瀕危植物春劍的胚胎發(fā)育及果實和種子特征研究

王仁睿 劉 鑫 李 杰

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010）

春劍（Cymbidium goeringiivar.longibracteatum）是春蘭變種［Cymbidium goeringiivar.longibracteatum（Y.S.Wu et S.C.Chen）］，國蘭代表種之一，有正宗“川蘭”之稱［1］。春劍為國家重點二級保護(hù)野生植物［2］，被列入《華盛頓公約》（CITES）附錄Ⅱ和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》［3-4］。有性生殖是植物生長發(fā)育的重要過程，胚珠和種子發(fā)育是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通常蘭科植物授粉一段時間之后受精才發(fā)生［5］，正常的胚胎發(fā)育是種子發(fā)育和萌發(fā)的基本條件。研究表明，蘭科植物的種子細(xì)小，無胚乳形成，胚柄形態(tài)因種而異［5］，具有分類學(xué)意義。種子萌發(fā)是影響春劍自然繁殖的生物學(xué)瓶頸問題［6］，其萌發(fā)機(jī)理和條件尚不明確。目前關(guān)于春劍胚胎發(fā)育的相關(guān)研究尚鮮見報道。本研究通過體式顯微鏡、石蠟切片和掃描電鏡3種方法觀察春劍的果實和種子形態(tài)特征、胚珠發(fā)育以及胚胎發(fā)育，了解胚胎發(fā)育特征，分析可能影響其種子萌發(fā)的胚胎學(xué)因素和胚胎敗育情況，是春劍繁殖生物學(xué)研究的重要內(nèi)容和再引入的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

春劍種植在綿陽西南科技大學(xué)蘭科植物資源圃（31.5°N，104.7°E）。通過人工授粉進(jìn)行自交，采集不同發(fā)育時期的子房、幼果和成熟果實，固定于FAA 溶液后，制備石蠟切片，并在顯微鏡下觀察發(fā)育特征。

1.2 果實形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

用解剖刀將春劍自然成熟未開裂的蒴果切開，沿橫切面和縱切面，在體視顯微鏡下觀察果實內(nèi)部結(jié)構(gòu)，包括胎座、種子著生情況，結(jié)合差減法和粘取計數(shù)法估算蒴果中種子的數(shù)量和單粒質(zhì)量［7］。稱量待測蒴果的質(zhì)量，記作M1，將每個果實內(nèi)的種子全部取出，稱量空蒴果的質(zhì)量，記作M2，蒴果中種子的總質(zhì)量為M1-M2。取一定量的種子稱量質(zhì)量，記為m1，從m1中取出部分種子，再將剩余的種子稱質(zhì)量，記作m2，取出的種子用粘取法計數(shù)，種子數(shù)量記作n，則種子單粒質(zhì)量m=（m1-m2）/n。試驗取5 個蒴果，5 個重復(fù)，稱量計算，取平均值。蒴果中種子的含量（N）可根據(jù)N=（M1-M2）/m計算得出。

1.3 胚胎發(fā)育過程及胚柄細(xì)胞觀察

分別取人工自交授粉后6 個不同發(fā)育階段的果實，包括：60、80、100、120、150、180 d，去除外果皮，將帶有胚珠和種子的材料，橫切成5 mm×5 mm的小塊，參照李和平［8］的常規(guī)石蠟制片方法，將材料至于FAA 固定液（40%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）固定24 h 后，依次加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇脫水，各處理2 h，100%乙醇和二甲苯混合溶液（體積比1∶1）處理2 h，純二甲苯處理2 h。將材料放入液態(tài)石蠟中，放置于恒溫箱（博準(zhǔn)BZ-300BSH，上海）中45 ℃連續(xù)浸蠟24 h。將處理好的石蠟和材料一起倒入包埋底膜中，蓋上包埋框，將模具迅速放入冷水中，使其冷卻凝固。用徠卡輪軸式石蠟切片機(jī)（Leica RM2235，德國）把包埋好的材料，切成8 μm 的薄片。將連續(xù)的蠟帶放置于40 ℃熱水中平展，貼在載玻片上，再將載玻片放入恒溫烘箱（澳德瑪ZKGT-6053，深圳）40 ℃烘片24 h，脫蠟及染色，用中性樹脂封片，將切片置于徠卡光學(xué)顯微鏡（Leica DM750，德國）觀察大孢子的發(fā)生過程。

