莢膜甲基球菌蛋白遺傳毒性研究和被動皮膚過敏試驗

■ 高嫣珺 聶 雅 陳秀云 張思微 劉 瑜 卜仕金*

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009；3.揚州大學醫(yī)學院，江蘇揚州 225009）

豆粕是當前主流的飼料蛋白質原料，2022年飼料中豆粕用量為6 580 t，占比為14.5%[1]。我國大豆高度依賴進口，2022 年進口量達9 108 萬噸，大部分用于生產飼用豆粕，但自然災害等因素使其進口有很大的不確定性[2]。為了應對外部的不確定性，農業(yè)農村部于2023 年4 月12 日印發(fā)了《飼用豆粕減量替代三年行動方案》的通知，充分挖掘微生物菌體蛋白，實現2025 年新批準1～2 種微生物菌體蛋白上市，以減少豆粕依賴，是行動的目標之一[3]。莢膜甲基球菌蛋白（Methylococcus capsulatus bacteriameal，MBM）來源于天然存在的非轉基因微生物的培養(yǎng)物，粗蛋白含量高達65%，主要由甲烷氧化菌莢膜甲基球菌在發(fā)酵過程中使用甲烷、氧氣、氨氮和礦物質迅速增殖產生，其生產不占用耕地、不使用動植物性原料且僅耗費極少的水資源，相比于傳統的動植物蛋白具有顯著的優(yōu)勢[4-6]。研究表明，MBM 不僅可代替魚粉成為大西洋鮭魚、虹鱒、羅非魚等水產動物飼用蛋白質來源，在畜禽（斷奶仔豬、育肥豬）養(yǎng)殖業(yè)同樣具有廣闊的應用前景[7-10]。為了將MBM 開發(fā)為新飼料原料，本研究進行了包括鼠傷寒沙門氏菌回復突變（Ames）試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗在內的MBM遺傳毒性研究和大鼠被動皮膚過敏試驗，提供MBM開發(fā)為新飼料原料所需的毒理學安全性評價資料[11]，為MBM 在我國養(yǎng)殖業(yè)作為替代蛋白飼料原料應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 受試物

MBM，粗蛋白含量≥65%，褐色粉末。批號為FNJ012-20210308，由愷迪蘇（重慶）有限公司南京中試基地提供。用于Ames 試驗的不同濃度MBM 水溶液使用無菌水溶解；用于小鼠骨髓細胞微核和精子畸形試驗的不同濃度的MBM 混懸液使用0.5%羧甲基纖維素鈉配制；用于被動皮膚過敏試驗的MBM 生理鹽水溶液使用生理鹽水溶解。不同濃度的MBM 溶液均采用2倍遞次稀釋法配制。

1.2 主要試劑

環(huán)磷酰胺購自Halle 公司；Giemsa 染液購自Solorbio 公司；疊氮鈉、敵克松、2-氨基芴、2-氨基蒽和1,8-二羥蒽醌購自Sigma公司；羧甲基纖維素鈉、磷酸氫鈉銨、枸椽酸、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、二甲基亞砜、D-生物素、L-組氨酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、氧化型輔酶Ⅱ、瓊脂粉、牛肉膏、胰胨等購自國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

代謝活化系統（S9）在試驗前由多氯聯苯在雄性成年Wistar 大鼠誘導制備，活力經診斷性誘變劑鑒定符合試驗要求。

1.3 主要儀器

D98-9052B-2 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司；CX2 光學顯微鏡購自Olympus 公司；Centrifuge 5415R 高速冷凍離心機、微量移液器購自Eppendorf 公司；BCD-251WDGW 購自Haier公司。

1.4 試驗動物與菌株

試驗動物：清潔級ICR小鼠100只，體重25～35 g，其中75 只為雄性，25 只為雌性；清潔級Wistar 大鼠250 只，體重150～180 g，雌雄各半。試驗動物均購自揚州大學比較醫(yī)學中心，動物生產許可證號為SCXK（蘇）2022-0009，使用許可證號為SYXK（蘇）2022-0044。

試驗菌株：Ames 試驗使用的標準測試菌株為組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，購自Moltox 公司，經生物學特性鑒定合格后用于試驗。

1.5 試驗方法

1.5.1 Ames試驗

參考《獸藥Ames 試 驗指導 原則》[12]和《GB 15193.4—2014 細菌回復突變試驗》[13]進行試驗設計，根據點試法進行的預試驗結果，設高（10 mg/皿）、中高（5 mg/皿）、中（2.5 mg/皿）、中低（1.25 mg/皿）、低（0.625 mg/皿）共5 個MBM 劑量組，另設陰性對照組（無菌水）及陽性對照組，每個劑量組包括有S9（+S9）和無S9（-S9）兩個系列，采用平板滲入法，測試MBM對TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 的致突變作用，每個MBM劑量組或對照組每種菌株分別設3個平行皿，于37 ℃培養(yǎng)48 h 后計數每皿的回變菌落數。如果MBM 劑量組回變菌落數的增加超過陰性對照組2 倍以上，且滿足以下兩種情況之一：①有劑量-反應關系；②某一測試點有可重復的陽性結果，則可判定為陽性結果。

