基于SSR 標(biāo)記的楠木核心種質(zhì)構(gòu)建

張群 ,程曉玲 ,劉明,謝佳鑫,彭建,余波,晏奎*,辜云杰,楊漢波

1.成都興綠林業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 溫江 611100；2.布拖林業(yè)和草原局，四川 布拖 616350；3.四川省林業(yè)科學(xué)研究院森林與濕地生態(tài)恢復(fù)與保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610081；4.長(zhǎng)江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)江上游森林資源保育與生態(tài)安全國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華西雨屏區(qū)人工林生態(tài)系統(tǒng)研究長(zhǎng)期科研基地，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 成都 611130；5.四川省林業(yè)和草原宣傳中心，四川 成都 610081

林木種質(zhì)資源是育種工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是決定育種效果的關(guān)鍵，世界各國(guó)都非常關(guān)注對(duì)種質(zhì)資源的調(diào)查、搜集、評(píng)價(jià)、保存和利用[1-2]。但是，隨著林木種質(zhì)資源收集、保存數(shù)量的不斷增加，給保存、評(píng)價(jià)和利用帶來(lái)了巨大困難。Frankel 等[3]在種質(zhì)資源庫(kù)的基礎(chǔ)上提出了核心種質(zhì)的概念，其目的是以最少數(shù)量的種質(zhì)資源最大限度地保存整個(gè)群體的遺傳多樣性，從而解決種質(zhì)資源規(guī)模過(guò)大難以管理和利用的難題。核心種質(zhì)的提出為種質(zhì)資源的有效保護(hù)與深入研究、利用開辟了新的途徑，目前已有大量的植物構(gòu)建了核心種質(zhì)，但主要以作物為主[2]。相較于農(nóng)作物，林木核心種質(zhì)的構(gòu)建起步較晚，涉及的樹種也有限，近10 年國(guó)內(nèi)相關(guān)研究主要涉及的樹種有核桃[4]、毛白楊[5]、木荷[2]、馬尾松[6]等。目前構(gòu)建核心種質(zhì)主要是基于形態(tài)和分子標(biāo)記兩類數(shù)據(jù)，對(duì)于多年生、樹體高大的木本植物，表型數(shù)據(jù)獲取需要較長(zhǎng)的年限；而以DNA 多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記不受植物生長(zhǎng)期影響，較形態(tài)標(biāo)記更適合林木核心種質(zhì)構(gòu)建[7]。例如在SSR 標(biāo)記遺傳多樣性基礎(chǔ)上，采用逐步聚類法以17.2%的入選率構(gòu)建了包含164 份種質(zhì)的三葉木通核心種質(zhì)[8]；根據(jù)以等位基因最大化為標(biāo)準(zhǔn)，從272 份金縷梅種質(zhì)資源中提取了51 份核心種質(zhì)，能夠代表原種質(zhì)95%的等位基因數(shù)。總的來(lái)說(shuō)，核心種質(zhì)是種質(zhì)資源的重復(fù)子集，有助于資源長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)效利用，可以幫助研究者快速捕捉到具有目標(biāo)性狀的種質(zhì)，提高育種效率[9]。

