榿木Genomic-SSR 與EST-SSR 分子標(biāo)記的差異分析

王澤亮 ,楊勇智,杜晉城,陳炙,黃振,郭洪英,2

1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院,四川 成都,610081；2.四川省草原科學(xué)研究院,四川 成都, 611731

榿木屬（AlnusMill.）為非豆科固氮樹種，根系富含根瘤，可改良土壤，是重要的先鋒造林與生態(tài)功能樹種。榿木屬是現(xiàn)存樺木科植物中最原始的屬，也是北半球新生代植物區(qū)系的重要植物類群，主要分布在歐亞和北美，拉丁美洲與非洲有少量分布[1-2]。四川省及鄰近地區(qū)是榿木屬的重要分布區(qū)，原生分布有榿木（Alnus cremastogyne,又名四川榿木）、川滇榿木（A.ferdinandi-coburgii）、毛榿木（A.lanata）、尼泊爾榿木（A.nepalensis），可能是榿木屬植物起源與分化的中心[1]，其中榿木是我國最重要的一個特有種，也是研究最廣泛的一個種，生長迅速、適應(yīng)性強、童期短且結(jié)實量大，目前其適生栽培區(qū)域已擴大至長江中下游地區(qū)，是中國長江流域退耕還林工程、生態(tài)建設(shè)工程和混交造林的重要樹種。

SSR（Simple sequence repeat，簡單序列重復(fù)）分子標(biāo)記具有分布廣泛、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定、共顯性等特點，自從被開發(fā)以來，在物種遺傳改良上獲得了廣泛的應(yīng)用。在榿木屬植物SSR 研究方面，Zhuk 等最早開發(fā)出了榿木SSR 引物[3]。隨后，Lance等通過篩選海岸榿木（A.maritima）基因組文庫獲得了19 條榿木SSR 引物[4]。使用Lance 開發(fā)的引物，Jones 等人系統(tǒng)研究了美國瀕危物種海岸榿木的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)等，為其提供了的瀕危保護理論基礎(chǔ)[5,6]。隨后SSR 技術(shù)逐漸的應(yīng)用到其他榿木屬樹種中，這些樹種的群體遺傳變異基礎(chǔ)與進化史也逐漸被深入揭示[7-10]。目前國內(nèi)榿木遺傳改良研究主要集中于育苗、栽培等常規(guī)育種方面，在群體遺傳變異研究上，主要通過表型鑒定方法進行[11-14]，采用分子標(biāo)記手段的研究較少，僅有卓仁英等建立了RAPD 體系[15]。在SSR 分子標(biāo)記方面，也僅有饒龍兵等基于榿木、歐洲榿木（A.glutinosa）、硬榿木（A.firma）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了適用于榿木屬的SSR標(biāo)記[16]。總之榿木群體遺傳變異缺乏分子水平上的數(shù)據(jù)支撐，影響了其保護與進一步的推廣利用。

此外，SSR 分子標(biāo)記從來源上說包括Genomic-SSR 與EST-SSR，分別來源于基因組數(shù)據(jù)與表達序列標(biāo)簽（Express sequence tags，EST）數(shù)據(jù)。本研究分析了2 種來源的榿木SSR 標(biāo)記的差異，以期推動其在國內(nèi)榿木遺傳變異研究上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采樣群體為天然次生林，共包括13 個群體（表1）。群體范圍包括成都平原區(qū)、盆周山地區(qū)、盆地丘陵區(qū)、川西高山峽谷區(qū)和川西南山地區(qū)。群體取樣單株之間相距至少50m，采集榿木新鮮葉片，硅膠干燥保存帶回實驗室。

表1 榿木群體基本信息Tab.1 Location and number of trees sampled in 13 Alnus Cremastogyne populations

1.2 DNA 提取與PCR 擴增

使用天根植物基因組提取試劑盒DNA（DP305）提取基因組DNA。

SSR 擴增所用引物來源于2 部分：（1）Genomic-SSR，公開發(fā)表文獻中其它榿木屬樹種相關(guān)研究中使用的SSR 引物[3-4,17-18]，10 對引物；（2）EST-SSR[19]，6 對引物。具體信息見表2。

表2 榿木10 個Genomic-SSR 與6 個EST-SSR 標(biāo)記遺傳參數(shù)Tab.2 Genetic diversity of 164 trees in A.cremastogyne revealed by 10 Genomic-SSRs and 6 EST-SSRs