1.4 種子形態(tài)觀察

春劍成熟果實自然風(fēng)干，開裂后，取部分種子直接固定在雙面導(dǎo)電膠上，貼于樣品臺上，放入離子濺射儀（Quorum SC7620，英國）噴金，將樣品置于蔡司掃描電子顯微鏡（Zeiss EVO 18，德國），觀察種子表面超微結(jié)構(gòu)特征。

選取5個自然開裂的成熟蒴果，每個蒴果隨機(jī)選取100 粒種子放置于載玻片上，加一滴清水，置于體視顯微鏡下（Nikon SM645S，日本）下觀察種子形態(tài)大小，用IMAGE3000 顯微鏡圖像分析軟件系統(tǒng)測量種子及種胚的長寬，種子和種胚體積的計算參照Arditti等［9］的方法。

式中：r為1/2 種子寬；h為1/2 種子長；a為1/2種胚寬；b為1/2種胚長。

本文的數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實結(jié)構(gòu)及種子含量

春劍成熟蒴果的橫切面輪廓為1 個近似三角的六邊形，子房由6 枚心皮組成，側(cè)膜胎座，構(gòu)成1 室子房（圖1A）。其中，3 枚心皮具胎座，著生胚珠并發(fā)育為種子，為形態(tài)較大的可育心皮；另有3枚胎座缺乏胎座，為形態(tài)較小的不育心皮。成熟果實外壁呈六棱狀突起，將果實分為6 瓣，每個突起為1瓣，其中3瓣體積較大，向內(nèi)形成“V”字形的胎座，胎座向果實內(nèi)部分化出多個分支，種子著生在胎座及其分支上。另外3瓣體積較小，無向內(nèi)突起的胎座，無種子著生（圖1B～E）。春劍果實有3 層果皮結(jié)構(gòu)，分為外果皮、中果皮和內(nèi)果皮。外果皮較薄，表面光滑無毛，且呈木栓化，較堅硬；中果皮較厚，細(xì)胞呈海綿狀排列較疏松，顏色由外到內(nèi)逐漸變淺，靠近內(nèi)果皮部分顏色最淺，為淡綠色；內(nèi)果皮為透明薄層，將種子包裹在果腔內(nèi)。蒴果縱向切開后，種子自然灑落，顏色呈白色，細(xì)小如塵，肉眼難以觀察單粒種子形態(tài)，種子數(shù)量眾多充滿整個果腔（圖1F）。

圖1 春劍蒴果的解剖結(jié)構(gòu)A.成熟蒴果橫切；B.成熟蒴果橫切結(jié)構(gòu)簡圖（P.胎座；FV.可育瓣；SV.不育瓣）；C.可育瓣及“V”字形胎座；D.胎座分支；E.蒴果縱切；F.蒴果中種子生長情況Fig.1 Anatomy of the capsule of C. goeringii var. longibracteatum A.Cross section of the capsule；B.A diagram of the cross section of the capsule（P.Placentation；FV.Fertile valve；SV.Sterile valve）；C.fertile valves and a‘ V’ shaped placentation；D.Placentation branchs；E.Longitudinal section of the capsule；F.Seeds growth in the capsule

單個蒴果質(zhì)量平均為6.576 g，其內(nèi)種子質(zhì)量平均為1.476 g。根據(jù)表2 利用差減法得到的數(shù)據(jù)可知，春劍種子單粒質(zhì)量為（3.92±0.40） μg，單個春劍蒴果中種子含量約（37.98±3.71）萬粒。

表1 春劍蒴果中種子數(shù)量Table 1 The number of seeds in capsules of C. goeringii var. longibracteatum

表2 春劍種子和種胚特征Table 2 The characteristics of seed and seed embryo of C. goeringii var. longibracteatum