楠木（Phoebe zhennan）是我國(guó)特有的珍貴用材樹種，其優(yōu)質(zhì)大徑級(jí)木材因呈現(xiàn)金黃色絹絲狀而被稱為“金絲楠”，是“金絲楠木”的最優(yōu)來(lái)源樹種之一，但由于其生長(zhǎng)緩慢，加之歷代無(wú)節(jié)制采伐，楠木資源趨于枯竭，楠木現(xiàn)存資源多為人工栽培群體[10-11]。人為活動(dòng)的干擾可能會(huì)導(dǎo)致降低其遺傳多樣性水平，大量?jī)?yōu)良基因缺失，群體趨于純化，遺傳基礎(chǔ)變窄[12]。而珍貴用材是林木資源戰(zhàn)略儲(chǔ)備的重要組成部分，因此，加強(qiáng)對(duì)珍貴樹種楠木的恢復(fù)性培育尤為重要，并應(yīng)作為長(zhǎng)期堅(jiān)持的任務(wù)。為了保護(hù)楠木的優(yōu)良種質(zhì)資源和維持其可持續(xù)性遺傳改良，亟需開展楠木核心種質(zhì)的構(gòu)建。鑒于此，我們以楠木第一輪育種群體（102 份種質(zhì)資源）為研究對(duì)象，利用SSR 引物進(jìn)行基因分型，通過(guò)比較和分析不同抽樣策略下構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳參數(shù)評(píng)價(jià)，確定楠木核心種質(zhì)構(gòu)建的最適取樣策略和比例，期望用最少的種質(zhì)最大程度保存楠木遺傳多樣性，同時(shí)為楠木種質(zhì)資源的深入研究和加強(qiáng)利用、發(fā)掘優(yōu)異基因資源提供理論依據(jù)和核心材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012 年，在四川、重慶、湖南、湖北和貴州省等楠木產(chǎn)區(qū)根據(jù)樹高、胸徑和環(huán)境適應(yīng)性選擇優(yōu)樹102 株，基本涵蓋了楠木天然分布區(qū)，分單株采集優(yōu)樹種子，沙藏；2013 年春季分家系育苗；2014 年在瀘州市玉蟾山國(guó)家林草長(zhǎng)期科研基地建立楠木種質(zhì)資源基因庫(kù)（105.387529°E,29.137715°N,海拔553 m）。2022 年6 月，對(duì)102 個(gè)家系采集新鮮嫩葉，將其放入硅膠中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 提取與SSR 擴(kuò)增

本研究采用改良CTAB 法快速提取楠木基因組DNA。選用14 對(duì)條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的SSR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（見表1），SSR 引物由生工生物（上海）股份有限公司合成熒光引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Fragment Analyzer 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳分析儀進(jìn)行檢測(cè)[13]。

表1 用于楠木核心種質(zhì)構(gòu)建的SSR 引物基本信息Tab.1 Base information of SSR primers used in core collection construction of Phoebe zhennan

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建策略

（1）M 策略：以核心種質(zhì)中標(biāo)記位點(diǎn)最大化為標(biāo)準(zhǔn)的核心種質(zhì)構(gòu)建方法[14]。通過(guò)Core Finder 軟件以等位基因最大化為原則抽取核心種質(zhì)[15]。

（2）隨機(jī)取樣法：依據(jù)張春雨等[16]隨機(jī)取樣策略，以10%、20%、40%和50%為取樣比例，分別構(gòu)建核心種質(zhì)。

（3）以核心種質(zhì)保留等位基因或遺傳多樣性最大化分別構(gòu)建核心種質(zhì)，抽樣比例為10%、20%、40%和50%，借助PowerMarker version 3.25 軟件進(jìn)行核心種質(zhì)的抽取[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Genemarker 2.2.0 軟件分析毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)。Cervus 3.0.7 軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）[18]。利用GeneAlEx 6.5 軟件[19]計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測(cè)雜合度及Shannon’s 信息指數(shù)，用這些指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)核心種質(zhì)、原有種質(zhì)與保留種質(zhì)的遺傳多樣性，并通過(guò)t檢驗(yàn)對(duì)核心種質(zhì)與原有種質(zhì)各遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析[2]。同時(shí)，運(yùn)用主坐標(biāo)分析法對(duì)構(gòu)建的核心種質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)。最后，將SSR-PCR 產(chǎn)物毛細(xì)管電泳譜帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜，以此構(gòu)建楠木核心種質(zhì)的分子身份信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 楠木種質(zhì)資源SSR 遺傳多樣性參數(shù)

