不同載體和農(nóng)桿菌對苜蓿瞬時表達影響的研究

孫 敏 楊紅紅 王安琪 張悅婧 達曉偉 張 繼，2孫 坤 吳建平，2 馮漢青，2*

（1.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070； 2.西北師范大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，蘭州 730070）

在植物中表達外源基因主要有2種方法：第一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，即將外源基因整合到植物基因組中，并通過篩選和鑒定形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株［1］。第二種是通過農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的瞬時表達技術(shù)在植物中快速表達目的基因，即將目的基因整合到農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒的T-DNA 中，通過農(nóng)桿菌對植物體細胞的侵染使T-DNA 轉(zhuǎn)移到植物細胞核中；盡管大部分轉(zhuǎn)入的T-DNA 并未整合到植物基因組中，但外源基因可在短期內(nèi)借助植物細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進行表達［2-3］。因此，與第一種方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達技術(shù)節(jié)省了篩選、鑒定和子代遺傳等步驟，能夠在短期內(nèi)在植物中表達外源基因［2］。目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時基因表達技術(shù)已成為研究植物基因功能和蛋白質(zhì)定位的有力工具，而且通過該技術(shù)可以以植物為生物反應(yīng)器快速完成藥用蛋白、抗體、抗原的生產(chǎn)，因此該技術(shù)也具有重要的應(yīng)用價值［4-5］。

苜蓿（Medicago sativa）是世界上除了大豆外種植量最多的豆科植物［6］，其地上部分產(chǎn)量高，營養(yǎng)價值豐富，適口性好，是動物的優(yōu)良飼料，被譽為“牧草之王”［6-7］。一方面，對苜蓿中基因功能等理論問題的深入研究需要借助外源基因轉(zhuǎn)化和表達技術(shù)；另一方面，依托苜蓿的飼草功能，在苜蓿中轉(zhuǎn)入動物疾病相關(guān)的抗原或抗體可制備動物的口飼疫苗［8］，可進一步提升苜蓿的利用價值。因此，如何在苜蓿中進行快速有效的基因轉(zhuǎn)化已成為相關(guān)研究的重點問題。

目前，已有諸多課題組對苜蓿進行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的研究，其主要策略是通過攜帶外源基因的農(nóng)桿菌對苜蓿的葉片［9-11］、花［12］、根［13］、子葉或下胚軸［14］進行轉(zhuǎn)染，并通過外植體再生獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的苜蓿植株。通過上述策略，有效提高了苜蓿的農(nóng)藝學(xué)性狀或增加了苜蓿的應(yīng)用價值。例如，Wang 等［15］將IbOr 基因轉(zhuǎn)入苜蓿中使其穩(wěn)定過表達，從而增加了苜蓿中類胡蘿卜素的積累量并提高了苜蓿對多種非生物脅迫的抗性。Ullah 等［16］將無花果曲霉（Aspergillus ficuum）中的磷酸單酯酶編碼基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化苜蓿，由此實現(xiàn)了通過苜蓿進行磷酸單酯酶的生產(chǎn)。但是，上述的過程通常需6個月以上，整個周期較為漫長，且涉及到轉(zhuǎn)化、篩選、植株再生等多個環(huán)節(jié)，技術(shù)步驟相對繁瑣［9］。其次，通過上述方法對苜蓿進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化也受到苜蓿品種的限制。已有諸多工作表明不同苜蓿品種的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率、外植體再生能力，乃至外植體對培養(yǎng)基的敏感度均和苜蓿品種有關(guān)，其原因可能在于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化過程中外植體的形成、植株的再生能力等均會受到苜蓿品種基因型的影響［10-11，14，17］。因此，在苜蓿中進行外源基因的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化受到多種因素的制約，無法有效滿足目前對苜蓿理論和應(yīng)用研究的需求。

如上文所述，與穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化相比，植物瞬時表達可在短期內(nèi)實現(xiàn)外源基因的表達。但目前如何在苜蓿中有效地進行外源基因的瞬時表達并提高其表達量尚缺乏相應(yīng)的研究。從生物學(xué)的角度講，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因瞬時表達是一系列復(fù)雜生物學(xué)事件的結(jié)果，包括了農(nóng)桿菌對植物組織的侵染、外源基因?qū)χ参锘虮磉_系統(tǒng)的利用，以及蛋白質(zhì)生物合成和在組織中的積累等［18］。因此，農(nóng)桿菌的類型和濃度、外源基因的拷貝數(shù)，以及外源基因表達的時間性等因素是決定外源基因進行有效的瞬時表達及其表達量的關(guān)鍵因素。

