基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討浙貝母-夏枯草藥對治療甲狀腺結(jié)節(jié)的作用機制*

王國慶,劉偉,黃菲

1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210023; 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 蘇州 215000

甲狀腺結(jié)節(jié)是甲狀腺內(nèi)單個或多個組織的離散病變,隨著放射學(xué)技術(shù)的不斷進步,結(jié)節(jié)的診斷在臨床實踐中越來越普遍[1]。目前,西醫(yī)治療甲狀腺結(jié)節(jié)通常為隨訪觀察、左甲狀腺素抑制治療或熱消融及手術(shù)治療,有一定療效,但患者依從性較低,適用范圍局限,不良反應(yīng)較大[2]。基于關(guān)聯(lián)規(guī)則和因子分析,一項治療甲狀腺結(jié)節(jié)中藥組方規(guī)律的研究顯示,浙貝母、夏枯草兩味藥為治療癭病的最常用藥對[3]。浙貝母-夏枯草是消腫散結(jié)的經(jīng)典組合,也是中醫(yī)治療甲狀腺結(jié)節(jié)臨床用藥的常用配伍。浙貝母味苦,性寒;夏枯草味辛、苦,性寒。現(xiàn)代藥理研究顯示,浙貝母、夏枯草在抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面作用顯著,臨床應(yīng)用甚廣[4-5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)集多種學(xué)科于一身,分析“疾病-靶點-藥物”之間的關(guān)聯(lián),明確中藥生物活性成分及作用機制,為疾病的現(xiàn)代中醫(yī)診療提供新思路[6]。本實驗利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的作用機制,為其臨床應(yīng)用提供證據(jù)和支持。

1 資料與方法

1.1 浙貝母、夏枯草相關(guān)靶點篩選以浙貝母、夏枯草為關(guān)鍵詞,在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)[7]檢索其所有化學(xué)成分。然后以口服生物利用度(oral bioavailability,OB) ≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18進行篩選,將篩選后的活性成分保存為mol2類型文件,導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫平臺(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper),獲得篩選后化學(xué)成分的靶點蛋白,再使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)[8]將活性成分蛋白質(zhì)靶點名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將“浙貝母-夏枯草”藥對的有效活性成分及相關(guān)靶點上傳至Cytoscape 3.7.1(http://www.Cyto-scape.org/)構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 甲狀腺結(jié)節(jié)靶點獲取基于Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)[9]、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org)、治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database,TTD,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[10]等,搜索關(guān)鍵詞“thyroid nodules”,獲得甲狀腺結(jié)節(jié)相關(guān)靶點。在Genecards數(shù)據(jù)庫中,Score值的高低預(yù)示靶點與疾病的密切程度,根據(jù)經(jīng)驗,運用二倍中位數(shù)法篩選出疾病的潛在靶點[11]。合并上述數(shù)據(jù)庫篩選得到的靶點后校正去重。

1.4 藥物-疾病共有靶點篩選、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI)構(gòu)建將藥物有效成分相關(guān)靶點與疾病靶點導(dǎo)入韋恩圖網(wǎng)站進行在線分析,獲得交集靶點并利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)[12]構(gòu)建PPI模型,將其以TSV文件導(dǎo)出,再導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),利用CytoHubba插件篩選Degree值較高的靶點,從而預(yù)測浙貝母-夏枯草藥對治療甲狀腺結(jié)節(jié)的重要潛在靶點。

1.5 “藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將藥物及其活性成分、交集靶點及疾病導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1軟件繪制成“藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,進一步探究浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的作用機制。

1.6 富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫[13]對交集靶點進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,對關(guān)鍵靶點基因進行功能注釋并預(yù)測基因富集途徑,然后通過微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)分析結(jié)果并繪制氣泡圖。