利用14 對(duì)SSR 引物對(duì)102 份楠木種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析（見表2）。結(jié)果顯示，14 對(duì)SSR引物共檢測(cè)到166 個(gè)等位基因，每對(duì)SSR 引物檢測(cè)到等位基因數(shù)的范圍在2（PZmf07、CL20730-Contig1、PZmf05 和PZmf02）～37（MN-g3）之間，平均為12。有效等位基因數(shù)平均為4.875，各引物檢測(cè)到的有效等位基因數(shù)在1.021（PZmf02）～3.125（MN-g3）之間。期望雜合度與觀測(cè)雜合度分別在0.117（PZmf07）～0.943（MN-g3）和0.000（PZmf07、PZmf05、PZmf06 和PZmf02）～0.978（MN-g3）之間，平均分別為0.561 和0.373。Shannon’s 信息指數(shù)最高的為引物MN-g3（3.125），其次為引物MN-g5（3.029），最低為引物PZmf02（0.057），楠木種質(zhì)資源平均Shannon’s 信息指數(shù)為1.297。以上結(jié)果表明楠木種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。

表2 楠木102 份種質(zhì)資源遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 The genetic diversity parameters of P.zhennan germplasm resources

2.2 不同取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)比較分析

隨取樣比例的增加，不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)等位基因數(shù)及其保留率呈逐漸上升的趨勢(shì)（見表3）。在取樣比例較低時(shí)，各遺傳多樣性參數(shù)值和保留率均處于較低水平。如隨機(jī)取樣和遺傳多樣性最大化策略在取樣比例低于20%時(shí)，其等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)的保留率均低于60%，表現(xiàn)出明顯的等位基因缺失。當(dāng)取樣比例為50%時(shí)，雖然隨機(jī)取樣、等位基因最大化和遺傳多樣性最大化法構(gòu)建的候選核心種質(zhì)Shannon’s 信息指數(shù)均略高于原有種質(zhì)，但其余遺傳多樣性參數(shù)，如觀測(cè)雜合度、期望雜合度明顯低于原有種質(zhì)。而M 策略以58.8%的取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)有效等位基因數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)、觀測(cè)雜合度以及期望雜合度均明顯高于原有種質(zhì)，等位基因數(shù)保留率100%。不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)與原有種質(zhì)遺傳參數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Shannon’s 信息指數(shù)和期望雜合度在各種質(zhì)間無(wú)顯著差異，候選核心種質(zhì)與原有種質(zhì)存在顯著差異的遺傳參數(shù)主要集中在等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)和觀測(cè)雜合度。10%取樣比例時(shí)，隨機(jī)取樣、等位基因最大化和遺傳多樣性最大化法構(gòu)建的候選核心種質(zhì)等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)均顯著低于原有種質(zhì)。M 策略構(gòu)建的核心種質(zhì)各遺傳參數(shù)與原有種質(zhì)并無(wú)顯著差異。根據(jù)5 個(gè)遺傳參數(shù)的綜合考慮，選擇M 策略抽取的60 份（58.8%）種質(zhì)資源構(gòu)建的楠木和新種指能夠以較小的種質(zhì)份數(shù)最大程度地代表整個(gè)楠木種質(zhì)資源地遺傳多樣性。利用M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)中包含四川36 份（55.4%）、湖北5 份（45.5%）、湖南11 份（64.7%）、貴州5 份（83.3%）和重慶3 份（100.0%）共計(jì)60 份種質(zhì)材料。

表3 不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)比較Tab.3 Comparisons of genetic diversity parameters of candidates core collection constructed by different tactics

2.3 核心種質(zhì)確認(rèn)及評(píng)價(jià)

M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)保留了原有種質(zhì)58.8%的材料，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度的保留率分別為100.0%、106.9%、105.5%和102.7%（見表4）。t檢驗(yàn)結(jié)果也表明，利用M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)和原有種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)間差異不顯著。由此，認(rèn)為本研究利用M 策略構(gòu)建的核心種質(zhì)具有很高的代表性。采用主坐標(biāo)分析法（PCoA）對(duì)構(gòu)建的核心種質(zhì)進(jìn)行比較分析，以進(jìn)一步確定其代表性。結(jié)果顯示，楠木核心種質(zhì)在整個(gè)種質(zhì)資源的主坐標(biāo)圖內(nèi)均勻分布，表明M 策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)具有很好的代表性（見圖1）。

