會明確指出：我國的高蛋白飼料在配方結構、產(chǎn)品創(chuàng)新中更加趨向于酵母培養(yǎng)物類的飼料添加劑[2-3]。酵母飼料是利用酵母的新陳代謝，通過微生物發(fā)酵技術制成含有活菌、適口性良好、安全、無污染、無殘留的酵母培養(yǎng)物[4-5]。研究報道酵母飼料[6-7]不僅具有原料來源廣泛、生產(chǎn)速度快、蛋白質含量高的優(yōu)點，而且可以調節(jié)動物腸道微生物菌群結構、提高飼料利用率、增強動物機體免疫力[8-12]，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。但酵母存在的培養(yǎng)產(chǎn)量低、效率差等問題，使得酵母鉻、酵母葡聚糖、生物多肽等相關酵母飼料成本過高[13-15]。研究表明，提高酵母的生長性能主要采用添加輔助因子[16]和培養(yǎng)基優(yōu)化改良[17]等方法。其中，通過添加海藻糖等輔助因子可以增強酵母免疫力，使酵母具有高生物活性，但價格昂貴不便于投入到工業(yè)生產(chǎn)應用中。因此有必要進一步研究酵母菌在發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分之間的相互作用，通過添加發(fā)酵桔皮和酵母培養(yǎng)基優(yōu)化相結合，觀測酵母的生長趨勢變化，從而在酵母飼料工業(yè)中做到降本增效、改善生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品的市場競爭力。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

桔皮，寧波市象山華宇罐頭廠；葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）1118，嘉興學院發(fā)酵食品開發(fā)與分析檢測實驗室保藏菌種；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），安琪酵母股份有限公司；葡萄糖（食品級），浙江一諾生物科技有限公司；酵母浸膏，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；尿素（純度≥99.5%）、無水硫酸鎂（純度≥99.5%）、磷酸二氫鉀（純度99%）、蛋白胨，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100、酵母浸膏10、尿素2、無水硫酸鎂2 、磷酸二氫鉀5。

1.2 儀器與設備

ZHWY-200B 型全溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；CT14RD11臺式離心機，上海天美生化儀器設備有限公司產(chǎn)品；FR124CN 型分析天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 發(fā)酵桔皮的制備

稱取適量干燥桔皮，研磨過篩（10目篩網(wǎng)）置于發(fā)酵桶中，加入桔皮粉干重1.5 倍質量的水，混合均勻，用直徑1 cm打孔器從匍枝根霉1118的PDA固體培養(yǎng)基上取2 個菌苔，加入培養(yǎng)基中，使菌種與桔皮粉充分接觸。于28 ℃恒溫培養(yǎng)15 d。對發(fā)酵物進行過濾除渣，制成浸膏狀水溶性發(fā)酵桔皮（干物質含量21%），4 ℃下冷藏保存，備用。

2.2 酵母培養(yǎng)

菌種活化：將1 g釀酒酵母活性干酵母加入100 mL葡萄糖含量為2%的培養(yǎng)基中，38 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)30 min，對菌種進行活化，制得種子菌液。

釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)：取1 mL 種子菌液接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)。

2.3 酵母濃度測定

2.3.1 標準曲線繪制

取酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中1 mL 的樣液于顯微鏡下計數(shù)，將樣液分別梯度稀釋10、20、30、40、50 倍，并測定OD600，繪制OD600與對應酵母活菌數(shù)的標準曲線。

2.3.2 檢測方法

參照參考文獻[18]，采用吸光光度法對發(fā)酵液的生物量進行測定。并將發(fā)酵液進行梯度稀釋至1/20，利用分光光度計于600 nm 處測定吸光度，結果記為OD600，并以此讀數(shù)作為培養(yǎng)基中的酵母濃度。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗

2.4.1 單因素試驗

以釀酒酵母初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別考察發(fā)酵桔皮、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等不同添加量對釀酒酵母生長的影響，每次處理只改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基的一個因子。按1%（W/V）接入活化釀酒酵母，28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h檢測OD600，確定各單因素的最佳水平。

2.4.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以發(fā)酵桔皮（A）、葡萄糖（B）、蛋白胨（C）及酵母浸膏（D）為考察對象，采用L8(2)7正交試驗設計，對釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)基進一步優(yōu)化。各因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平（g/L）