1.7 分子對接在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白結(jié)構(gòu),采用AutoDock軟件進行分子對接驗證,去水、加氫、計算電荷。使用Lamarckian 遺傳算法進行分子對接計算,獲取關(guān)鍵靶點與活性成分的結(jié)合能并評估最終對接結(jié)構(gòu)。通過 Pymol 2.4軟件制作兩者結(jié)合模式圖對對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 浙貝母、夏枯草活性成分靶點篩選通過TCMSP平臺檢索,并以O(shè)B ≥30%、DL≥0.18為條件篩選后獲得浙貝母活性成分7個、夏枯草活性成分11個,其中 β-谷甾醇是兩者共有活性成分。將無對應(yīng)靶點信息的活性成分Ziebeimine和Chaksine剔除,最終得到符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分15個。經(jīng)數(shù)據(jù)匹配得到其對應(yīng)作用靶點402個,合并后去重共得到171個作用靶點,見表1。

表1 浙貝母-夏枯草活性成分信息表

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape軟件將篩選出的15個活性成分與171個相關(guān)靶點構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)包括187個節(jié)點及419條邊,其中“V形”代表藥物,ZBM為浙貝母,XKC為夏枯草,菱形代表活性成分,圓形代表作用靶點,見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.3 浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的靶點預(yù)測從Genecards數(shù)據(jù)庫獲得甲狀腺結(jié)節(jié)靶點2954個。檢索Genecards數(shù)據(jù)庫得到疾病相關(guān)靶點Score最大值為118.72,最小值為0.18,中位數(shù)為2.16,故設(shè)定 Score>2.16的靶點為疾病潛在靶點。綜合各數(shù)據(jù)庫靶點信息,去重后最終得到 1 563個疾病相關(guān)靶點。經(jīng)韋恩圖網(wǎng)站在線分析后得到可能與浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)相關(guān)的靶點108個,見圖2。

圖2 浙貝母-夏枯草活性成分相關(guān)靶點與疾病靶點韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)把交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫后得到PPI網(wǎng)絡(luò)模型,導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)有108個節(jié)點,411條邊,平均節(jié)點度值為7.61,見圖3。使用CytoHubba插件,提取Degree值前10位的核心靶點,分別為AKT1、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、重組V-Rel網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A(recombinant V-rel reticuloendothelial proliferation virus oncogene homolog A,RELA)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、雌激素受體 1(estrogen receptor 1,ESR1)、MAPK8、類視黃醇X受體alpha(retinol like X receptor alpha,RXRA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR),見圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

注:顏色越紅代表Degree值越大。圖4 核心靶點PPI分析圖

2.5 “藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)把浙貝母與夏枯草的活性成分及2.3項中得到的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件繪制“藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖5。

圖5 “藥物-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO和KEGG分析結(jié)果使用Metascape平臺對108個交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析,以P<0.01為篩選條件,GO富集分析顯示靶點富集在1 956個條目上,其中生物過程(biological process,BP)1 705條,主要包括對激素的應(yīng)答(response to hormone)、細胞對有機環(huán)狀化合物的應(yīng)答(cellular response to organic cyclic compound)、細胞對脂質(zhì)的應(yīng)答(cellular reponse to lipid)等;分子功能(molecular function,MF)136條,主要涉及蛋白質(zhì)同源二聚體活性(protein homodimerization activity)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-transcription factor binding)、激酶結(jié)合(kinase binding)等;細胞組分(cellular component,CC)115條,主要涉及膜筏(membrane raft)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)、突觸后膜(postsynaptic membrane)、突觸膜(synaptic membrane)等。KEGG通路富集分析共獲得202個信號通路,主要涉及TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycation end products-glycation end product receptors,AGE-RAGE)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-AKT(phosphatidylinositol-3-kinase-AKT,PI3K-AKT)信號通路等,將前20條通路結(jié)果繪制成氣泡圖,見圖6。

注:A:GO-BP分析;B:GO-MF分析;C:GO-CC分析;D:KEGG分析。圖6 GO富集分析和KEGG通路分析

2.7 分子對接選擇Degree值排名前3位的靶蛋白(AKT1、TP53、MAPK1)與“藥物-成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)對應(yīng)的度值前3位的有效成分(槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚)進行分子對接,最終得到9組對接結(jié)果,見表3。作為評價受體與配體結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)之一,結(jié)合自由能<-5.0 kJ·mol-1時,表示兩者對接良好,且結(jié)合自由能越低表明兩者結(jié)合能力越強。結(jié)果表明,槲皮素與AKT1有較強結(jié)合能力;β-谷甾醇與MAPK1有較強結(jié)合能力;山柰酚與AKT1有較強結(jié)合能力?？梢暬Y(jié)果見圖7。