圖1 核心種質(zhì)與原有種質(zhì)對(duì)比的主坐標(biāo)圖Fig.1 Principal coordinates lots of core collection and original collection

表4 核心種質(zhì)、保留種質(zhì)與原有種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)對(duì)比Tab.4 Comparison of genetic diversity parameters among core collection,reserve collection,and original collection

2.4 核心種質(zhì)分子身份信息

利用14 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增的全部多態(tài)性譜帶構(gòu)建了60 份楠木核心種質(zhì)的分子身份信息（見表5）。每份核心種質(zhì)材料都有其唯一的分子身份信息，可以通過(guò)其專一的分子身份信息將60 份核心種質(zhì)材料相互區(qū)分鑒別出來(lái)。

表5 核心種質(zhì)的分子身份信息Tab.5 Molecular ID of core collection

3 討論

種質(zhì)資源收集和保存對(duì)于保存物種遺傳多樣性和育種利用具有重要意義，是育種循環(huán)的必不可少的組成部分。所以，采用合適的技術(shù)方法構(gòu)建核心種質(zhì)，對(duì)于優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘利用，提高種質(zhì)資源的利用價(jià)值和效率具有重要的指導(dǎo)意義[3]。而關(guān)于林木核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，前人已有一些研究。Yang 等[6]認(rèn)為核心種質(zhì)的數(shù)量應(yīng)根據(jù)種質(zhì)資源的總數(shù)及其遺傳變異的豐富程度而定。如果種質(zhì)資源數(shù)較少，則核心種質(zhì)取樣的比例可以相對(duì)大一些；如種質(zhì)資源總數(shù)很大，則核心種質(zhì)取樣比例可以小一些[5]。例如，Yang 等[6]在304 份馬尾松二代育種群體中以34.2%的比例抽取104 份種質(zhì)構(gòu)建了馬尾松二代育種核心種質(zhì)。楊漢波等[2]以15.3%的比例從754 份木荷種質(zhì)資源中抽取115 份種質(zhì)組成木荷核心種質(zhì)。本研究利用M 策略以58.8%的抽樣比例從102 份楠木種質(zhì)資源中抽取60 份種質(zhì)組建核心種質(zhì)，能夠最大程度地代表原有種質(zhì)的遺傳多樣性。以上結(jié)果均反映出供試種質(zhì)資源數(shù)量對(duì)核心種質(zhì)抽樣比例有明顯影響，分析其原因可能為：（1）相對(duì)較少的種質(zhì)資源數(shù)，暗示種質(zhì)資源選擇時(shí)的強(qiáng)度較大，中選并保存的優(yōu)異種質(zhì)資源具有豐富的遺傳變異，導(dǎo)致在構(gòu)建核心種質(zhì)時(shí)需要抽取更多的種質(zhì)數(shù)以保證核心種質(zhì)的代表性；（2）核心種質(zhì)抽樣方法的不同也可能造成最終核心種質(zhì)抽樣比例存在差異。因此，對(duì)于不同種質(zhì)資源總數(shù)的樹木核心種質(zhì)抽樣方法的選擇對(duì)正確構(gòu)建核心種質(zhì)的關(guān)鍵。