1.5.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

參考《獸藥小鼠骨髓細胞微核試驗指導原則》[12]和GB 15193.5—2014《哺乳動物紅細胞微核試驗》[14]進行試驗設計，設高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）和低（2 500 mg/kg）3個MBM 劑量組，另設陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）和陰性對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉），每組10 只小鼠，雌雄各半。采用30 h 兩次染毒法，即兩次染毒間隔24 h，第2 次染毒后6 h 采集骨髓樣品制片。MBM 劑量組和陰性對照組經口灌胃染毒，陽性對照組腹腔注射，高、中、低MBM 劑量組染毒藥液分別為0.5、0.25、0.125 g/mL 濃度的MBM 混懸液，除陽性對照組外各組均灌胃20 mL/kg。每組采樣10 只小鼠，使用胸骨段骨髓，吉姆薩染色，每只小鼠制片2張。閱片時每張涂片計數嗜多染紅細胞（PCE）1 000個，觀察并計數其中含有微核的PCE 細胞（一個PCE 中含多個微核按一個計），同時計數同一視野下的成熟紅細胞（RBC）。計算PCE/RBC 比值和微核率（‰），按照公式計算微核率。

嗜多染紅細胞微核率（‰）=含微核的嗜多染紅細胞/檢查嗜多染紅細胞總數×1 000

PCE/RBC應在小鼠的參考值（0.6～1.2）范圍內，陰性對照組微核率應小于5‰，如MBM 劑量組微核率與陰性對照組存在統計學差異，并且呈現劑量-反應關系，則可判定MBM微核試驗結果陽性。

1.5.3 小鼠精子畸形試驗

參考《獸藥小鼠精子畸形試驗指導原則》[13]和GB 15193.7—2003《小鼠精子畸形試驗》[15]進行試驗設計，設高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）和低（2 500 mg/kg）3 個MBM 劑量組和陽性（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）、陰性對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉），每組10 只雄性小鼠。MBM 劑量組和對照組連續(xù)經口灌胃染毒5 d，高、中、低MBM劑量組染毒藥液分別為0.5、0.25、0.125 g/mL濃度的MBM 混懸液，陽性對照組為濃度為2 mg/mL 的環(huán)磷酰胺溶液（溶劑為生理鹽水），各組灌胃體積均為20 mL/kg。首次染毒后第35天安樂死動物，每組采樣10 只小鼠，取雙側附睪制片，2%伊紅染色，每只小鼠制片2 張，每只小鼠計數共1 000 個精子中的畸形數，并分類計數（分為無鉤、香蕉形、無定性、雙頭、胖頭、尾折疊和雙尾），根據公式計算精子畸形率（%）。

精子畸形率（%）=畸形精子數/（正常精子數+畸形精子數）×100

陰性對照組精子畸形率在質控范圍（0.8%～3.4%）內，且陽性與陰性對照精子畸形率差異極顯著（P<0.01），則表明該試驗系統可靠。MBM劑量組小鼠的精子畸形率為陰性的2倍或2倍以上，或有統計學差異，且存在劑量-反應關系，則可判斷試驗結果為陽性。

1.5.4 被動皮膚過敏試驗

參考《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》[16]進行試驗設計，按體重設高（1 000 mg/kg）、中（500 mg/kg）、低（250 mg/kg）3 個MBM 劑量組，另設陽性對照組（牛血清白蛋白15 mg/kg）和陰性對照組（生理鹽水）。10只大鼠，雌雄各半，隨機均分為5組，對應各組劑量皮下注射，隔日一次，共3次，MBM劑量組和對照組均注射3 mL/kg，MBM和牛血清白蛋白溶劑均為生理鹽水。末次致敏后第14天采血，2 000 r/min離心10 min 分離抗血清，使用生理鹽水將各組抗血清為1∶2、1∶8、1∶32三個濃度。將240只大鼠分為5組，中、低MBM 劑量組各30 只，其余組各60 只，雌雄各半，在動物背部預先脫毛3 cm×4 cm 的區(qū)域，皮內注射各對應組不同濃度的抗血清0.1 mL進行被動致敏，中、低MBM 劑量組被動致敏24 h，其余組不同抗血清濃度分別致敏24 h和48 h，每組每個濃度不同時間均致敏10 只大鼠。到達致敏時間后，皮下注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原進行激發(fā)，同時靜脈注射1.0%伊文思蘭染料1.0 mL。30 min 后安樂死各組大鼠，剪取背部皮膚，測量皮膚內層的斑點大小，不規(guī)則斑點的直徑為長徑與短徑之和的一半，直徑大于5 mm者判定為陽性，計算各組的陽性百分率（%）。