2.2 種子形態(tài)

春劍種子為白色，長約1.55 mm，寬約0.13 mm，長寬之比約為13.4，種子呈梭形，種子體積約6.51×10-3mm3。種胚為淺棕色，長約0.24 mm，寬約0.11 mm，種胚長寬之比約為2.3，種胚呈橢球形，種胚體積約為1.56×10-3mm3（表2）。春劍種子微小，種胚在種子中體積占比較小，約占24%，種胚能儲藏的營養(yǎng)物質(zhì)較少。

正常發(fā)育的春劍種子中間大、兩頭稍尖，胚柄端種皮有開口，種子表面形成網(wǎng)狀紋路（圖2A～B）。種子結(jié)構(gòu)簡單，由內(nèi)種皮、外種皮和未分化的球形種胚組成。內(nèi)種皮緊密包裹著胚體生長，內(nèi)外種皮之間存在明顯的空氣腔，空氣腔占種子體積的比例約為75.61%。外種皮細(xì)胞為長方形的薄壁細(xì)胞，細(xì)胞表面不光滑，有斜條狀紋路，細(xì)胞壁加厚突起，種皮呈白色透明狀，種皮細(xì)胞里無內(nèi)容物，透過種皮可觀察種胚形態(tài)（圖2C～D）。

圖2 春劍的種子形態(tài)和表皮超微特征A～B.電鏡掃描下的種子形態(tài)，箭頭所示種孔；C.種皮細(xì)胞加厚的細(xì)胞壁以及表面紋飾；D～F.體視顯微鏡下正常發(fā)育的種子形態(tài)（D.含胚胎的正常種子；E.有胚胎和無胚胎（箭頭所示）的種子；F.畸形的種子）Fig.2 Seed morphology and epidermal ultrastructure of C. goeringii var. longibracteatum A-B.Ultrastructure of seed under SEM，arrow showed the micropyle；C.Epidermal cells with ridiged on seed coat；D-F.Seed morphology under microscope（D.Normal seeds with embryos；E.Seeds with and without embryo（arrows）；F.The seed with abnormal embryo）

春劍種子發(fā)育過程中有少量的敗育情況，其敗育情況可分2 種：一是無種胚結(jié)構(gòu)，種子僅有1 層透明的種皮結(jié)構(gòu)（圖2E）；二是種胚發(fā)育畸形，正常發(fā)育的種胚成熟后形態(tài)呈球形或橢球形，畸形發(fā)育的種胚僅有1個深色的不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)，其體積明顯小于正常種胚體積（圖2F）。

2.3 大孢子發(fā)生

春劍種子在具有胎座結(jié)構(gòu)的可育心皮瓣膜的胎座上發(fā)育形成，授粉后胎座細(xì)胞進(jìn)行分裂和分化，向子房內(nèi)部形成數(shù)十個分支結(jié)構(gòu)，在胎座和分支表面分化出大量指狀突起的胚珠（圖3A），受精后，發(fā)育成種子。授粉后60 d 觀察到胚珠內(nèi)的胚囊腔出現(xiàn)大孢子母細(xì)胞（圖3B），80 d 后可見成熟蓼型胚囊結(jié)構(gòu)（圖3C）。在大孢子發(fā)生過程中，胚珠內(nèi)部的胚囊腔里，珠心表皮下的1個細(xì)胞分化為孢原細(xì)胞，孢原細(xì)胞再分裂形成珠心細(xì)胞和大孢子母細(xì)胞，內(nèi)外珠被（圖3B～C）將大孢子母細(xì)胞包裹在中間（圖3B）。大孢子母細(xì)胞經(jīng)多次減數(shù)分裂后發(fā)育形成成熟胚囊結(jié)構(gòu)（圖3C）。

圖3 大孢子發(fā)生A.胎座表面形成的胚珠原基；B.大孢子母細(xì)胞（箭頭所示）；C.成熟蓼型的胚囊（箭頭所示為卵細(xì)胞）Fig.3 Stage of megasporogenesis A.Ovule primordium on placentation surface；B.Megasporocyte（arrow）；C.Mature embryo sac of polygonum type（egg cell showed by arrow）