目前，主要通過(guò)表型數(shù)據(jù)、遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)或表型與分子標(biāo)記相結(jié)合的方式來(lái)構(gòu)建核心種質(zhì)[20]。在許多作物中，通常是應(yīng)用形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)原始群體進(jìn)行壓縮，建立基于形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的初級(jí)核心種質(zhì)，然后再利用分子數(shù)據(jù)壓縮原始群體，建立基于分子數(shù)據(jù)的初級(jí)核心種質(zhì)，最后將二者進(jìn)行綜合，構(gòu)建最終的核心種質(zhì)[21-22]。但這在樹體高大、表型變異豐富的林木而言，要得到可靠的表型數(shù)據(jù)需要較長(zhǎng)的年限[23]。DNA 分子標(biāo)記不會(huì)或極少受到環(huán)境的影響，較形態(tài)學(xué)標(biāo)記更適用于構(gòu)建核心種質(zhì)，且優(yōu)勢(shì)明顯[24-25]。已有相當(dāng)數(shù)量的林木樹種利用分子標(biāo)記技術(shù)成功構(gòu)建了核心種質(zhì)，反映出DNA 標(biāo)記技術(shù)在林木核心種質(zhì)構(gòu)建中的高效性和準(zhǔn)確性。例如，Liang等[26]利用SSR 標(biāo)記從蘋果種質(zhì)中以13.2%的抽樣比例構(gòu)建了蘋果核心種質(zhì)。劉勇等[27]根據(jù)678 個(gè)SSR和AFLP 分子標(biāo)記聚類結(jié)果，采用逐級(jí)壓縮法選擇、構(gòu)建了包含25 份樣本的柚類核心種質(zhì)。曾憲君等[28]利用SSR 分子遺傳多樣性以30.2%的抽樣比例構(gòu)建了歐洲黑楊核心種質(zhì)。本研究中，基于等位基因和遺傳多樣性取樣策略構(gòu)建的楠木核心種質(zhì)等位基因數(shù)等遺傳多樣性參數(shù)保留率明顯高于隨機(jī)取樣策略。這與劉娟等[29]、楊漢波等[2]對(duì)杏和木荷核心種質(zhì)構(gòu)建的結(jié)果相一致，均證明基于等位基因和遺傳多樣性優(yōu)先的取樣策略優(yōu)于隨機(jī)取樣策略。本研究對(duì)不同取樣策略構(gòu)建的候選核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)利用t檢驗(yàn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上進(jìn)行驗(yàn)證，以驗(yàn)證各候選核心種質(zhì)的代表性。最終確定M 策略是楠木核心種質(zhì)的最優(yōu)取樣策略，并以此構(gòu)建了包含60 份種質(zhì)的楠木核心種質(zhì)，5 個(gè)?。ㄊ校┑姆N質(zhì)資源均有抽取。當(dāng)然，由于本次研究的楠木種質(zhì)資源總數(shù)偏少且遺傳多樣性豐富，導(dǎo)致核心種質(zhì)抽取比例偏大，也從側(cè)面反映出資源收集的欠缺，后續(xù)應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步強(qiáng)化楠木種質(zhì)資源全面調(diào)查，以最大限度地收集楠木優(yōu)良種質(zhì)資源，擴(kuò)大種質(zhì)資源的數(shù)量，提高遺傳多樣性，以期在楠木育種循環(huán)中獲得更高的遺傳增益。

通過(guò)DNA 指紋是目前品種資源鑒定的有效技術(shù)手段，在植物品種鑒定中得到廣泛應(yīng)用[30]。如郭娟等[31]利用61 條SRAP 特異性條帶構(gòu)建了5 個(gè)楊樹品種的分子指紋圖譜。何旭東等[32]優(yōu)選核心EST-SSR引物組合構(gòu)建楊樹品種的指紋圖譜，可以將33 個(gè)楊樹品種準(zhǔn)確區(qū)分開來(lái)。沈敬理等（2015）采用15 個(gè)SSR 位點(diǎn)+2 對(duì)SRAP 標(biāo)記組合的方式構(gòu)建了馬尾松種子園131 個(gè)無(wú)性系的DNA 指紋圖譜，可有效區(qū)分種子園各無(wú)性系。以上研究均表明，利用分子標(biāo)記技術(shù)可實(shí)現(xiàn)種質(zhì)或品種的高效、精準(zhǔn)鑒別。本研究利用全部14 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶構(gòu)建了60份楠木核心種質(zhì)的分子身份信息，可以實(shí)現(xiàn)每份核心種質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定。考慮到引物數(shù)量在種質(zhì)鑒定中重要作用，在今后的工作中，可適當(dāng)增加標(biāo)記數(shù)量以形成更加精準(zhǔn)的分子身份信息，以提高種質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性，為輔助雜交親本選配和再選育提供參考。