SSR 上游引物添加FAM 熒光標(biāo)記。PCR 擴增使用Takara Taq 聚合酶(Takara,Dalian,China)，20 uL反應(yīng)體系包括：13.85 μL ddH2O,2.0 μL 10 × buffer,2.0 μL 2.0 mM dNTP,0.5 μL of each primer (at 10 μM),1 μL 基因組DNA 模版（30-50ng），and 0.75 U Taq DNA 聚合酶。擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，退火溫度退火20 s，72 ℃延伸40 s，25-30 個循環(huán)；72 ℃延長5 min，4 ℃保存。退火溫度根據(jù)文獻或引物設(shè)計軟件給出的數(shù)據(jù)。PCR 產(chǎn)物進行毛細管熒光電泳分型，SSR 片段長度由軟件GeneMarker version 2.2.0 (SoftGenetics,USA)判讀。

1.3 SSR 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

首先利用Excel2007 整理整合GeneMarker 輸出的基因型分子量數(shù)據(jù)，隨后數(shù)據(jù)輸入基于R 環(huán)境的Polysat 1.6 軟件[20]，整合相關(guān)信息后，最后輸出為GenoDive 格式文件進行進一步分析。利用GenoDive 2.0b27[21]計算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、總望雜合度（Ht）、固定系數(shù)（Gst，同F(xiàn)st）等遺傳參數(shù)，評價各群體的遺傳多樣性水平?；蛄髦担∟m）根據(jù)公式（1-GST）/（4GST）估算[22]。

利用GenoDive 2.0b27 計算Nei’s（1978）遺傳距離，運用NTSYS-pc 2.10s 軟件生成UPGMA 聚類圖并計算各遺傳距離的相關(guān)系數(shù)[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 榿木Genomic-SSR 與EST-SSR 多態(tài)性比較

利用10 個Genomic-SSR 位點與6 個EST-SSR個位點檢測了13 個榿木群體164 個個體的遺傳多樣性參數(shù)，16 個位點全部具有多態(tài)性。進一步分析結(jié)果表明（表2），在10 個Genomic-SSR 位點中，平均等位基因數(shù)為13.10，平均有效等位基因數(shù)為3.779，平均觀察雜合度為0.849，平均期望雜合度為0.754；對EST-SSR 來說，平均等位基因數(shù)為13.33，平均有效等位基因數(shù)為4.033，平均觀察雜合度為0.768，平均期望雜合度為0.643。平均等位基因數(shù)EST-SSR 位點高于Genomic-SSR 位點，而對檢測的雜合度來說，Genomic-SSR 位點高于EST-SSR 位點。就單個位點而言，揭示遺傳多性度最高的為EST-SSR 位點Ace29，其等位基因數(shù)達到27，有效等位基因數(shù)為8.467，觀察雜合度為0.994。在10 個基因組SSR 位點中，等位基因數(shù)≥20 的位點有2 個，在10 與20 之間的位點有4 個，10 以下的位點有4 個；而6 個EST-SSR 位點中，有1 個超過20，在10（包括等于）與20 之間的位點有4 個，10 以下的位點有1 個。

針對13 個榿木群體來說，除了平均有效等位基因數(shù) EST-SSR 位點高于 Genomic-SSR（4.251>3.941）之外，其余3 個遺傳參數(shù)（平均等位基因數(shù)、觀察雜合度、期望雜合度）Genomic-SSR 位點均高于EST-SSR。對于具體群體來說，Genomic-SSR 與EST-SSR 位點分析均顯示F（冕寧）群體遺傳多樣性水平最高，但是Genomic-SSR 位點顯示I（平武、Ne 值最?。?、J（青川、Na 與Ho 值最?。（宣漢、Ht 值最小）群體遺傳多樣性水平最低，EST-SSR 位點顯示I（平武、Na、Ne、Ho 值最?。?、U（沐川、Ht 值最小）群體遺傳多樣性水平最低。

2.2 聚類分析

為確定兩種標(biāo)記對榿木群體遺傳關(guān)系的鑒定準(zhǔn)確度，本研究基于Nei’s 遺傳距離使用UPGMA 方法對參試材料進行聚類分析，由圖1（A、B）可知，Genomic-SSR 與EST-SSR 均將AA 與F 群體歸為1 類，進一步Genomic-SSR 標(biāo)記將其余群體歸為3 類：AC、B；I、S、T、V；J、Q、U、K、N，而EST-SSR 劃分的3 類為：AC；B、T；I、J、K、N、Q、U、V、S。說明在大的區(qū)域分類上，Genomic-SSR 與EST-SSR 相一致，而在小的分類上有差異。

圖1 基于Nei’s 遺傳距離的榿木群體UPGMA 聚類Fig.1 Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis of 13 A.cremastogyne populations based on Nei’s genetic distance (A:Genomic-SSR;B:EST-SSR;C:Genomic-SSR+EST-SSR)

基于Genomic-SSR 與EST-SSR 總的16 個標(biāo)記的Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 聚類樹顯示榿木群體可明顯地分為4 個類群（AA 與F、B、I、其它）（圖1 C），與Genomic-SSR 標(biāo)記結(jié)果更為相似，說明本研究中Genomic-SSR 更能精確地鑒別出榿木群體遺傳關(guān)系。