1.6 數據分析

試驗結果均采用“平均值±標準差”表示，使用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，組間統計學顯著性比較采用X2檢驗，顯著性水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結果與分析

2.1 Ames試驗

Ames 試驗結果見表1，MBM 每皿劑量為0.625～10.000 mg，有或無S9 時，5 種鼠傷寒沙門氏菌試驗株的每皿平均回變菌落數均在陰性對照的兩倍以內，未見劑量-反應關系，兩次試驗結果均一致。表明MBM對鼠傷寒沙門氏菌無致突變性，MBM 的Ames 試驗結果為陰性。

表1 MBM鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果（n=3）

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

由表2 可知，MBM 劑量組和陰、陽性對照組PCE/RBC 均在參考范圍內，雌、雄小鼠MBM 劑量組PCE 微核率與陰性對照組比較無顯著差異（P≥0.05），且陽性對照組與MBM 劑量組、陰性對照組比較差異極顯著（P<0.01），同一MBM 劑量組內雌、雄小鼠微核率顯著的性別差異（P≥0.05）。結果表明，MBM 在2 500～10 000 mg/kg 劑量范圍內小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性。

表2 MBM小鼠骨髓細胞微核試驗結果（n=5）

2.3 小鼠精子畸形試驗

由表3 可知，陰性對照組精子畸形率在質控范圍內，MBM 劑量組精子畸形率未達陰性對照組的2倍且與陰性對照組比較無顯著差異（P≥0.05），而陽性對照組與MBM 劑量組和陰性對照組比較差異均極顯著（P<0.01）。以上結果表明本試驗系統可靠，MBM 在2 500～10 000 mg/kg 劑量范圍內小鼠精子畸形試驗結果為陰性。

表3 MBM小鼠精子畸形試驗結果（n=10）

2.4 被動皮膚過敏試驗

由表4 可知，三個MBM 劑量組和陰性對照組在1∶2、1∶8、1∶32抗血清濃度，激發(fā)24 h和48 h，所有大鼠皮膚內側的藍色反應斑直徑均≤5 mm，陽性對照組大鼠皮膚內側的藍色反應斑直徑均>5 mm。MBM劑量組與陰性對照組比較無顯著統計學差異（P≥0.05），與陽性對照組比較差異極顯著（P<0.01）。以上結果表明MBM 在250～1 000 mg/kg 劑量范圍內對大鼠的被動皮膚過敏試驗結果為陰性。

表4 MBM被動皮膚過敏試驗結果（n=10）

3 討論

MBM 作為一種非動植物源性的新型可持續(xù)功能性蛋白原料在國外沿用已久，商品名為Feed-Kind?，但其首次進入我國市場，尚未批準使用[17]。《新飼料和新飼料添加劑管理辦法》[11]中規(guī)定，新飼料原料的申請資料必須包括毒理學安全評價資料，因此對MBM 進行全面的毒理學安全性評價對其今后在我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的應用具有重大的推動作用。前期已完成的大、小鼠急性經口毒性試驗和90 d 亞慢性毒性試驗結果顯示，MBM 在大、小鼠的LD50均≥10 g/kg，無作用劑量至少達到3 100 mg/kg。本研究所涉及的試驗根據前期急性和亞慢性毒性研究結果和相關指導原則要求設置劑量組，保證受試物得到充分暴露。本研究參照《獸藥研究技術指導原則》[12]和食品安全國家標準[13-15]，進行MBM 的Ames 試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗研究其遺傳毒性，其中Ames 試驗根據要求設置在最高劑量下設4 個劑量組，共設5 個MBM 劑量組；微核試驗和精子畸形試驗根據要求均設3 個MBM 劑量組。同時，參照人用藥的相關指導原則[16]進行大鼠皮膚被動過敏試驗，設3 個MBM 劑量組，在各劑量組設1∶2、1∶8、1∶32 共3 個抗血清濃度。在Ames 試驗中，每皿劑量在0.625～10 mg 范圍內，在加和不加S9時，各MBM 劑 量 組TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535 回變菌落數均與陰性對照接近，遠低于陽性的判斷標準，表明MBM 對鼠傷寒沙門氏菌無致突變作用。骨髓細胞微核試驗通過測量微核率來評價受試物對染色體的損傷，本試驗劑量下，MBM 對小鼠骨髓細胞的微核率與陰性對照組無統計學差異且未達兩倍，三個MBM 劑量組微核率接近，未呈現明顯的劑量-反應關系；同時，小鼠精子畸形試驗MBM 劑量組各類精子畸形數和總精子畸形率均符合陰性結果的標準。大鼠被動過敏試驗中，三個MBM 劑量組在不同抗血清濃度和激發(fā)時間下，所有動物藍斑直徑均≤5 mm，均未出現過敏反應。

4 結論

在本試驗條件和劑量下，MBM 未顯示遺傳毒性和潛在的致敏作用，MBM 作為新飼料原料使用具有較高的安全性。