2.4 胚胎發(fā)育

授粉80 d 后，受精產(chǎn)生合子，合子細(xì)胞體積較大，細(xì)胞質(zhì)較濃（圖4A）。授粉100 d 后，觀察到大量合子，胚胎發(fā)育已經(jīng)開始，合子體積增大，呈現(xiàn)極性，細(xì)胞核向合點端移動，合子中部向內(nèi)凹陷（圖4B），隨后開始第1 次有絲分裂，形成2 個子細(xì)胞，此時為雙細(xì)胞原胚階段（圖4C）。春劍胚胎發(fā)育合子第1次有絲分裂形式為橫裂，分別產(chǎn)生頂細(xì)胞和基細(xì)胞，兩種細(xì)胞形態(tài)各異，且后期發(fā)育途徑不同。頂細(xì)胞靠近合點端，體積較小，基細(xì)胞靠近珠孔端，體積較大，呈液泡化，基細(xì)胞和頂細(xì)胞分別發(fā)育形成胚柄和胚體。合子第2次有絲分裂，頂細(xì)胞先分裂，橫裂形成1 個直線型的三細(xì)胞原胚，隨后經(jīng)多次分裂，胚體細(xì)胞數(shù)量不斷增加，種胚體積變大。

圖4 種子胚胎發(fā)育過程A.受精后形成合子；B.合子第1次有絲分裂；C.雙細(xì)胞原胚時期，橙色箭頭所示為內(nèi)珠被，黑色箭頭所示為外珠被；D.早期原胚階段；E.胚柄開始發(fā)育；F.胚柄含有5個細(xì)胞，呈線性排列；G.胚柄細(xì)胞開始退化；H.成熟種子，胚柄退化消失；I.雙胚結(jié)構(gòu)Fig.4 The process of seed embryo development A.Formation of zygote；B.The first mitosis of zygote；C.Two-celled proembryonic stage，orange arrow showed the inner integument，and the black arrow showed the outer integument；D.Early proembryonic stage；E.Development of suspensor；F.The suspensor contained five cells in a line；G.Degeneration of the suspensor；H.Mature seed without suspensor；I.Double embryos

授粉120 d 后，早期原胚發(fā)育形成，靠近珠孔端位置，具有1 個體積較大的胚柄細(xì)胞（圖4D）。胚體體積逐漸增大，充滿胚囊腔，逐漸發(fā)育形成球形胚，胚柄細(xì)胞繼續(xù)生長發(fā)育，橫裂形成具有2 個細(xì)胞的胚柄結(jié)構(gòu)（圖4E）。授粉150 d 后胚體仍停留在球形胚結(jié)構(gòu)，胚柄高度發(fā)育，胚柄結(jié)構(gòu)包含5 個細(xì)胞，呈直線排列向珠孔端延伸（圖4F）。授粉180 d 后，胚柄開始退化，胚柄的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少（圖4G），胚體細(xì)胞不再進(jìn)行分裂和分化，開始營養(yǎng)物質(zhì)的儲存，直到種子成熟，胚體依舊處于球形胚階段。種子成熟后其種胚結(jié)構(gòu)為5～7 個細(xì)胞寬，7～9 個細(xì)胞長，胚柄退化消失（圖4H）。春劍種子胚胎發(fā)育過程中存在極少數(shù)的雙胚結(jié)構(gòu)，即1個種皮包裹著2個種胚（圖4I），種胚之間獨(dú)立發(fā)育生長，互不影響，且2個種胚的發(fā)育程度基本一致。

