絲蘭提取物與日糧精粗比對體外發(fā)酵和甲烷產(chǎn)生量的交互影響

■ 包烏日漢 青 春 曲永利 王鵬宇 徐 明* 齊景偉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 014010；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點實驗室，黑龍江大慶 163319；3.內(nèi)蒙古優(yōu)然牧業(yè)有限責任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 015200）

家畜來源的溫室氣體產(chǎn)生與排放越來越受到全球重視。通過營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)實現(xiàn)反芻動物的低碳養(yǎng)殖，不僅符合我國國民經(jīng)濟和現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的方向，也契合我國降低甲烷產(chǎn)生的技術(shù)需求。畜牧業(yè)碳排放結(jié)構(gòu)主要包括：反芻動物排放氣體39%，飼料生產(chǎn)26%，飼養(yǎng)21%，其他14%。反芻動物甲烷排放量主要受日糧組成的影響，與纖維含量密切相關。當日糧中纖維含量增加時，纖維分解菌增殖，瘤胃為乙酸型發(fā)酵，產(chǎn)生大量氫氣，產(chǎn)甲烷菌增殖，甲烷產(chǎn)生量增加[1]。

絲蘭（Yucca schidigera）是龍舌蘭科絲蘭屬植物，主要分布于美國西南部和墨西哥北部的沙漠地區(qū)，在我國浙江、廣東、廣西等地有種植。絲蘭提取物是將絲蘭原木直接擠壓出汁液，蒸發(fā)濃縮后成為絲蘭提取液，或?qū)⒔n后的絲蘭原木干燥，再研磨成絲蘭提取粉[2]。在飼料中加絲蘭提取物時瘤胃內(nèi)的原蟲數(shù)量會降低，導致產(chǎn)甲烷菌數(shù)量下降，從而降低甲烷的產(chǎn)量[3-5]。絲蘭提取物中的皂苷通過抑制脲酶活性，降低尿素分解速率，影響微生物對非蛋白氮物質(zhì)的代謝，從而增加菌體蛋白的合成，減少氨氮排放[5]。Xu等[6]報道，絲蘭提取物可在各種粗飼料種類條件下降低體外甲烷產(chǎn)生量。試驗在此基礎上，進一步研究絲蘭提取物在不同日糧精粗比日糧條件下對甲烷產(chǎn)生量的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 添加劑

絲蘭提取物從Distributors Processing Inc.（Porterville, CA, USA）獲得。

1.2 試驗設計

試驗包含4個小試驗。試驗1、2、3的發(fā)酵底物分別是低精粗比日糧（精粗比為10∶90）、中精粗比日糧（精粗比為50∶50）和高精粗比日糧（精粗比為10∶90），在這些日糧中分別加入0、55、110、220、440 mg/kg 的絲蘭提取物，每個處理6 個重復。試驗4 的發(fā)酵底物同試驗1、2、3，為低（精粗比為10∶90）、中（精粗比為50∶50）和高（精粗比為10∶90）精粗比日糧，在這些日糧中分別加入0、110 mg/kg 的絲蘭提取物，研究日糧精粗比與絲蘭提取物的交互作用，共6 個處理，每個處理6 個重復。瘤胃瘺管供體牛的日糧組成見表1。

表1 瘤胃瘺管供體牛的日糧組成(干物質(zhì)基礎)

1.3 瘤胃液

瘤胃液從2 頭成年荷斯坦閹牛瘤胃獲得。供體牛日糧組成為70%苜蓿干草和30%精料補充料，配方及營養(yǎng)成分見表1。每天供應1.75 倍維持凈能需要量，在07：00 和17：00 等分為2 次飼喂。早飼2 h 后，分別從每只牛瘤胃取1 kg內(nèi)容物，混合均勻，5 min之內(nèi)帶到實驗室，厭氧攪拌，然后通過4 層紗布和玻璃棉過濾得到瘤胃液。

1.4 體外發(fā)酵

緩沖液配制參照Goering 等[7]和Van Soest 等[8]。瘤胃液（200 mL）和緩沖液（1 100 mL）在二氧化碳環(huán)境下混合加熱到39 ℃，制成發(fā)酵液。