對 Genomic-SSR、EST-SSR 以及 Genomic-SSR+EST-SSR 計算出的遺傳距離進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示（表3）：3 部分相關(guān)系數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），但是Genomic-SSR 與Genomic-SSR+EST-SSR 相關(guān)系數(shù)稍高，即兩種標(biāo)記計算的綜合相關(guān)系數(shù)與Genomic-SSR 標(biāo)記更為相似，表明本研究中Genomic-SSR 能更準(zhǔn)確地揭示不同榿木個體間的遺傳關(guān)系，與上述聚類分析結(jié)果相一致。

3 討論

3.1 榿木倍性

在相關(guān)研究中，歐洲榿木是被作為二倍體樹種進行研究的，隨后Lepais 等[7]與Mandák 等[25]在非洲與歐洲分別發(fā)現(xiàn)了四倍體群體（2n=4x=56）。在染色體水平上，任保青等[26]與楊漢波等[27]通過核型研究發(fā)現(xiàn)榿木染色體數(shù)為56，根據(jù)洪德元提到榿木屬的染色體基數(shù)為x=14[28]，或Murai 認為的X=7[29]，則榿木可能是四倍體或八倍體。而核型分析顯示榿木染色體結(jié)構(gòu)相同的染色體對數(shù)多數(shù)為2 對[27]，表明榿木可能正在進行或接近完成二倍體化。由于本研究種榿木SSR 分型數(shù)據(jù)表現(xiàn)出了四倍體特性，因此本研究以多倍體分析軟件Polysat、Genodive 為基礎(chǔ)[20,21]，結(jié)合NTSYS 軟件進行了榿木群體遺傳參數(shù)估算與分析。

3.2 榿木Genomic-SSR 與EST-SSR 差異比較

本研究對兩種來源SSR 標(biāo)記的遺傳差異進行了比較分析，結(jié)果顯示：平均等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)EST-SSR 標(biāo)記高于Genomic-SSR 標(biāo)記，而兩種雜合度Genomic-SSR 位點高于EST-SSR 位點，與前人研究結(jié)果均不完全一致。如在宋躍朋等與劉果等分別對楊樹與桉樹的研究中，均顯示Genomic-SSR 標(biāo)記的等位基因數(shù)、多態(tài)性、雜合度高于ESTSSR 標(biāo)記[30,31]，而在張亞東等對楊樹研究則顯示EST-SSR 標(biāo)記等位基因數(shù)、多態(tài)性、雜合度高于Genomic-SSR 標(biāo)記[32]，而大豆相關(guān)研究則顯示Genomic-SSR 的等位基因數(shù)高于EST-SSR 標(biāo)記，但是EST-SSR 標(biāo)記的多態(tài)性稍高于Genomic-SSR[33]。在對榿木群體遺傳多樣性的解析中，Genomic-SSR與EST-SSR 分析結(jié)果也不一致。盡管理論上由于EST-SSR 引物來自高度保守的DNA 轉(zhuǎn)錄區(qū)，其揭示的多態(tài)性在理論上應(yīng)低于基因組SSR 標(biāo)記，但由于試驗材料與參試標(biāo)記的不同，其顯示的遺傳差異可能不同。因此，在物種遺傳多樣性的研究中，應(yīng)利用不同來源的分子標(biāo)記進行綜合評價，以獲得更加客觀的結(jié)論。

在對榿木群體遺傳關(guān)系的分析中，在大的類群上Genomic-SSR 與EST-SSR 標(biāo)記相一致，而在進一步的小類群上則顯示出差異，而且本研究中兩種標(biāo)記計算的綜合相關(guān)系數(shù)與Genomic-SSR 標(biāo)記更為相似，表明本研究中Genomic-SSR 能更準(zhǔn)確地揭示榿木不同群體或個體間的遺傳關(guān)系，與前述宋躍朋等、劉果等與張亞東等研究結(jié)果不一致，這3 項研究均顯示EST-SSR 能更準(zhǔn)確地揭示基因型之間的遺傳關(guān)系[30-32]。這可能與研究所用材料有關(guān)，這3 項研究分析的均是楊樹與桉樹不同種間的遺傳關(guān)系，而本研究材料為榿木的不同群體，由于EST-SSR 來自DNA 轉(zhuǎn)錄區(qū)，保守性強，對親緣關(guān)系較近的基因型靈敏度不及基因組SSR，但在近鄰的種間具有通用性，對不同種屬系統(tǒng)演化研究、加密遺傳連鎖圖譜、基因精細定位、標(biāo)記功能研究等具有重要作用。

總之，本研究表明榿木Genomic-SSR 與EST-SSR標(biāo)記在解析群體遺傳多樣性與遺傳關(guān)系方面有一定差異，要得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，需要綜合使用兩種標(biāo)記。