圖7 分子對接可視化結(jié)果圖

表3 活性成分與核心靶點分子對接結(jié)合自由能

3 討論

甲狀腺結(jié)節(jié)屬中醫(yī)“癭病”“癭瘤”等范疇,由氣血痰瘀凝結(jié)于頸前而成。初起多由正氣虛弱,邪氣外侵,內(nèi)外相合;繼而邪氣壅于三焦,氣化不利而生郁熱、痰濕、瘀血,日久結(jié)聚于頸部經(jīng)絡(luò),遷延難愈。在病機演變過程中,氣血郁結(jié)于三焦為核心病機,故軟堅散結(jié)為治療之要。除活血、化痰、清熱之外,需酌加散結(jié)之品,以增強散癭之功[14]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為,甲狀腺結(jié)節(jié)是由各種原因引起的局部甲狀腺組織異常增長的散在病變[15],由于臨床表現(xiàn)常不明顯,多被患者忽略,其中大多為囊性或囊實性良性結(jié)節(jié),需穿刺明確病理的惡性結(jié)節(jié)檢出率相對較低,約為7%～15%。當(dāng)前甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)病機制多考慮與遺傳、電離輻射、心理社會因素、攝碘量、環(huán)境污染等因素有關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥在治療甲狀腺結(jié)節(jié)方面療效明確,不但可以顯著緩解頸部不適癥狀,而且在縮小結(jié)節(jié)大小方面有其獨特優(yōu)勢[17]。

本研究從“浙貝母-夏枯草”中挖掘出活性成分15個,活性成分作用靶點171個。通過分析“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),推測“浙貝母-夏枯草”藥對治療甲狀腺結(jié)節(jié)的主要活性成分可能是以下3個,分別是槲皮素、β-谷甾醇和山柰酚,其中β-谷甾醇是浙貝母和夏枯草的共有活性成分。研究表明,槲皮素是夏枯草的主要有效成分,具有抑制甲狀腺特異性基因促甲狀腺激素受體(thyrotropin receptor,TSHR)、甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)等表達的抗甲狀腺作用,還具有和其他類黃酮相同的治療特性,如誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡以及抗病毒、抗氧化、抗炎和抗增殖活性等[18-19]。β-谷甾醇對腫瘤細胞具有抑制作用。林明珠等[20]建立了H22荷瘤小鼠模型發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇可能通過調(diào)控IL-6、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達抑制腫瘤生長。山柰酚是一種膳食類黃酮,對原發(fā)性腫瘤生長的抑制作用已被廣泛研究,通過抑制活性氧-蛋白精氨酸脫亞胺酶4(reactive oxygen species-protein arginine deiminase 4,ROS-PAD4)通路阻斷中性粒細胞胞外陷阱形成并減少腫瘤轉(zhuǎn)移,對于甲狀腺惡性結(jié)節(jié)有較好的抑制作用[21]。由此推測,上述3個藥物成分可能是浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的重要活性成分,其通過抗增殖活性和激活細胞凋亡、抑制細胞存活發(fā)揮治療作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出AKT1和TP53為核心靶點。AKT代表一個由三種蛋白質(zhì)組成的家族,即AKT1、AKT2和AKT3,通過磷脂酰肌醇3-激酶途徑被多種生長因子激活,并通過抑制凋亡和介導(dǎo)細胞增殖在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用[22]。在正常甲狀腺中,三種AKT亞型均表達,但在mRNA和蛋白質(zhì)水平上,AKT1是主要表達亞型。與正常組織相比,AKT1也是甲狀腺癌中AKT主要過度表達和過度激活的一種亞型。有學(xué)者認為,這種亞型的激活與濾泡癌和乳頭狀癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),AKT1缺失可延緩PVPV小鼠甲狀腺癌的形成,并在體內(nèi)15個月內(nèi)減少血管侵襲[23]。TP53作為人類基因組的重要保障,可以抵抗基因毒性應(yīng)激,在甲狀腺癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。該基因生物學(xué)作用是調(diào)控細胞周期,允許修復(fù)DNA損傷或發(fā)生凋亡。當(dāng)DNA損傷時,p53蛋白使細胞周期受到抑制,允許DNA修復(fù);當(dāng)DNA修復(fù)失敗時,p53則通過激活轉(zhuǎn)錄靶點的表達引發(fā)細胞凋亡,阻止腫瘤進一步發(fā)生發(fā)展[24]。