發(fā) 酵 裝 置 選 用Ankom Technology（Macedon，NY，USA）生產(chǎn)的持續(xù)壓力記錄裝置。發(fā)酵瓶容積為260 mL，每個瓶內(nèi)加入0.6 g 飼料樣品。把50 mL發(fā)酵液加入到發(fā)酵瓶中，通入二氧化碳，在39 ℃下發(fā)酵24 h。

1.5 樣品的采集和分析

發(fā)酵瓶中壓力每5 min自動記錄一次。發(fā)酵24 h后，冷卻發(fā)酵瓶，取氣體樣品，用氣相色譜儀分析甲烷含量。測定發(fā)酵液pH，取1.5 mL液體，加入0.3 mL偏磷酸溶液（250 g/L），39 000 r/min 離心15 min，用氣相色譜儀分析揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量。

壓力數(shù)據(jù)用如下模型（Blümmel等[9]）模擬：

式中：P——壓力（Pa）；

k——氣體產(chǎn)生速率（/h）；

t——時間（h）；

l——延遲時間（h）。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù) 據(jù) 用GraphPad Prism 5（GraphPad Software,Inc., La Jolla, CA, USA）分析，得出參數(shù)。然后用標準大氣壓（101.325 kPa）校正實際大氣壓（96.538 kPa）。

試驗1、2、3 數(shù)據(jù)按單因素完全隨機試驗設計進行分析，選用SPSS 13.0 的GLM 模型，然后用Regression模型分析線性和二次顯著度。試驗4數(shù)據(jù)按兩因素試驗設計進行分析，包含日糧精粗比與絲蘭提取物的交互作用，選用SPSS 13.0 的GLM 模型。顯著度選用P<0.05，多重比較選用Duncan’s法。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲蘭提取物對低精粗比日糧體外發(fā)酵和甲烷產(chǎn)生量的影響

由表2 可知，絲蘭提取物對甲烷產(chǎn)生率的影響呈劑量依賴性，先降低后升高，110 mg/kg 絲蘭提取物對甲烷的抑制效果最好（P<0.05）。過量的絲蘭提取物（440 mg/kg）會降低氣體產(chǎn)生量、提高延遲時間、降低24 h 的壓力和產(chǎn)氣量（P<0.05）；最大壓力和最大產(chǎn)氣量表明，過量的絲蘭提取物對發(fā)酵產(chǎn)生負面影響（P<0.05）。絲蘭提取物不影響發(fā)酵液pH、降解速率和VFA的組成及產(chǎn)量（P>0.05）。

表2 絲蘭提取物對高精料日糧體外發(fā)酵和產(chǎn)氣的影響

2.2 絲蘭提取物對中精粗比日糧體外發(fā)酵和甲烷產(chǎn)生量的影響

由表3 可知，絲蘭提取物對甲烷產(chǎn)生量的影響呈劑量依賴性，先降低后升高，55～440 mg/kg 絲蘭提取物對甲烷均有抑制效果。過量的絲蘭提取物（440 mg/kg）會顯著降低24 h 產(chǎn)氣量和最大產(chǎn)氣量（P<0.05）。說明過量的絲蘭提取物對發(fā)酵產(chǎn)生負面影響。絲蘭提取物不影響發(fā)酵液pH、VFA 的組成（除異丁酸外）及產(chǎn)量（P>0.05）。

表3 絲蘭提取物對中等精料日糧體外發(fā)酵和產(chǎn)氣的影響

2.3 絲蘭提取物對精粗比日糧體外發(fā)酵和甲烷產(chǎn)生量的影響

由表4 可知，絲蘭提取物對甲烷產(chǎn)生量的影響呈劑量依賴性，先降低后升高，110 mg/kg 絲蘭提取物對甲烷均有顯著的抑制效果（P<0.05）。絲蘭提取物對24 h 壓力和產(chǎn)氣量及延長時間的影響呈劑量依賴性，先降低后升高。過量的絲蘭提取物（440 mg/kg）會降低氣體產(chǎn)生量（P<0.05）。除戊酸和乙酸外，絲蘭提取物不影響發(fā)酵液pH 和VFA 的組成及產(chǎn)量（P>0.05）。