2.5 內(nèi)外種皮發(fā)育

春劍種子為雙層種皮結(jié)構(gòu)，內(nèi)珠被和外珠被分別發(fā)育形成內(nèi)種皮和外種皮。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)珠被由單層細(xì)胞組成，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞質(zhì)較濃，細(xì)胞核體積較小（圖4C）。外珠被由2 層呈長方形狀的薄壁細(xì)胞組成，細(xì)胞液泡化程度較高，細(xì)胞核較大（圖4C）。在胚胎發(fā)育過程中內(nèi)外珠被細(xì)胞均不再進(jìn)行分裂，授粉120 d 后內(nèi)珠被細(xì)胞逐漸失水，形成薄而致密的一層膜狀包裹在種胚之外，之后發(fā)育成緊貼胚體的內(nèi)種皮，此時外珠被細(xì)胞的雙層結(jié)構(gòu)變?yōu)閱螌樱拷N胚的一層細(xì)胞退化（圖4D）。授粉150 d 后外珠被細(xì)胞失水收縮，細(xì)胞器退化消失，細(xì)胞壁向外加厚，最后發(fā)育形成透明且有加厚環(huán)紋的外種皮（圖4E）。此外在授粉100 d 后內(nèi)外珠被之間開始形成空氣腔，直到種子發(fā)育成熟，內(nèi)外種皮之間可觀察到明顯的空氣腔（圖4H）。

3 討論

春劍果實解剖結(jié)構(gòu)與大多數(shù)蘭科植物類似，果實分為6 瓣。3 瓣體積較大，且?guī)в小癡”字形胎座為可育瓣，種子在胎座及其分支上發(fā)育形成，另外3瓣體積較小，無胎座形成，不產(chǎn)生種子，為不育瓣。Johansen研究認(rèn)為，蘭科植物的花瓣和萼片與果實的結(jié)構(gòu)中的可育瓣與不育瓣的起源相關(guān)［10］。關(guān)于蘭科植物果實的結(jié)構(gòu)一直以來都有爭議，部分學(xué)者認(rèn)為蘭科植物果實是由6 心皮組成，其中3個心皮帶胎座，3個心皮不帶胎座；另一部分學(xué)者認(rèn)為其果實由3心皮組成，分成6個瓣膜，3瓣為有胎座的可育瓣，3 瓣為無胎座的不育瓣［11］，通過本研究的觀察，春劍果實為3 心皮結(jié)構(gòu)，2 個心皮的邊緣部分組形成了“V”字形胎座。

本研究發(fā)現(xiàn)種子在胎座上形成的初期與胎座或胎座分支相連接，能從胎座獲取營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)發(fā)育到一定程度時種子將脫離胎座及其分支，隨著果實成熟，種子不斷形成，充滿果腔。蘭科植物種子數(shù)量巨大，通常幾萬到幾十萬粒不等，根據(jù)估算，1個春劍蒴果中約有37.98萬粒種子，種子極輕極小，每粒僅約3.92 μg，種子缺乏貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)。本研究認(rèn)為在種子形成過程中存在先后順序，同一時期先形成的種子成熟度相對較高，并被后形成的種子擠向果腔中部，因此位于果實中部的種子成熟度略大于邊緣部分，具體結(jié)論還需通過對不同部位種子進(jìn)行活力測定來驗證。

不同種類的植物從傳粉到受精之間的間隔期存在著差異，通常在10～48 h 內(nèi)完成受精［7］。本研究中春劍傳粉到受精間隔約80 d，較多數(shù)植物間隔時間長。授粉至受精的間隔期內(nèi)，子房內(nèi)部的發(fā)育情況尚不明確，促進(jìn)胚珠發(fā)育的物質(zhì)及其作用機(jī)理，需要進(jìn)一步研究。

根據(jù)被子植物胚胎發(fā)育類型的劃分［12］，春劍的胚胎發(fā)育類型屬于茄型。春劍授粉100 d 之后，果實縱橫徑的變化趨于穩(wěn)定，根據(jù)胚胎發(fā)育過程觀察，授粉100 d 后多數(shù)種子胚胎發(fā)育開始，因此本研究認(rèn)為胚胎發(fā)育過程不影響果實形態(tài)變化，營養(yǎng)物質(zhì)全部用于胚胎發(fā)育及養(yǎng)分貯藏。