鑒于以上原因，本研究以綠色熒光蛋白（GFP）基因作為報告基因，以非復(fù)制型和復(fù)制型載體為不同類型的表達載體，非復(fù)制型表達載體缺乏在植物細胞中進行復(fù)制的能力；復(fù)制型表達載體是基于菜豆黃矮病毒構(gòu)建的表達載體，可以通過滾環(huán)復(fù)制機制在植物細胞中快速復(fù)制形成多拷貝［19-20］，以LBA4404 和EHA105 為不同類型的農(nóng)桿菌菌株，研究了表達載體類型、農(nóng)桿菌菌株類型、農(nóng)桿菌濃度、侵染后孵育時間等要素對苜蓿葉片瞬時表達的影響，并以本氏煙草（Nicotiana benthamiana）作為對比以期建立高效的苜蓿瞬時基因表達技術(shù)，為相關(guān)工作提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

苜蓿的培養(yǎng)：將苜蓿種子（中苜一號，購自江蘇沐陽鼎盛種業(yè)有限公司）在25 ℃蒸餾水中浸泡12 h 后，置于用蒸餾水潤濕的雙層紗布中，在光照下孵育6 h。用蒸餾水沖洗種子，并在23 ℃黑暗條件下用單層紗布覆蓋2～3 d（期間用蒸餾水保持紗布濕潤）。將萌發(fā)的種子移植到培養(yǎng)基質(zhì)中（體積比為2∶1 的營養(yǎng)土和蛭石的混合物），并在25 ℃、濕度為50%、16 h 光照/8 h 黑暗的環(huán)境中培養(yǎng)至2周齡時用于農(nóng)桿菌侵染。

本氏煙草的培養(yǎng)：將育苗塊（購買于上海尚新園藝有限公司）放入托盤中，用蒸餾水浸泡2～3 h，使育苗塊充分吸收水分，每個育苗塊種植2～3 粒本氏煙草種子，用透明塑料蓋覆蓋托盤，并將其置于25 ℃、濕度為50%、16 h 光照/8 h 黑暗的環(huán)境中培養(yǎng)。生長2周后，移除塑料蓋，每2天對植株施用1次14.8 g·L-1的營養(yǎng)液（Jack’s fertilizer），繼續(xù)在上述條件下培養(yǎng)至4 周齡時移苗以提供充足的空間繼續(xù)生長，將5周齡的植株用于農(nóng)桿菌的侵染。

1.2 農(nóng)桿菌的構(gòu)建

非復(fù)制型表達載體（pBIN+-GFP-HA，詳見Rairdan 等［21］）由Bouwmeester 教 授（Wageningen University）饋贈；基于BeYDV（Bean yellow dwarf virus，菜豆黃矮病毒）的復(fù)制型載體（pBYR2，詳見Chen等［19］）由Mason 教授（Arizona State University）饋贈（以下簡稱為“復(fù)制型載體”）。在2 種載體的35S啟動子下游構(gòu)建綠色熒光蛋白基因作為報告基因，并將2 種載體分別轉(zhuǎn)入LBA4404 和EHA105 農(nóng)桿菌菌種中，用50 mg·L-1卡那霉素、25 mg·L-1利福平和25 mg·L-1氯霉素篩選LBA4404 陽性克?。挥?0 mg·L-1卡那霉素和25 mg·L-1利福平篩選EHA105陽性克隆。繼而產(chǎn)生4 種載體/農(nóng)桿菌組合：1 revector/LBA4404（攜帶復(fù)制型載體的LBA4404 菌株）；2 non-re-vector/LBA4404（攜帶非復(fù)制型載體的LBA4404 菌株）；3 re-vector/EHA105（攜帶復(fù)制型載體的EHA105 菌株）；4 non-re-vector/LBA4404（攜帶非復(fù)制型載體的EHA105菌株），并用于以下試驗。

