復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨血清生化、盲腸短鏈脂肪酸及微生物區(qū)系的影響

■ 盧麗枝 雷麗莉 章岳軍 高秋玲 吳永峰 吳忠才 沈水寶 張淑芳*

（1.廣西壯族自治區(qū)畜牧站，廣西南寧 530022；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；3.英杰（長(zhǎng)沙）生物科技有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410000；4.廣西桂柳牧業(yè)集團(tuán)，廣西桂林 541000）

我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)規(guī)定，自2020 年7 月1 日起停止生產(chǎn)使用含有生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑（中藥類(lèi)除外）的商品飼料。自此，我國(guó)正式迎來(lái)了飼料無(wú)抗時(shí)代[1]。但隨著禁抗時(shí)代的到來(lái)，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)面臨的新問(wèn)題是畜禽抵抗力降低，患病率有所增加，生產(chǎn)效益降低，給養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）帶來(lái)不小的經(jīng)濟(jì)損失，因此尋找新的替抗產(chǎn)品勢(shì)在必行。益生菌作為一種活的微生物，當(dāng)宿主體內(nèi)積累到一定劑量時(shí)可以起到增強(qiáng)機(jī)體免疫力，減少腸道疾病的效果[2]。益生菌被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，通過(guò)定植在動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)宿主黏膜與免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收保持腸道健康[3]。因此，益生菌對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的影響研究也受到廣泛關(guān)注。阮勝鋼等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在雛鴨飼料中添加枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的復(fù)合益生菌，增加了雛鴨的免疫能力，并顯著提高了28 日齡雛鴨的平均日增重；Song等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激的肉雞飼糧中添加由植物乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌組成的復(fù)合益生菌可有效增加小腸中乳酸桿菌等有益菌群定植。鴨具有耐寒、耐粗飼、免疫力強(qiáng)，早期生長(zhǎng)較快，但是由于現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖條件，養(yǎng)殖密度大、飲水條件差和冷熱應(yīng)激較大，造成鴨容易出現(xiàn)腸道問(wèn)題[6]。研究旨在探究嗜酸乳桿菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組成的復(fù)合益生菌在不同添加量下對(duì)紹興鴨血清生化、盲腸短鏈脂肪酸及微生物區(qū)系的影響，為益生菌在改善鴨腸道健康以及免疫方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用復(fù)合益生菌購(gòu)自英杰（長(zhǎng)沙）生物科技有限公司提供，主要有效成分為嗜酸乳桿菌1×109CFU/g、屎腸球菌1×109CFU/g、枯草芽孢桿菌1×109CFU/g、地衣芽孢桿菌1×109CFU/g。試驗(yàn)所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。試驗(yàn)動(dòng)物和養(yǎng)殖場(chǎng)地均由廣西桂柳牧業(yè)集團(tuán)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取同一批次健康、體重相近1日齡的紹興鴨1 200只，隨機(jī)分4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，A組在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加100 mg/kg 復(fù)合益生菌，B 組在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加200 mg/kg 復(fù)合益生菌，C 組在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加300 mg/kg 復(fù)合益生菌。預(yù)試期3 d，正試期30 d。飼養(yǎng)試驗(yàn)在廣西桂柳牧業(yè)集團(tuán)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，均采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式，自由采食和飲水，免疫程序按照鴨場(chǎng)現(xiàn)行常規(guī)免疫進(jìn)行。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參考NY/T 827—2004《紹興鴨飼養(yǎng)技術(shù)規(guī)程》[7]并結(jié)合試驗(yàn)鴨場(chǎng)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)全期飼喂顆粒料，基礎(chǔ)飼糧組成以及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 樣品采集

于正試期第30 天，試驗(yàn)鴨禁食12 h，正常飲水，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1 只紹興鴨進(jìn)行翅下靜脈采血，3 000 r/min離心15 min后，用移液槍將血清移到1.5 mL離心管中，-20 ℃保存，用于測(cè)定血清生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)；隨后進(jìn)行安樂(lè)死屠宰，取盲腸內(nèi)容物，-80 ℃保存，用于測(cè)定盲腸短鏈脂肪酸和微生物區(qū)系。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

分別在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束當(dāng)天以重復(fù)為單位對(duì)其進(jìn)行空腹稱(chēng)重，用于計(jì)算平均日增重；以每組每個(gè)重復(fù)為單位記錄試驗(yàn)鴨的投料量以及剩余料量，用于計(jì)算平均日采食量和料重比。

平均日增重（g）=（末體重-初體重）/試驗(yàn)天數(shù)

