3 種植物浸提液對銅綠微囊藻化感效應研究

蔡鴻嬌，馮少貽，林 茂，潘承麗，李忠琴，錢瑞芳

(1.集美大學水產(chǎn)學院，廈門市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；2.惠安縣鑫海水產(chǎn)科技有限公司，福建 泉州 362131)

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)為常見引發(fā)水華的藍藻之一。藍藻的大量繁殖爭奪水體溶氧，導致水生動物大量死亡，水體惡臭。浮藻繁殖旺盛、覆蓋水面從而阻礙水生植物的光合作用，造成水生植物逐漸死亡(李祎等，2022)；藍藻死亡后釋放有毒物質(zhì)——藍藻毒素，會對水生動物產(chǎn)生危害，因此防治藍藻水華、維持生態(tài)平衡刻不容緩。

常見的藍藻防治方法分為物理、化學和生物法3類。物理除藻如超聲波控藻、遮光抑藻，雖然環(huán)保經(jīng)濟，但是耗費時間長、野外操作困難而且花費大；化學藥劑除藻雖然見效快，但是化學藥劑殘留會導致生態(tài)安全風險，其應用受到限制；生物方法主要利用魚、菌、水生植物之間相互作用關(guān)系直接或間接抑藻，雖然生態(tài)友好，但是后期管理復雜且用時較長(胡利靜等，2016；Ghernaout D，2013)。研究表明有些植物的浸提液可以控藻，比如稻草秸稈、菊科植物(劉燕婷，2011；張庭廷等，2021)。從不同植物中已提取、分離和鑒定出多種對淡水藻類起抑制或促進作用的活性物質(zhì)，包括單酚、多酚、胺類、有機酸、醌類、黃酮類、萜類、酯類、芳香族化合物和其他一些種類，但是植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)具有選擇性抑藻特性，不同化感物質(zhì)的抑藻機理不盡相同(謝樹蓮等，2017)。

藍藻細胞中的葉綠素a和藻膽素是主要光合色素，藻膽素常與蛋白質(zhì)結(jié)合為藻膽蛋白，主要包括藻藍蛋白(PC)、藻紅藍蛋白(PEC)和別藻藍蛋白(APC)。本研究通過測定藻細胞密度和光合細胞相關(guān)蛋白含量變化，研究植物次生物質(zhì)不同濃度對藻細胞生長的影響，以探究植物提取物控藻機理。本文選擇3 種植物馬纓丹、蟛蜞菊和羊蹄甲，研究分析其提取物對藍藻細胞生長抑制效果，旨在為生物除藻提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.微藻培養(yǎng)基

銅綠微囊藻采用常規(guī)的微藻培養(yǎng)基BG-11。稱取0.85克BG-11培養(yǎng)基，量取500毫升純水，置于1升錐形瓶、120℃下高壓滅菌20分鐘，備用。

2.植物提取液制備

將采摘的馬纓丹、蟛蜞菊、羊蹄甲植物葉片用清水沖洗干凈并晾干，再在烘箱60℃下烘干，然后用粉碎機粉碎成粉末(何書婷等，2017)。分別將3種植物葉片粉末100克置于錐形瓶中，按照料液比1∶10 加入乙醇，于20℃、150 轉(zhuǎn)/分條件下振蕩72 小時，再用4 層紗布過濾；接著用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸(100千帕、60℃)濃縮至膏狀。之后用50%乙醇配成0.2、0.4、0.8 克/毫升3 個濃度梯度的待用溶液，置于4℃冰箱中備用。

3.藻種培養(yǎng)及植物提取液作用

藻種液與BG-11 培養(yǎng)基的接種配比為1∶10，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為3 000勒克斯，光照12 小時/天，每天上午與下午各搖動1 次(王捷等，2014)，培養(yǎng)1周備用。

30份80毫升的BG-11培養(yǎng)基中各加入1毫升銅綠微囊藻培養(yǎng)藻液，再分別加入含蟛蜞菊、馬纓丹、羊蹄甲0.2、0.4、0.8 克/毫升3 種濃度梯度的植物浸提液1 毫升，每個濃度梯度設置3 個重復，并設置1個空白組。加樣完畢后放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 天，分別在實驗第1、3、5、7、9 天取樣測定銅綠微囊藻密度、葉綠素a 含量，在第10天測定藻膽蛋白含量。

4.微藻生物量測定

以崔研等(2012)藻生物量的測定方法為參考，確定銅綠微囊藻回歸曲線。吸取藻液于計數(shù)板、置于顯微鏡下進行細胞計數(shù)，重復3次取平均值。銅綠微囊藻細胞初始密度為7.75×106個/毫升，將初始藻液與純水按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 的比例稀釋為9個不同濃度，用酶標儀測定包括初始藻液在內(nèi)的10 個不同濃度的光密度。根據(jù)光密度與藻細胞密度計算回歸曲線。

吸取每個實驗樣品100 微升于96 孔板酶標板中測定波長440納米處的吸光度，再通過線性回歸方程將吸光度轉(zhuǎn)換成為銅綠微囊藻的生物量。

5.葉綠素a含量測定

參考徐志飛等(2019)葉綠素a測定方法，吸取藻液5 毫升于10 毫升的離心管，離心機4 500 轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，倒掉上清液后在-20℃下進行冷凍，第2 天用水浴鍋將乙醇加熱至50～60℃，取4毫升乙醇，加入低溫冷凍的銅綠微囊藻，水浴加熱2分鐘，放在遮光處暗反應6小時取出，用乙醇定容10 毫升，4 000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，取上清液于5 毫升離心管備用。在630、645、663、750 納米波長下用紫外分光光度計測定上清液的吸光度(以BG-11培養(yǎng)基作為空白對照)，再計算葉綠素a含量(微克/毫升)。