1.3 菌懸液的制備

將攜帶復(fù)制性和非復(fù)制性的LBA4404 菌株分別接種于含有50 mg·L-1卡那霉素、25 mg·L-1利福平和25 mg·L-1氯霉素的YEB 瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，在28℃下生長2 d；將攜帶上述載體的EHA105菌株接種于含有50 mg·L-1卡那霉素（Kana）和25 mg·L-1利福平（Rif）的YEB 瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，在28 ℃下生長2 d。從YEB培養(yǎng)基上挑取單菌落接種到含有相同篩選抗生素的50 mL YEB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃下振蕩（180 r·min-1）培養(yǎng)24 h［22］。5 000 r·min-1離心10 min 收集細菌，用侵染緩沖液（10 mmol·L-1MES-KOH，pH=5.5、10 mmol·L-1硫酸鎂、100 μmol·L-1乙酰丁香酮）洗滌2次。將農(nóng)桿菌重懸于50 mL 侵染懸浮液中，通過測量600 nm 處的光密度（OD）確定細菌濃度。將農(nóng)桿菌菌液利用侵染緩沖液稀釋至7 個不同的濃度（OD600=0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5）用于苜蓿葉片的侵染；將農(nóng)桿菌菌液利用侵染緩沖液稀釋至5個不同的濃度（OD600=0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）用于本氏煙草葉片的侵染。分別在侵染后的第3、5、7、9天進行檢測與分析，以未進行轉(zhuǎn)化的LBA4404和EHA105為對照。

1.4 植物瞬時轉(zhuǎn)化

選取大小、長勢均勻的5周齡本氏煙草植株和2周齡的苜蓿植株，用針頭在葉片背面的表皮上刺出1 個小口，用無菌注射器吸取2 mL 農(nóng)桿菌懸液，通過無針注射口將菌懸液通過下表皮傷口注入葉片進行注射侵染［23］。侵染后在25 ℃、濕度為50%、16 h 光照/8 h 黑暗的培養(yǎng)環(huán)境中孵育培養(yǎng)，并在所需時間點（見上）取樣觀測。

1.5 綠色熒光蛋白（GFP）熒光的檢測和分析

將植物葉片置于熒光體式顯微鏡（徠卡M205 FA，德國）下，用450～490 nm 的激發(fā)波長激發(fā)，在500～550 nm 的發(fā)射波長區(qū)間檢測GFP 釋放光；用Image J軟件分析GFP熒光表達強度［24］。所得數(shù)值至少為3 次獨立試驗的平均值，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準差表示。使用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用Excel 作圖，以P＜0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同表達載體及農(nóng)桿菌菌株對苜蓿和本氏煙草葉片瞬時表達的影響

本研究在農(nóng)桿菌侵染菌液濃度以及侵染后植株孵育時間（即侵染后植株生長時間，以下簡寫為dpi）均相同的情況下（侵染菌液濃度為OD600=0.8，侵染后孵育時間為7 d），比較了4 種載體/農(nóng)桿菌組合對苜蓿葉片的瞬時轉(zhuǎn)化效果的區(qū)別。如圖1～2所示，re-vector/LBA4404侵染苜蓿葉片后，GFP明顯表達；而在用non-re-vector/LBA4404侵染苜蓿葉后，沒有檢測到GFP 的表達。當(dāng)用re-vector/EHA105 和non-re-vector/LBA4404 侵染苜蓿葉后，均沒有檢測到GFP 的表達。因此，以上觀察顯示，僅攜帶復(fù)制載體的LBA4404菌株能夠在苜蓿葉中實現(xiàn)外源基因的瞬時表達。

圖1 不同表達載體及農(nóng)桿菌菌株對苜蓿葉片GFP 表達量的影響不同小寫字母代表在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異（P＜0.05），下同。Fig.1 Different expression vectors and A. tumefaciens strains on expression level of GFP in alfalfa leaves Different letters on top of the bars indicated significant difference（sP＜0.05），the same below.

圖2 苜蓿葉片中代表性GFP表達情況Fig.2 Representative expression of GFP in alfalfa leaves

以上在苜蓿中的結(jié)果提示了LBA4404 能夠介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)化，且需要較高的基因拷貝以形成有效的外源基因的表達。同時，以上觀察也提示了另一問題，即這種現(xiàn)象可能也和苜蓿這種特定的植物種類有關(guān)。因此，將上述4 種的載體和菌株的組合對本氏煙草葉片進行了侵染，以判斷所觀察到的現(xiàn)象和植物種類的可能聯(lián)系（圖3～4）。結(jié)果表明，和苜蓿中的結(jié)果不同，4 種載體和菌株的組合均可在本氏煙草葉片形成GFP 的明顯表達。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，在用LBA4404 侵染的本氏煙草葉片后，復(fù)制型載體介導(dǎo)的GFP 表達水平比非復(fù)制型載體高約5 倍；但在用EHA105 侵染的本氏煙草葉中，復(fù)制型和非復(fù)制型載體介導(dǎo)的GFP 表達水平無顯著差異。以上結(jié)果表明，在瞬時轉(zhuǎn)化過程中表達載體、農(nóng)桿菌，以及植物之間存在著一定的依賴于種類的相互作用關(guān)系。