平均日采食量（g）=（投料量-剩余料量）/試驗(yàn)天數(shù)/試驗(yàn)鴨數(shù)

料重比=平均日采食量/平均日增重

1.5.2 血清生化指標(biāo)

采用購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司的ELISA 試劑盒，使用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）等血清生化指標(biāo)以及血清免疫球蛋白M、A、G（IgM、IgA、IgG）指標(biāo)含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.3 盲腸短鏈脂肪酸

測(cè)定盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量；采用直接進(jìn)樣的氣相色譜法和內(nèi)標(biāo)定量能計(jì)算法測(cè)定分析盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的含量。

1.5.4 盲腸微生物區(qū)系

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，在無(wú)菌的操作下取盲腸內(nèi)容物1.5～2.0 mL裝入凍存管，-80 ℃保存，然后干冰送往上海生物醫(yī)藥科技有限公司委托進(jìn)行16S rRNA V3～V4微生物區(qū)系檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 簡(jiǎn)單整理后，使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并以Duncan’s法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，與對(duì)照組相比，A、B、C 組紹興鴨的平均日增重和平均日采食量差異不顯著（P>0.05），但3個(gè)試驗(yàn)組平均日增重分別增加2.4%、5.3%、4.6%，平均日采食量分別增加2.0%、2.5%、3.1%；A、B、C 組紹興鴨的料重比均低于對(duì)照組，其中B、C 組顯著低于對(duì)照組（P<0.05），A、B、C組分別降低0.5%、4.2%、1.6%。

表2 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨生長(zhǎng)性能的影響

2.2 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨血清生化指標(biāo)的影響

由表3 可知，與對(duì)照組相比，A、B、C 組紹興鴨總蛋白、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、葡萄糖、尿素氮、三酰甘油、總膽固醇等血清生化指標(biāo)差異不顯著（P>0.05）；A、B、C 組紹興鴨的IgM 和IgA含量極顯著提高（P<0.01），但各試驗(yàn)組中IgG 含量與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。

表3 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨血清生化指標(biāo)的影響

2.3 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸短鏈脂肪酸含量的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，A、B、C組紹興鴨盲腸乙酸含量顯著提高（P<0.05），分別增加14.3%、7.14%；A、B、C組紹興鴨盲腸丙酸、丁酸含量與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）；A組紹興鴨盲腸異戊酸含量顯著提高（P<0.05），盲腸異戊酸含量顯著降低50%（P<0.05）。

表4 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸短鏈脂肪酸含量的影響（mmol/g）

2.4 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸微生物區(qū)系的OTU分析

由表5和圖1可知，對(duì)照組的OTU數(shù)量為1 046個(gè)，A、B、C 組分別為988、971、1 058 個(gè)；其中對(duì)照組特有OTU 數(shù)量為66 個(gè)，A 組特有OTU 數(shù)量為65 個(gè)，B 組特有OTU數(shù)量為33個(gè)，C組特有OUT數(shù)量為34個(gè)。

圖1 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸OTU數(shù)量韋恩圖

表5 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸微生物區(qū)系OTU數(shù)量的影響

2.4.2 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸微生物區(qū)系門(mén)水平物種分布的影響

由圖2 可知，紹興鴨盲腸微生物門(mén)水平物種組成相對(duì)豐度排行前7 位的微生物。各組盲腸菌群組成主要由擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)（Actinobacteriota）、脫硫菌門(mén)、延葉桿菌門(mén)、螺旋藻門(mén)等組成。其中差異菌門(mén)為擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。擬桿菌門(mén)占整個(gè)菌群的比例，對(duì)照、A、B、C 組分別為46.4%、56.9%、47.1%、51.1%；厚壁菌門(mén)占整個(gè)菌群比例，對(duì)照、A、B、C 組分別為47.9%、38.2%、40.1%、42.2%。從圖3 可以看出，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組差異菌門(mén)擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度均差異顯著（P<0.05）。

圖2 門(mén)水平上物種分布

2.4.3 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸微生物區(qū)系屬水平物種分布的影響

由圖4 可知，紹興鴨盲腸微生物屬水平物種組成相對(duì)豐度排名前34 位微生物，其中對(duì)照、A、B、C 組總和占總菌屬的比例分別是78.5%、84.2%、79.7%、80.2%，優(yōu)勢(shì)菌屬擬桿菌屬占總菌屬比例分別為25.9%、38.2%、40.1%、42.2%。其中差異菌群為瘤胃球菌屬和拉氏鱗毛蕨屬，從圖5 可以看出，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組差異菌屬瘤胃球菌屬和拉氏鱗毛蕨屬差異顯著（P<0.05）。