6.藻膽蛋白測定

參考戴立洲等(2015)方法，第10 天取5 毫升藻液離心，4 500轉(zhuǎn)/分離心7分鐘，倒掉液體留下藻泥，加入配制好的冷磷酸緩沖液5 毫升于-20℃的冰箱中過夜。在常溫下溶解，反復進行冷凍與溶解操作3 次，將液體轉(zhuǎn)移至5 毫升離心管離心，以12 000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，取上清液測其在565、620、650納米波長處的OD值，再計算藻膽蛋白含量(毫克/毫升)。

二、結(jié)果與分析

1.銅綠微囊藻細胞密度線性回歸方程

測定結(jié)果顯示光密度(吸光值)在0.1～0.7，銅綠微囊藻液藻密度線性回歸方程為：Y＝0.0644X＋0.0584(R2＝0.996 3)，Y 是用酶標儀在440 納米的波長所測得的藻液吸光度值，X 為銅綠微囊藻的細胞生物量(106個/毫升)。隨著藻細胞密度的增加，吸光值增加。

2.不同濃度浸提液對銅綠微囊藻細胞密度生長的影響

3種植物浸提液對藻細胞繁殖均有明顯的抑制效果，其中前3天蟛蜞菊和羊蹄甲浸提液對藻繁殖抑制速度最快，馬纓丹較為緩慢(表1)。雖然前期馬纓丹浸提液的抑制效果較差，但是在第9天3種植物浸提液均能有效抑制藻的生長。

表1 3種植物浸提液對銅綠微囊藻細胞密度的影響

蟛蜞菊浸提液第1天隨著濃度的增加藻細胞密度增加，但是隨后數(shù)天高濃度浸提液組的抑制效果比低濃度好，最終效果趨向一致，不同濃度組間差異不顯著，藻密度最低為0.13×106個/毫升。

雖然羊蹄甲低濃度浸提液對藻生長抑制效果比高濃度好，但是兩者之間在第9 天沒有顯著差異。馬纓丹浸提液高濃度組在開始階段藻細胞密度顯著高于低濃度組，但是在第5～7 天顯著低于低濃度組(P＜0.05)。

3.不同植物浸提液對銅綠微囊藻葉綠素a 的影響

3種植物浸提液均能顯著降低銅綠微囊藻葉綠素a 含量(P＜0.05)，其中蟛蜞菊浸提液處理組在初始數(shù)天葉綠素a含量的下降速度明顯高于其他兩種植物，馬纓丹浸提液對葉綠素a的抑制效果比較緩慢。

4.不同植物浸提液對藻膽蛋白的影響

藻膽蛋白可分為藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白，本實驗測定結(jié)果顯示在處理后的第10 天3種植物浸提液對藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白均有顯著抑制作用。

三、討論

化感物質(zhì)被認為是抑制藻類生長的主要原因，植物釋放的化學物質(zhì)對其周圍的生物產(chǎn)生有益或者有害影響、促進或者抑制周邊植物或者微生物的生長發(fā)育現(xiàn)象被稱為化感作用?；形镔|(zhì)可能存在于植物各個器官，包括葉、花、果實、根、莖等。化感抑制作用是由多種化感物質(zhì)共同作用產(chǎn)生的生理過程，從而改變植物的生長方式(Ana B，2010)。本研究通過觀察藻細胞增殖過程，結(jié)果顯示3 種植物浸提液均顯著抑制藻細胞繁殖。

有關(guān)化感作用的研究較多集中在對微生物細菌、真菌的抑制效果以及雜草防控、農(nóng)作物培育、 植物病害治理等方面(Jeyasankar A，2014)，而利用植物化感物質(zhì)抑制藻類生長研究相對較少。有學者認為植物本身可以產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，再通過揮發(fā)此類物質(zhì)來促進或者抑制其他植物的生長(汪小雄，2016)，比如馬纓丹對黑麥草、水葫蘆、藍藻、熱帶豆科牧草的生長影響；柱花草有化感作用，能在不同程度上抑制雜草或藻類生長(李玉霞等，2019)。表現(xiàn)出對藻類抑制或促進增殖的效果與濃度有一定相關(guān)性，因此濃度閾值現(xiàn)象在一些研究中有所呈現(xiàn)，對藻類的抑制效果并不是隨著濃度的增加而增加的線性關(guān)系，比如蟛蜞菊水提液對卵孢金孢藻具有低濃度促進高濃度抑制的作用(杜彩麗等，2019)。植物提取液對藻細胞的抑制作用與藻細胞初始接種密度有密切關(guān)系，低接種密度時抑制率極高，隨著接種密度的升高抑制率下降；接種密度極高時，提取物不但不會抑制甚至還會促進藻細胞的生長(祁茜等，2019)。藻類的生長還涉及水體營養(yǎng)、溶氧、酸堿度等，在化感物質(zhì)的干涉下導致水質(zhì)的變化也是影響藻細胞繁殖的因素。

藻膽蛋白是一種天然色素熒光蛋白，輔助藻膽體捕獲光能，與葉綠素a一樣可以利用光能進行光合作用，影響藍藻繁殖生長(Daginno L J，2022)。本次研究結(jié)果表明，3 種植物浸提液均能顯著降低葉綠素a和藻膽蛋白含量；植物浸提液通過降解藻膽蛋白、減少光合作用抑制藻類生長。綜上，本研究為開發(fā)植物源生物抑藻提供科學依據(jù)，利用植物次生物質(zhì)作用抑藻具有經(jīng)濟安全等優(yōu)點，如果對入侵性植物加以利用，更是化害為利。