圖3 不同表達載體及農(nóng)桿菌菌株對本氏煙草葉片GFP表達量的影響Fig.3 Different expression vectors and A. tumefaciens strains on expression level of GFP in N. benthamiana leaves

圖4 本氏煙草葉片中代表性GFP表達情況Fig.4 Representative expression of GFP in N. benthamiana leaves

2.2 不同濃度的的re-vector/LBA4404 對苜蓿葉片瞬時表達的影響

如上研究結(jié)果所示，較之其他載體和菌株的組合，re-vector/LBA4404 能夠在苜蓿葉中有效實現(xiàn)GFP的瞬時表達，本文進一步研究了不同濃度的revector/LBA4404菌懸液（OD600=0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5）對苜蓿葉中GFP瞬時表達的影響（圖5～6）。結(jié)果顯示，隨著re-vector/LBA4404侵染菌液濃度的增加，GFP表達水平呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢：revector/LBA4404菌懸液濃度在0.2到1.0（OD600）這一區(qū)間增加時，苜蓿葉片中GFP 的表達水平隨著LBA4404濃度的增加而增加。re-vector/LBA4404濃度為1.2和1.5時，GFP表達較之LBA4404濃度為1.0時有一定程度的降低。綜上，re-vector/LBA4404菌株在濃度為1.0時苜蓿葉片中GFP表達量最高。

圖5 不同re-vector/LBA4404 侵染菌液濃度對苜蓿葉片中GFP表達量的影響Fig.5 Different re-vector/LBA4404 infect bacteria liquid concentration on the GFP expression level in alfalfa leaves

圖6 苜蓿葉片中代表性GFP表達情況Fig.6 Representative expression of GFP expression level in alfalfa leaves

以本氏煙草葉片為對比發(fā)現(xiàn)（圖7～8），re-vector/LBA4404菌懸液濃度為0.4（OD600）時，本氏煙草葉片中GFP 瞬時表達水平最高；LBA4404 濃度的進一步增加導(dǎo)致GFP 瞬時表達水平有所降低。以上對比結(jié)果表明，相較于本氏煙草葉片，在苜蓿中實現(xiàn)最高水平的瞬時轉(zhuǎn)化需要更多的農(nóng)桿菌。

圖7 不同re-vector/LBA4404 侵染菌液濃度對本氏煙草葉片GFP表達量的影響Fig.7 Different re-vector/LBA4404 infect bacteria liquid concentration on the GFP expression level in N.benthamiana leaves

2.3 攜帶復(fù)制型載體的LBA4404 菌株侵染后不同孵育時間對苜蓿葉片瞬時表達的影響

進一步研究了在re-vector/LBA4404 侵染后不同的dpi對苜蓿葉片瞬時表達的影響（見圖9～10）。觀察發(fā)現(xiàn)，在菌懸液濃度較低（包括OD600值為0.2、0.4、0.6）的情況下，dpi 從3 d 增加至5 d 能夠小幅提升GFP 的表達水平；而dpi從3 d增加至7 d則大幅度提升了GFP 的表達水平，并在dpi 為7 d 時達到峰值；dpi 的進一步增加使得GFP 的表達水平較之峰值有所下降。菌懸液處于中度濃度（包括OD600值為0.8、1.0）時，dpi 從3 d 增加至5 d 即可大幅提升GFP 的表達水平，dpi 至第7 天時GFP 表達水平達到峰值；此后GFP 的表達水平隨dpi增加有所降低。菌懸液處于較高濃度（包括OD600值為1.2、1.5）時，dpi 從3 d 增加至5 d 即使得GFP 表達水平并達到峰值，dpi 為7、9 d 時GFP 的表達水平均較峰值有所降低。

圖9 農(nóng)桿菌侵染后不同孵育時間對苜蓿葉片中GFP表達量的影響Fig.9 Effect of different incubation time on GFP expression in alfalfa leaves after infection with A. tumefaciens strains