2.4.3 Box-Benhnken響應面分析

在正交試驗基礎上，采用Box-Benhnken 設計結合響應面分析對發(fā)酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、酵母浸膏（G）等三個主要影響因子進行優(yōu)化。各因素Box-Benhnken設計方法與水平見表2。

表2 響應面分析各因素與水平(g/L）

2.4.4 桔皮發(fā)酵物成分檢測

用常規(guī)方法檢測桔皮發(fā)酵物中橙皮苷[19]、黃酮[20]等藥效成分含量以及多糖[21]、蛋白質[22]、脂肪[23]等營養(yǎng)成分。

2.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗進行5 次平行測定，借助Minitab 16、Design-Expert 13.0 和Origin 2021 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P<0.05 為差異顯著，P>0.05 為差異不顯著，0.05≤P<0.10表示具有差異顯著趨勢。

3 結果與分析

3.1 培養(yǎng)基組分對吸光度指標的影響

見表3，對發(fā)酵樣液中酵母活菌進行鏡檢并按梯度進行稀釋。記錄活菌數(shù)與OD600的對應變化繪制標準曲線，見圖1，得到標準曲線方程：y=1.201 27x-0.129 62，其中R2為99.157。表明采用OD600作為酵母生物量的測定中，培養(yǎng)基組分對吸光度沒有影響。

圖1 酵母活菌數(shù)對應OD600標準曲線

表3 活菌記錄結果

3.2 單因素試驗結果及分析

3.2.1 發(fā)酵桔皮濃度對釀酒酵母生長的影響

通過在發(fā)酵過程中添加相關的輔助因子能夠促進酵母生長、增強代謝、彌補酵母營養(yǎng)缺失的物質[24]。在實驗室對桔皮進行發(fā)酵處理后得到其水溶性浸膏狀物質，并將其作為生長刺激劑添加到原始培養(yǎng)基中，研究不同濃度的發(fā)酵桔皮對酵母生長代謝的影響，結果如圖2 所示。結果表明不同濃度的發(fā)酵桔皮可以不同程度提高培養(yǎng)體系中的釀酒酵母活菌數(shù)量，當發(fā)酵桔皮初提物濃度為2 g/L 時效果最好，酵母活菌檢測值從0.302 提高到0.561，說明發(fā)酵桔皮對酵母的生長代謝具有良好的刺激作用。

圖2 發(fā)酵桔皮添加濃度對酵母生長的影響

3.2.2 葡萄糖濃度對釀酒酵母生長的影響

葡萄糖是微生物生長的主要營養(yǎng)物質，初始濃度對生長和代謝都有重要影響[25]。在發(fā)酵桔皮濃度為2 g/L 的條件下，研究不同濃度的葡萄糖對酵母生長的影響，結果見圖3。當葡萄糖濃度為100 g/L 時，酵母濃度提高到0.572；繼續(xù)添加葡萄糖至160 g/L 時酵母濃度下降明顯。說明葡萄糖濃度過高對酵母對生長具有抑制作用。

圖3 葡萄糖濃度對釀酒酵母生長的影響

3.2.3 酵母浸膏濃度對釀酒酵母生長的影響

酵母浸膏富含豐富的營養(yǎng)物質，是釀酒酵母培養(yǎng)基的常用組分。通過改變原始培養(yǎng)基中酵母浸膏的添加量，考察酵母浸膏對釀酒酵母生長的影響，結果見圖4。當酵母浸膏添加量為12 g/L 時，酵母濃度最高可達0.609；酵母浸膏繼續(xù)增加菌體濃度稍有下降。

圖4 酵母浸膏濃度對釀酒酵母生長的影響

3.2.4 蛋白胨濃度對釀酒酵母生長的影響

不同微生物對氮源的需求不盡相同，蛋白胨是酵母生長的常用氮源[26]。蛋白胨添加量對釀酒酵母生長的影響見圖5，結果表明：在蛋白胨添加量為8 g/L時，酵母濃度達到最高值0.638。但是，在考察的蛋白胨濃度范圍內（7～11 g/L），酵母濃度的最大差異僅為3%，變化并不顯著。