圖5 屬水平差異菌群相對(duì)豐度

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨生長(zhǎng)性能的影響

注：Bacteroides，擬桿菌屬；Prevotellaceae_Ga6A1_group，普雷沃氏菌Ga6A1；unclassified_f＿Lachnospiraceae，未分類(lèi)的毛螺菌屬；Prevotella，普氏菌屬；Faecalibacterium，糞桿菌屬；Rikenellaceac_RC9_gut_group，理研菌RC9；unclassified_f＿Oscillospiraceae，未分類(lèi)的顫螺旋菌屬；Parabacteroides，青春雙歧桿菌屬；Prevotellaceae_UCG-001，普雷沃氏菌屬UCG001；norank_f＿norank_o＿Clostridia_UCG-014，梭狀芽孢桿菌屬UCG014；UCG-005，擬普雷沃氏菌屬UCG-005； Prevotellaceae_NK3B31_group，普雷沃氏菌科NK3B31；unclassified_o＿Bacteroidales，未分類(lèi)的擬桿菌屬；Shutteworthia，梭狀花屬；Ruminococcus_torques＿group，瘤胃球菌屬；norank_f＿Eubacterium_coprostanoligenes_group，未分類(lèi)的糞真桿菌屬；norank_f＿Prevotellaceae，未分類(lèi)的普雷沃氏菌屬；Lachnoclostridium，拉氏鱗毛蕨屬；Subdoligranulum，罕見(jiàn)小球菌屬；norank_f＿Oscillospiraceae，顫螺旋菌科；Butyricicoccus，丁酸桿菌屬；Mucispirillum，黏液螺旋菌屬；Desulfovibrio，脫硫弧菌屬；Alistipes，另枝菌屬；Romboutsia，郎布特西亞屬；norank_f＿norank_o＿Bacteroidales，未分類(lèi)的擬桿菌目；Oribacterium，假丁酸弧菌屬；Megamonas，巨單胞菌屬；Christensenellaceae_R-7_group，克里斯滕森菌科R-7；Treponema，密螺旋體屬；others，其他。

畜禽生長(zhǎng)發(fā)育狀況是畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）衡量生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)[8]。李小芬等[9]研究表明，在飼料中添加乳酸桿菌、納豆芽孢桿菌均可以提高櫻桃谷肉鴨的平均日增重和終末體重，降低料重比，從而增加經(jīng)濟(jì)效益；劉曉琳等[10]研究表明，在日糧中添加0.05%枯草芽孢桿菌可提高櫻桃谷鴨的育成率，降低料重比。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相同，飼糧中添加復(fù)合益生菌可顯著降低紹興鴨的料重比，且添加量200 mg/kg效果較好。

3.2 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨血清生化指標(biāo)的影響

動(dòng)物的血液指標(biāo)反映動(dòng)物在其內(nèi)外部環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)配制的生理變化[11]。血清中白蛋白是最豐富的血漿蛋白，約占血清蛋白的55%～56%，其中白蛋白主要與其合成和分解代謝有關(guān)，并起到維持血液滲透壓的作用，球蛋白則是血清免疫球蛋白的主要成分，主要參與動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸以及免疫等功能，共同參與機(jī)體的代謝和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定?？偟鞍卓梢詾閯?dòng)物生長(zhǎng)提供良好的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其含量也是反映動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況的指標(biāo)之一[12-13]。許運(yùn)岑[14]研究表明，枯草芽孢桿菌可以顯著提高AA肉雞血清中的總蛋白和球蛋白含量，但對(duì)血清中白蛋白含量影響不大。蔣山翊等[15]研究表明，0.02%枯草芽孢桿菌可以顯著提高白羽肉雞血清中白蛋白、總蛋白和球蛋白的含量。劉小龍等[16]研究表明，添加單獨(dú)或者聯(lián)合使用抗菌肽或合生素（植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和殼寡糖）可顯著提高AA 肉雞血清中白蛋白和總蛋白含量。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相悖，飼糧中添加復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨血清中白蛋白、總蛋白和球蛋白均無(wú)顯著影響，其可能原因是益生菌菌株種類(lèi)以及含量不同，或者是試驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)以及試驗(yàn)環(huán)境差異影響。

益生菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體有免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)IgA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而增強(qiáng)機(jī)體抵御入侵病原體的免疫作用[17]。Tana 等[18]研究表明，添加1%的乳桿菌復(fù)合物可顯著提高肉仔雞血清中IgG 和IgA 的含量。陳輝[19]研究表明，添加0.4%、0.6%、0.8%的復(fù)合益生菌可顯著提高肉仔雞21 日齡和42 日齡血清中IgG 的含量。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相同，添加復(fù)合益生菌可極顯著提高紹興鴨血清中IgM 和IgA 的水平，但是對(duì)血清中IgG 含量的影響不大，但相比對(duì)照組有增加趨勢(shì)，在配合飼糧中添加量為200 mg/kg 效果較好。