通過比較不同dpi 對本氏煙草葉片GFP 表達的影響發(fā)現(xiàn)（見圖11～12），在re-vector/LBA4404 菌懸液濃度為0.2、0.4、0.6 或1.0（OD600）時，dpi 為5 d時本氏煙草葉片中GFP 表達水平最高；LBA4404濃度為0.8（OD600）時，dpi 為7 d 時本氏煙草葉片中GFP 表達水平最高。綜上觀察表明，苜蓿和本氏煙草中dpi 為5 d 或7 d 時GFP 瞬時表達水平最高。

圖11 農(nóng)桿菌侵染后不同孵育時間對本氏煙草葉片中GFP表達量的影響Fig.11 Effect of different incubation time on GFP expression in N. benthamiana leaves after infection with A. umefaciens strains

圖12 農(nóng)桿菌侵染后不同孵育時間下本氏煙草葉片中GFP表達情況Fig.12 GFP expression in N. benthamiana leaves after infection with A. tumefaciens strains at different incubation time

3 討論

目前，在擬南芥和煙草等模式植物中利用瞬時表達揭示了諸多基因的功能和蛋白質(zhì)的定位。如上文所述，苜蓿是重要的動物飼草，利用瞬時表達在苜蓿中進行基因轉(zhuǎn)化不僅有助于快速揭示苜蓿中的一些理論問題，也可通過轉(zhuǎn)入動物疾病相關(guān)的抗原或抗體編碼基因來制備動物的口飼疫苗。但是，在苜蓿中進行瞬時表達的研究尚不多見；并且，如何有效提升苜蓿中外源基因的瞬時表達水平更是鮮有報道。

本研究利用攜帶非復(fù)制型和復(fù)制型載體的LBA4404和EHA105對苜蓿葉片進行侵染。其中，復(fù)制型表達載體是基于菜豆黃矮病毒構(gòu)建的表達載體，其在植物細胞中可以通過滾環(huán)復(fù)制機制形成多拷貝。觀察發(fā)現(xiàn)，僅僅攜帶復(fù)制型載體的LBA4404 能夠在苜蓿中進行GFP 的瞬時表達（圖1～2）；這表明，在苜蓿中進行外源基因的瞬時表達需要特定的農(nóng)桿菌，并且外源基因拷貝數(shù)的增加能夠有效提高苜蓿中瞬時表達的水平。相似的是，較之其他載體和農(nóng)桿菌的組合，在本氏煙草中re-vector/LBA4404 也介導(dǎo)了最高的GFP 表達量（圖3～4），其表達水平高于苜蓿。以前的研究表明，不同的植物種類對于農(nóng)桿菌的敏感性不同［25］。因此推測，苜蓿和本氏煙草對于LBA4404 農(nóng)桿菌的敏感性的差異可能導(dǎo)致了成功侵染2 種植物的農(nóng)桿菌的數(shù)量不同，并繼而影響了后續(xù)的T-DNA的轉(zhuǎn)運和外源基因的表達等。另外我們也注意到，盡管攜帶非復(fù)制型和復(fù)制型的EHA105無法在苜蓿中介導(dǎo)GFP 的表達，但其可以在本氏煙草中實現(xiàn)GFP 的表達，而且攜帶非復(fù)制型和復(fù)制型的EHA105 侵染本氏煙草葉后并沒有出現(xiàn)GFP 表達水平的顯著差異（圖3～4）。一方面，這一觀察提示了EHA105 可能無法有效地對苜蓿進行有效的侵染，進一步體現(xiàn)了苜蓿和本氏煙草對農(nóng)桿菌的敏感性的差異；另一方面，這一觀察也表明復(fù)制型載體能否通過增加外源基因拷貝數(shù)提高植物瞬時表達的水平和農(nóng)桿菌的類型具有重要的聯(lián)系，這種聯(lián)系只是由于苜蓿對EHA105 的不敏感性而無法被體現(xiàn)。綜上，這些觀察反映了在瞬時轉(zhuǎn)化過程中不同的表達載體、農(nóng)桿菌，以及植物之間存在著特定的相互關(guān)系或協(xié)同作用，并最終決定了植物中外源基因是否能夠有效表達以及表達水平。