圖5 蛋白胨濃度對酵母生長的影響

3.3 正交試驗結果及分析

在單因素試驗的基礎之上，根據(jù)各單因素的最佳添加量，并結合不同因素之間的交互影響，采用7因素2 水平進行正交試驗，結果見表4。根據(jù)極差（R）大小比較不同因素對釀酒酵母生長的影響：發(fā)酵桔皮（A）>葡萄糖（B）>葡萄糖與發(fā)酵桔皮的交互作用AB>酵母浸膏（D）>蛋白胨（C）；另一方面，葡萄糖和發(fā)酵桔皮具有交互作用，可能是發(fā)酵桔皮有利于促進葡萄糖的代謝，具體機理有待深入研究。從表4 可以看出，培養(yǎng)基各因子的最優(yōu)組合為A2B2C2D1。但蛋白胨濃度的影響水平只有0.02，相對較小，因此進行單因素最佳水平的響應面分析試驗時不作為主要考慮因素。理論最優(yōu)培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖110、蛋白胨9、酵母浸膏11、發(fā)酵桔皮2.2、無水硫酸鎂2、尿素2、磷酸二氫鉀5。

表4 正交試驗結果

3.4 Box-Benhnken響應面結果及分析

3.4.1 Box-Benhnken響應面優(yōu)化試驗及結果分析

設OD600讀數(shù)（Z）為響應值，采用Box-Benhnken響應面優(yōu)化設計原理，考察發(fā)酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、酵母浸膏（G）三個因素對OD600讀數(shù)（Z）的影響。OD600讀數(shù)響應面試驗設計及結果見表5。由表5可以看出，不同添加量的E、F、G對OD600讀數(shù)（Z）的影響各不相同。

表5 Box-Benhnken響應面優(yōu)化試驗及結果分析

3.4.2 OD600讀數(shù)響應面優(yōu)化試驗回歸模型及方差分析

將OD600讀數(shù)（Z）響應面結果進行二次響應面回歸分析，結果見表6。

表6 各因素影響的主效應分析

由表6 可以看出，目標函數(shù)R的響應面模型P值遠小于0.01，表示模型的顯著性極好，所得多項回歸方程可以準確反映各因素對響應值的影響。模型中的自變量一次項變量E、F、G和二次項EF、EG、E2、F2、G2的P值都小于0.05，說明E、F、G是重要的模型項且具有顯著作用。其中預測系數(shù)R2與決定系數(shù)R2差值為0.015 7 表明該模型的預測結果與實際結果的合理一致性，準確性>4，表示該單因素響應面模型信號充足，可以用于模型預測設計。其決定系數(shù)R2為0.996 1，表明99.61%以上的響應值均可由該模型解釋。因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

通過Design-Expert 13軟件進行二次響應面回歸分析，得到多元二次響應面回歸模型：

式中：Z——OD600讀數(shù)；

E——發(fā)酵桔皮濃度（g/L）；

F——葡萄糖濃度（g/L）；

G——酵母浸膏濃度（g/L）。

3.4.3 三維響應面分析

根據(jù)二次多項回歸方程繪制出響應面，發(fā)酵桔皮濃度與葡萄糖濃度的響應曲面如圖6，發(fā)酵桔皮濃度與酵母浸膏濃度的響應曲面如圖7，葡萄糖濃度與酵母浸膏濃度的響應曲面如圖8。

圖6 E與F響應面3D建模

圖7 E與G響應面3D建模

圖8 F與G響應面3D建模

根據(jù)發(fā)酵桔皮濃度、葡萄糖濃度與酵母浸膏濃度兩兩之間的響應曲面表明，在發(fā)酵桔皮濃度E坐標軸上，OD600讀數(shù)變化最快，而在酵母浸膏濃度G的坐標軸方向，OD600讀數(shù)變化較慢，說明發(fā)酵桔皮濃度的影響水平較大。其中圖6 的響應面扭曲最大，說明發(fā)酵桔皮濃度與葡萄糖濃度之間是具有明顯交互作用；圖7 的響應面扭曲程度也是顯著的，說明發(fā)酵桔皮濃度與酵母浸膏濃度之間是具有交互作用。其中EF的P值小于0.05，證實正交試驗中發(fā)酵桔皮濃度和葡萄糖濃度之間的交互影響作用，說明發(fā)酵桔皮的添加對OD600讀數(shù)的影響并不是簡單的線性關系，其中二次項EF、EG的P值小于一次項E、F的P值，且P值均小于0.05；說明該發(fā)酵桔皮對培養(yǎng)基中主要成分的交互影響作用大于其自身，表明發(fā)酵桔皮的添加可以刺激釀酒酵母的生長與代謝。