由于胚柄結(jié)構(gòu)在形態(tài)上的差異，導(dǎo)致了蘭科植物胚胎發(fā)育的多樣性。Swamy［13］對蘭科植物的胚柄結(jié)構(gòu)進(jìn)行了形態(tài)分類，分別為單細(xì)胞的管狀或圓錐狀、絲狀、葡萄狀、胚柄細(xì)胞包裹胚體和胚柄肥大5種類型。一些蘭科植物胚柄不發(fā)達(dá)，僅有單個細(xì)胞的胚柄或是無胚柄結(jié)構(gòu)［14］。而春劍的胚柄屬于較發(fā)達(dá)的絲狀胚柄，由5 個細(xì)胞組成，形成吸器結(jié)構(gòu)。胚柄對胚體發(fā)育早期營養(yǎng)物質(zhì)的吸收起重要作用，但胚柄是在胚胎發(fā)育中短暫存在的結(jié)構(gòu)，發(fā)育到一定程度時發(fā)生程序性死亡，春劍種子成熟時無胚柄結(jié)構(gòu)。

春劍胚胎發(fā)育進(jìn)程存在不同步性，同時在授粉后80 d 和100 d 均能觀察到合子形成；授粉120 d后，部分種子已形成2～3個細(xì)胞的胚柄結(jié)構(gòu)，另一部分胚柄剛開始分化；授粉180 d 后，部分種子胚柄已經(jīng)退化消失，僅存一個未分化的種胚，部分種子仍保持3～4 個細(xì)胞的胚柄結(jié)構(gòu)。由果實解剖結(jié)構(gòu)可知，春劍種子起源于胎座，春劍蒴果中種子含量巨大，而胎座上種子的分化有先后順序，先分化形成的種子優(yōu)先發(fā)育，后分化形成的種子發(fā)育相對滯后，因此能在同一時期觀察到不同發(fā)育狀態(tài)的種子。

不同蘭科植物的種皮發(fā)育存在差異，部分蘭科植物在胚胎發(fā)育過程中內(nèi)珠被退化，種子成熟時，僅有1 層種皮結(jié)構(gòu)，如兜蘭（Paphiopedilum godefroyae）［15］。研究發(fā)現(xiàn)春劍種子種皮結(jié)構(gòu)與杓蘭屬（Cypripedium）相似，在胚胎發(fā)育過程中內(nèi)珠被一直存在，種子成熟時種皮有內(nèi)外2 層結(jié)構(gòu)，內(nèi)外珠被分別發(fā)育形成內(nèi)種皮和外種皮［16］。春劍授粉120 d 后內(nèi)外種皮形態(tài)發(fā)育基本完成，內(nèi)種皮薄而致密，呈膜狀緊貼胚體；外種皮脫水收縮成透明的薄膜狀，種子表面由于外種皮細(xì)胞壁加厚而形成網(wǎng)狀紋路。蘭科植物種子微小，自然狀態(tài)下隨水或風(fēng)四處傳播，其雙層種皮的特殊結(jié)構(gòu)，使蘭科植物種子在嚴(yán)苛的自然環(huán)境下能長期保持活力［17］，種子致密的內(nèi)種皮結(jié)構(gòu)影響了胚體對水分和養(yǎng)分的吸收，致使其在自然狀態(tài)下萌發(fā)困難［16］。因此，春劍種子的雙層種皮結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致其難以萌發(fā)的原因之一。

春劍種子微小，形態(tài)與蒴果相似，呈梭形，種子結(jié)構(gòu)簡單，由種皮和未分化的種胚組成，且內(nèi)外種皮之間有明顯空氣腔，與多數(shù)蘭花種子形態(tài)［9］相似。電鏡掃描觀察到種子的外種皮細(xì)胞之間排列緊密，沒有間隙，該結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致種子的不透水性和影響外界養(yǎng)分進(jìn)入種子，阻礙萌發(fā)。此外，春劍種子的種胚體積微小，所能貯藏的養(yǎng)分含量極少，難以滿足種子萌發(fā)過程中系列生理變化的養(yǎng)分需求，因此，自然狀態(tài)下春劍種子的萌發(fā)率較低。