表4 絲蘭提取物對低精料日糧體外發(fā)酵和產(chǎn)氣的影響

2.4 絲蘭提取物與日糧精粗比對體外發(fā)酵和甲烷產(chǎn)生量的交互影響

由表5可知，110 mg/kg絲蘭提取物對甲烷有顯著的抑制作用（P<0.05）。不同精粗比對發(fā)酵液pH、24 h的壓力和24 h產(chǎn)氣量、最大壓力、最大產(chǎn)氣量、降解速率、延長時間和VFA 有顯著影響（P<0.05）。絲蘭提取物與日糧精粗比對甲烷均有顯著的抑制作用（P<0.05），二者之間沒有交互作用（P>0.10）。

表5 絲蘭提取物與日糧精粗比類型對體外產(chǎn)氣和發(fā)酵的影響

3 討論

3.1 絲蘭提取物對瘤胃發(fā)酵和甲烷產(chǎn)生量的影響

絲蘭提取物中的皂苷通過抑制脲酶活性，降低尿素分解速率，影響微生物對非蛋白氮物質(zhì)的代謝，從而增加菌體蛋白的合成，可以減少甲烷排放[10]。Ridla等[11]報道，皂苷可減少反芻動物體內(nèi)腸道甲烷的排放，并提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，但是添加水平不能超過0.5%。在適當?shù)膭┝肯拢碥湛梢砸种圃鷦游锏臄?shù)量[12]。研究表明，絲蘭皂苷能有效抑制瘤胃甲烷和氨氣產(chǎn)量[13-14]。添加5.0 g/kg 的絲蘭植物粉末可降低體外發(fā)酵甲烷產(chǎn)量和氨氮含量,但對飼糧瘤胃降解有抑制作用[15-17]。絲蘭可以減少甲烷排放，降低N2O及尿氮和糞氮的排放量。

Goodall 等[18]報道,日糧中添加絲蘭皂苷能顯著增加丙酸的比例,不影響總揮發(fā)性脂肪酸。馮志華[19]研究皂苷對奶牛瘤胃發(fā)酵、甲烷產(chǎn)量、營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝及其抗氧化能力和免疫功能的影響，結(jié)果顯示，添加皂苷對pH 和VFA 濃度無顯著影響；隨著皂苷添加水平的升高，甲烷排放量線性降低。Lila等[20]在不同培養(yǎng)底物添加不同濃度的絲蘭皂苷（1.2、1.8、2.4、3.2 g/L）進行體外試驗,結(jié)果表明,甲烷產(chǎn)量隨著絲蘭皂苷劑量增加而線性降低。本試驗中絲蘭提取物的添加對pH 和VFA 濃度無顯著影響，隨著添加水平的升高，體外甲烷排放量呈線性降低。Pen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，絲蘭皂苷使總揮發(fā)性脂肪酸濃度下降，Lovett 等[22]也得到相同結(jié)果。絲蘭皂苷對瘤胃VFA 的影響,目前沒有統(tǒng)一的結(jié)果，可能是由于體內(nèi)體外試驗差異造成的；或者可能與絲蘭皂苷添加量及日糧精粗比有關系[23]。宋坤烊[24]研究不同添加水平的6 種植物提取物對肉羊瘤胃發(fā)酵特性、甲烷產(chǎn)量和總產(chǎn)氣量的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，絲蘭皂苷組的pH 和總產(chǎn)氣量差異不顯著，與本試驗結(jié)果一致。

3.2 精粗比對瘤胃發(fā)酵和甲烷產(chǎn)生量的影響

影響反芻動物瘤胃發(fā)酵的因素有飼料營養(yǎng)成分、飼料加工貯存和日糧精粗比等。日糧在瘤胃中的發(fā)酵程度主要取決于能迅速水解的碳水化合物的數(shù)量，特別是糖和淀粉的含量[25]。因此改變?nèi)占Z中的精粗比，會使纖維性和非纖維性碳水化合物的比例發(fā)生變化，從而顯著地影響瘤胃發(fā)酵[26]。