3.5 酵母發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結果

3.5.1 優(yōu)化前后酵母數(shù)量的對比

通過Design-Expert 13軟件優(yōu)化結果見圖9，在此預測條件下酵母濃度為0.709，具有97.9%的可信度。通過對釀酒酵母進行培養(yǎng)后酵母濃度為0.695，達到了響應面分析預測值的98.3%；相對于不添加發(fā)酵桔皮的優(yōu)化培養(yǎng)基，酵母濃度提高了37.4%；與不添加發(fā)酵桔皮的初始培養(yǎng)基相比，酵母濃度提高了130%（見圖10）。

圖9 響應面模型優(yōu)化結果

圖10 優(yōu)化前后釀酒酵母活菌對比

3.5.2 酵母生長曲線繪制

通過Design-Expert 13 軟件優(yōu)化結果，表明酵母發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、發(fā)酵桔皮濃度1.906 g/L、無水硫酸鎂2 g/L、尿素2 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L?；陧憫娣治龅玫降淖顑?yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母，以添加發(fā)酵桔皮的培養(yǎng)基為試驗組，不添加發(fā)酵桔皮的培養(yǎng)基為對照組，繪制出釀酒酵母生長曲線，如圖11 所示。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵桔皮添加能夠在各個時間段明顯提高酵母活菌數(shù)量，并且縮短酵母進入對數(shù)生長期的時間。

圖11 釀酒酵母生長曲線

3.6 桔皮發(fā)酵物成分檢測結果

發(fā)酵桔皮與未發(fā)酵桔皮中營養(yǎng)成分比較見表7。通過對桔皮進行發(fā)酵處理后，發(fā)酵桔皮中的脂肪含量下降51.99%，總黃酮含量、橙皮苷含量、多糖、蛋白質含量得到了明顯的提高，使得發(fā)酵桔皮中含有更多可供酵母吸收和利用的相關物質。

表7 發(fā)酵桔皮與未發(fā)酵桔皮營養(yǎng)成分

4 討論

黃酮是一類具有促生長、免疫調節(jié)、抗菌的天然植物化合物，其來源廣泛并且應用前景廣闊。通過對發(fā)酵桔皮和未發(fā)酵桔皮的成分進行測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過發(fā)酵后桔皮中相關營養(yǎng)物質的含量大幅度提高，其中發(fā)酵桔皮中的總黃酮含量是未發(fā)酵桔皮的3.24倍，橙皮苷的含量為之前的1.86 倍，蛋白質含量為之前的4.71 倍。說明通過對桔皮進行發(fā)酵處理后，不但桔皮中有效的中藥成分總黃酮含量得到了提高，而且降低了其中的脂肪含量，提高了多糖以及蛋白質等可供酵母菌生長的小分子營養(yǎng)物質的含量。其中橙皮苷是由橙皮素和蕓香糖構成的一種重要的二氫黃酮類物質，具有較高的抗氧化功能。使得酵母細胞的衰老速度下降，更具有生物活力，使得酵母的生長速度提高。左瑞華等[27]研究發(fā)現(xiàn)蕨菜黃酮可以提高肉雞的平均日增重量。楊汝才等[28]在飼料中添加辣木黃酮顯著降低了雛鴨血清中丙二醛（MDA）含量。王詠梅等[29]在飼料中添加桑葉黃酮使得蝦的抗氧化性能得到提高。因此，桔皮經(jīng)過發(fā)酵后可以憑借其自身無污染、高蛋白、高抗氧化的特性作為酵母的生長刺激因子用于酵母高蛋白飼料的生產(chǎn)中。

5 結論

在單因素試驗基礎上，經(jīng)過正交試驗選出關鍵影響因子，結合響應面優(yōu)化分析獲得了釀酒酵母培養(yǎng)基的相關數(shù)學模型，推測出最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、發(fā)酵桔皮濃度1.906 g/L、無水硫酸鎂2 g/L、尿素2 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L。在此條件下酵母濃度為0.695，是初始發(fā)酵培養(yǎng)基的1.3倍。與不添加發(fā)酵桔皮的檢測結果對比，發(fā)酵桔皮可以提高釀酒酵母增殖速率，促進釀酒酵母生長，加快酵母進入對數(shù)生長期，是一種高效的生長刺激劑。本試驗豐富了酵母的繁殖環(huán)境，提高了酵母的發(fā)酵能力，為酵母飼料工業(yè)生產(chǎn)高蛋白飼料、提高相關酵母培養(yǎng)物產(chǎn)量以及降低生產(chǎn)成本提供一種新的途徑。