KEGG通路富集分析推測“浙貝母-夏枯草”藥對主要通過調(diào)控信號通路的激活或抑制來發(fā)揮維持細胞穩(wěn)態(tài)、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多重作用,如TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路等途徑。TNF信號通路:TNF-α 是在慢性炎癥和免疫反應(yīng)過程中釋放的一種細胞因子,在促進細胞生長、分化、凋亡和腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中獲得纖維特征,增強穿過血管基底膜或淋巴管的活性,提升腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,而TNF-α是促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的炎癥介質(zhì)之一[25]。研究表明,低濃度的 TNF-α 可以在不同的甲狀腺乳頭狀癌細胞中通過Twist1表達誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,激活間充質(zhì)特異性基因,促進甲狀腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[26]。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路:AGEs與RAGE相互作用可引起持續(xù)而強烈的細胞反應(yīng),誘導(dǎo)細胞級聯(lián)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致各種病理狀況發(fā)生[27]。炎癥相關(guān)過程可促進蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)糖基化,從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化,改變這些化合物的生物學(xué)功能并促進與甲狀腺癌發(fā)病率相關(guān)的基因突變。值得注意的是,RAGE及其配體和參與糖基化的化合物可以作為甲狀腺癌治療的潛在目標(biāo)靶點進行研究,因為其中一些已被證明會影響甲狀腺癌的侵襲性。miR-221和miR-222在甲狀腺乳頭狀癌中過度表達,而抗RAGE抗體在下調(diào)miR-221和miR-222表達方面可能有效,在抑制甲狀腺乳頭狀癌方面有一定的作用[28]。PI3K-AKT信號通路:研究報道顯示,PI3K-AKT通路參與甲狀腺腫瘤發(fā)生和進展,在細胞增殖和血管生成中起著關(guān)鍵作用,其主要通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) 響應(yīng)各種下游信號,調(diào)節(jié)細胞過程[29]。該mTOR通路可通過激活P70S6激酶和抑制4EBP1來調(diào)節(jié)生物進程發(fā)生,進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成和核糖體結(jié)合發(fā)生的增加。一項小鼠模型研究證明,盡管甲狀腺癌的發(fā)生不受PI3K-AKT-mTOR通路抑制的影響,但癌癥的生長速度降低,從而延長了小鼠的壽命。研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺乳頭狀癌樣本中mTOR表達升高,這表明靶向mTOR活性似乎是治療甲狀腺乳頭狀癌有效的治療策略,提示該信號通路在甲狀腺腫瘤發(fā)生中的作用是值得肯定的[30]。最后,對AKT1、TP53、MAPK1 3個關(guān)鍵靶點與槲皮素、β-谷甾醇和山柰酚3個有效活性成分進行分子對接驗證,結(jié)果顯示均對接良好,有較強結(jié)合能,進一步證實了浙貝母-夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的可能性。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索了浙貝母-夏枯草對甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)揮治療作用的有效化合物、靶點及通路,發(fā)現(xiàn)浙貝母-夏枯草的活性成分可能通過調(diào)節(jié)AKT1、TP53、MAPK1等蛋白,作用于TNF、PI3K-AKT、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE等信號通路,抑制甲狀腺腫瘤細胞增殖及維持細胞穩(wěn)態(tài)。但未考慮中藥在煎煮時發(fā)生的復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)以及相應(yīng)活性成分在體內(nèi)的代謝吸收,需進一步采用動物或細胞實驗進行驗證,以提供更有力的科學(xué)依據(jù)。