3.3 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸短鏈脂肪酸含量的影響

腸道屏障是抵抗腸道中病原微生物和有毒有害氣體的第一道防線，對(duì)維持機(jī)體發(fā)揮正常功能至關(guān)重要。短鏈脂肪酸是腸道微生物代謝產(chǎn)物之一，對(duì)維持腸道健康發(fā)揮至關(guān)重要的作用[20]。短鏈脂肪酸是由腸道菌群通過(guò)糖酵解和磷酸戊糖途徑降解不易消化的膳食纖維產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸是由1～6 個(gè)碳原子的有機(jī)脂肪酸組成，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，其中乙酸是腸道中含量最豐富的短鏈脂肪酸[21-22]。若短鏈脂肪酸濃度過(guò)高可引起動(dòng)物食欲減退、免疫力降低，導(dǎo)致發(fā)生群體性呼吸道疾病，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致呼吸困難肺水腫和充血等癥狀[23]。本研究表明，飼糧中添加復(fù)合益生菌顯著增加腸道中乙酸的含量，其中復(fù)合益生菌添加100 mg/kg 時(shí)紹興鴨盲腸異戊酸含量較對(duì)照組差異顯著，且盲腸異戊酸較對(duì)照組含量降低50%。由此可見(jiàn)，飼糧中添加復(fù)合益生菌可增加盲腸乙酸含量而降低盲腸異戊酸的含量。

3.4 復(fù)合益生菌對(duì)紹興鴨盲腸微生物區(qū)系的影響

盲腸微生物群在動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能中起著關(guān)鍵作用，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，并有助于預(yù)防有害病原體的定植。大量研究表明，家禽盲腸中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)為高相對(duì)豐度菌門(mén)[24-26]，而本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相同。李寧等[27]研究表明，益生菌通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、抑制腸道內(nèi)有害細(xì)菌，增加有益菌從而穩(wěn)定腸道菌群。盲腸對(duì)動(dòng)物機(jī)體糖代謝和氮代謝起重要作用，食糜進(jìn)入盲腸可被腸道中的微生物吸收利用，其中發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(mén)具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收作用，厚壁菌門(mén)具有抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收作用，擬桿菌門(mén)降低或厚壁菌門(mén)增加都有助于脂肪的吸收和積累[28]，因此擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在盲腸門(mén)水平分析中占比較高。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)參與腸道中短鏈脂肪酸代謝，其中厚壁菌門(mén)參與丙酸和丁酸合成，而擬桿菌門(mén)主要參與丙酸合成[29]，進(jìn)而參與盲腸的代謝。張孟陽(yáng)等[30]研究表明，在56 日齡仔雞腸道中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（48.61%）和擬桿菌門(mén)（31.10%）。趙彥光等[31]研究表明，飼糧中添加復(fù)合益生菌極顯著提高門(mén)水平上擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度。本試驗(yàn)基于門(mén)水平研究結(jié)果表明，腸道菌群具有多樣性豐富的特點(diǎn)，擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)為兩個(gè)豐度最高的菌門(mén)，同時(shí)也是差異最大的菌門(mén)，與對(duì)照組相比各試驗(yàn)組擬桿菌門(mén)占比均高于對(duì)照組，厚壁菌門(mén)均低于對(duì)照組。郝永勝等[32]研究表明，擬桿菌屬是鴨盲腸主要菌屬，是短鏈脂肪酸主要生產(chǎn)者，主要影響盲腸菌群和盲腸發(fā)育?；趯偎降难芯拷Y(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)菌屬是擬桿菌屬，差異菌屬為瘤胃菌屬和拉氏鱗毛蕨屬，本試驗(yàn)研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相同。說(shuō)明添加復(fù)合益生菌對(duì)盲腸門(mén)水平和屬水平上的擬桿菌有增加作用。

4 結(jié)論

添加復(fù)合益生菌可降低紹興鴨的料重比，同時(shí)增加紹興鴨血清中IgM 和IgA 含量，且在配合飼料中添加量200 mg/kg 較好。添加復(fù)合益生菌可增加盲腸中乙酸含量，增加擬桿菌門(mén)和擬桿菌屬的相對(duì)豐度，同時(shí)降低厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，穩(wěn)定腸道菌群，且在配合飼糧中添加量100 mg/kg較好。