由于攜帶復(fù)制型載體的LBA4404 在苜蓿中均形成了最高的外源基因表達量。因此，本文進一步研究了re-vector/LBA4404 菌懸液濃度和侵染后孵育時間對苜蓿中GFP 瞬時表達的影響。結(jié)果表明，隨著re-vector/LBA4404 菌懸液濃度或侵染后孵育時間的增加，GFP 瞬時表達水平并未表現(xiàn)出簡單的線性增加，而是呈先升后降的趨勢；在菌懸液濃度為1.0（OD600）且dpi 為7 d 時苜蓿葉片中GFP表達水平最高（圖5～6、9～10）。這種變化趨勢的原因可能是多方面的。首先，農(nóng)桿菌對于植物具有一定的毒性；這種毒性，尤其是農(nóng)桿菌在植物中達到較高豐度時，能夠抑制植物的光合、呼吸以及其他的代謝過程［26］。因為蛋白質(zhì)的表達依賴光合、呼吸以及礦物質(zhì)代謝為其提供底物和能量［27］；因此，過高濃度的菌液或過長的侵染后孵育時間有可能通過抑制植物的代謝而減少了外源基因表達產(chǎn)物的積累水平。其次，表達載體中的一些必要組件的表達產(chǎn)物也可能對植物細胞產(chǎn)生影響。本研究使用的基于BeYDV 的復(fù)制型載體中，Rep和RepA 組件對于該載體的復(fù)制是必需的。但是，Rep和RepA的表達產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)植物細胞死亡［28］。因此，過高濃度的菌液或過長的侵染后孵育時間也有可能導(dǎo)致了更多植物細胞的死亡，從而降低了植物表達蛋白的能力或?qū)е铝烁嗨磉_的蛋白質(zhì)被降解。因此，除了農(nóng)桿菌和載體外，適當(dāng)?shù)木簼舛群颓秩竞蠓跤龝r間也是獲得外源基因最高水平的表達的關(guān)鍵因素。

我們也注意到，對于苜蓿和本氏煙草，最高的GFP 表達水平所對應(yīng)的最佳菌懸液濃度或侵染后孵育時間均有所不同。在苜蓿中，LBA4404 菌懸液濃度為1.0（OD600）、dpi 為7 d 時苜蓿葉片中GFP表達水平最高；在本氏煙草中，當(dāng)LBA4404菌株的濃度為0.4（OD600）且dpi 為5 d 時，GFP 瞬時表達水平最高（圖5～12）。綜合分析表明，苜蓿中實現(xiàn)最高的GFP 表達水平需要的最佳菌懸液濃度和最佳侵染后孵育時間均高于本氏煙草。

盡管較之通常使用的本氏煙草，苜蓿的瞬時轉(zhuǎn)化看上去需要更多的農(nóng)桿菌和更長的時間，但本氏煙草中含有的尼古丁等成癮性物質(zhì)限制了轉(zhuǎn)基因本氏煙草在畜牧等領(lǐng)域的應(yīng)用。作為重要的飼草，苜蓿不含成癮性物質(zhì)，且種植面積大。因此，在苜蓿中進行外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化有助于提高苜蓿這種重要飼草的理論研究水平和應(yīng)用價值。目前，大多數(shù)實驗室采用體細胞胚胎發(fā)生及植株再生策略對苜蓿進行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，即先對苜蓿器官或組織進行轉(zhuǎn)化，再通過篩選、外植體培養(yǎng)、植株再生等過程獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的苜蓿植株［3，10］。但該過程耗時費力，且轉(zhuǎn)化效率受到器官（或組織）類型、品種等多種因素的制約；而且苜蓿的異交性質(zhì)使所獲得的轉(zhuǎn)基因植株可能在田間出現(xiàn)所轉(zhuǎn)入的基因丟失、漂移等問題，以及公眾對轉(zhuǎn)基因安全性的關(guān)注［17，29］。盡管無法形成能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因苜蓿，本研究所用的瞬時表達技術(shù)避免了苜蓿穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化中的篩選、再生等冗長過程，可以在1 周左右即實現(xiàn)目的基因的高效表達，且由于所轉(zhuǎn)化的基因不存在可遺傳性，也避免了基因丟失、漂移等問題。這特別適合短期內(nèi)在苜蓿中進行目的基因功能的驗證以及在苜蓿中快速合成利于養(yǎng)殖的重組蛋白（如動物疾病相關(guān)的抗原或抗體）。近期，吳艷菊等［30］利用真空侵染法在苜蓿發(fā)芽種子中進行了GUS（β-葡萄糖苷酸酶編碼基因）的瞬時表達。但在理論和實際應(yīng)用中，苜蓿的葉片通常為主要的研究對象及飼料的主要來源；而在苜蓿葉片中進行外源基因瞬時表達的研究尚鮮有報道。因此，本研究所得結(jié)果有助于建立高效的苜蓿葉片的瞬時表達體系，進一步為苜蓿的理論研究和應(yīng)用等相關(guān)工作提供方法和參考。