VFA 是日糧中的碳水化合物在瘤胃內(nèi)發(fā)酵的終產(chǎn)物,也是反芻動物維持生命活動及生產(chǎn)所需能量的主要來源[27]。多項研究表明，日糧精粗比例不同，乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量不同，從而影響瘤胃甲烷產(chǎn)量[28-30]。Mc Allan 等[31]的試驗表明，奶牛高精料水平日糧會顯著降低瘤胃pH 和乙酸濃度，增加丙酸濃度，但不影響總VFA 濃度。Merchen 等[32]用高粗料和高精料日糧飼喂羯羊進行對比試驗，結(jié)果表明瘤胃內(nèi)TVFA 濃度不受影響；喂高精料日糧時乙酸和丁酸的濃度顯著降低，丙酸濃度顯著升高。這些結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。

隨精料比例增加,pH 顯著降低，總TVFA 不受影響或略有降低[26，33-34]。據(jù)報道，對日本黑牛育肥階段進行研究，結(jié)果表明，增加精料比例會導致瘤胃pH降低。本試驗中，發(fā)酵底物為高精粗比組與中精粗比組和低精粗比組相比，發(fā)酵pH 降低，這跟前人的研究結(jié)果一致。由于日糧中精料比例增加會影響反芻動物日糧纖維比例，使日糧中纖維比例下降，縮短咀嚼和反芻時間，使反芻動物采食時口腔唾液分泌量減少，導致進入瘤胃的唾液含量減少，緩沖pH 的能力降低，瘤胃pH 進一步降低。提高日糧精料比例可以顯著降低瘤胃pH，主要是由淀粉攝入量增加導致的[37]。

3.3 絲蘭提取物與精粗比對甲烷產(chǎn)生率的交互影響

適當增加日糧精粗比能夠顯著降低反芻動物甲烷排放量[38-40]。王洪榮等[41]在不同精粗比日糧中添加0.3%茶皂素和0.03%絲蘭皂苷的混合物，研究不同精粗比以及皂苷條件下對瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物的影響。結(jié)果顯示，茶皂苷和絲蘭皂苷的混合物能降低瘤胃pH，并且精粗比為20∶80 時差異極顯著[41]。

Erydvuz 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，偏精料日糧條件下，絲蘭提取物對纖維分解菌沒有抑制作用，因此對甲烷產(chǎn)量沒有顯著抑制作用；然而在以采食草或者草-豆科為主的綿羊日糧中添加絲蘭提取物可以降低甲烷的產(chǎn)量。李國祥等[43]研究表明，在偏精型日糧條件下，添加10 mg/g 絲蘭提取物對瘤胃發(fā)酵參數(shù)及甲烷產(chǎn)量、抑制原蟲活性及抑制甲烷菌效果最佳。本試驗結(jié)果顯示，110 mg/kg 絲蘭提取物對甲烷均有顯著的抑制效果。陳旭偉[26]研究發(fā)現(xiàn)，體外48 h 累計產(chǎn)氣量時皂苷與精粗比之間存在交互作用。本研究結(jié)果顯示，絲蘭提取物與精粗比間無交互作用。絲蘭提取物在不同精粗比日糧下，對甲烷產(chǎn)生的抑制效果存在差異，精料比例高時甲烷產(chǎn)量會升高，同時抑制劑對甲烷產(chǎn)生的抑制效果會更明顯；而絲蘭提取物的最適添加量也因日糧精粗比例不同而顯出差異[43]。本研究假設，精粗比影響最適絲蘭提取物添加量。而結(jié)果顯示，無論是粗飼料發(fā)酵底物，還是中等精料、高精料發(fā)酵底物，絲蘭提取物對甲烷產(chǎn)生率的影響均呈先降低后升高的趨勢，110 mg/kg 絲蘭提取物對甲烷的抑制效果最好。以前的研究顯示，絲蘭提取物主要通過改變瘤胃微生物區(qū)系，進而影響甲烷產(chǎn)生率[3，44]。絲蘭提取物不是通過直接接收或影響氫產(chǎn)量的方式降低甲烷產(chǎn)生率，這是二者之間無交互作用的原因。

4 結(jié)論

在低、中和高精粗比日糧為發(fā)酵底物條件下，絲蘭提取物對體外甲烷產(chǎn)生量均有顯著抑制作用，呈劑量依賴性關系，最佳劑量均為110 mg/kg。