尿液NGAL、KIM-1、TFF3聯(lián)合檢測對肝硬化患者急性腎小管壞死的診斷價值

龔艷清,趙 瑩,賈艷會,李 熳,江 勇

龔艷清,趙瑩,李熳,江勇,天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內(nèi)科 天津市 300211

賈艷會,天津市第三中心醫(yī)院檢驗科 天津市 300100

0 引言

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)在住院的肝硬化患者發(fā)病率可達19%-20%,與患者預后不良相關,死亡率極高[1,2],主要分為腎前性氮質血癥(prerenal azotemia,PRA)、肝腎綜合征急性腎損傷型(hepatorenal syndrome-AKI,HRS-AKI)和急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)三種類型,對于不同類型AKI的鑒別尤其對于結構性腎損傷ATN的鑒別仍是選擇有效治療方式及改善預后的重要因素,也是臨床亟待解決的問題,因為ATN預后最差,嚴重的ATN需腎臟代替治療,若在疾病早期錯誤的判斷為PRA及HRS-AKI,可能錯誤的選擇大量擴容或血管收縮劑的治療,對ATN無效,容易錯過治療時機,造成不可逆的腎功能損傷,增加醫(yī)療負擔提升死亡率,因此,早期鑒別ATN對于選擇正確的治療時機和措施十分重要.

然而,目前尚無鑒別肝硬化患者ATN的無創(chuàng)診斷方法,現(xiàn)有的無創(chuàng)手段是基于一些尿液生物標志物,包括尿鈉濃度、尿白蛋白(Albumin)或尿鈉排泄分數(shù)(FeNa)[3]等,準確性較低.在國際腹水俱樂部2015年指南(revised consensus recommendations of the International Club of Ascites,ICA2015)[4]中,AKI仍然是根據(jù)血清肌酐的變化來診斷的.然而,血清肌酐受非腎臟因素的影響,更不能確定肝硬化AKI的病因,ICA2015指南提出有望探索一些新的生物標記物來解決上述問題.先前的實驗研究證實,尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)在鑒別ATN與其他類型AKI中起重要作用[5],腎損傷因子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和三葉因子3(trefoil factor 3,TFF3)已被美國食品和藥物管理局和歐洲藥品管理局定為高度敏感和特異性的尿液生物標志物,在臨床前研究和臨床試驗中監(jiān)測藥物性腎損傷[6],既往研究表明尿KIM-1和TFF3在肝硬化合并AKI患者中ATN的識別中起重要作用[7],但報道較少.本研究旨在探討尿液中NGAL、KIM-1、TFF3在肝硬化合并急性腎損傷患者急性腎小管壞死中的鑒別診斷價值.

以前對肝硬化AKI患者的這些生物標志物的研究只關注單一標志物的價值.但單一指標的敏感性和特異性較低,暫時無法進入臨床應用.許多研究表明[8],兩項或兩項以上指標的聯(lián)合檢測可以提高診斷的敏感性和特異性.然而,指標聯(lián)合對肝硬化患者ATN的診斷價值研究較少.本研究旨在探討兩種生物標志物的結合在ATN與其他類型AKI的鑒別診斷中的價值.報告內(nèi)容如下.

1 材料和方法

1.1 材料 本試驗納入了2021-05/2023-01連續(xù)住院于天津市第三中心醫(yī)院肝內(nèi)科及天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院的682例肝硬化患者,根據(jù)排除標準排除492例患者,其中因感染因素排除252例,其次慢性腎臟病的患者共69例,再次為無既往資料的62例,其他有惡性占位的36例,死亡的39例,其他原因34例,最終選取肝硬化失代償期患者190例,包括108例AKI患者及82例非AKI患者,AKI患者中包括33例PRA,27例HRS-AKI及48例ATN.按照ICA2015指南[4]對肝硬化中AKI及PRA進行診斷,按照2019年提出的對于ICA2015的補充更新共識[9]確診HRS-AKI,AKI的鑒別診斷和治療依據(jù)指南的規(guī)范給予治療,并個體化調整.ATN的診斷標準: 同前人研究[10],結合了臨床及實驗室數(shù)據(jù),滿足以下4個標準中的3個: (1)濾過鈉排泄分數(shù)(fraction excretion of urine sodium,FeNa)＞2%,(2)尿滲透壓＜400 mOsm/L,(3)尿鈉＞40 mEq/L,(4)存在休克或使用腎毒性藥物.

納入標準: (1)入院的失代償期肝硬化病人;(2)簽知情同意書,通過倫理委員會的審核;(3)有3 mo內(nèi)肌酐的基礎資料;(4)年齡大于18歲.

排除標準: (1)有肝腎移植病史或透析治療病史;(2)晚期慢性腎臟病(肌酐基礎值≥4 mg/dL);(3)惡性腫瘤;(4)感染,括泌尿系統(tǒng)感染、原肺炎、自發(fā)性腹膜炎、腸道感染等;(5)消化性潰瘍或炎癥性腸病的患者.

1.2 方法 患者資料收集記錄: 基礎疾病、肝硬化病因、并發(fā)癥情況、年齡、性別、肝腎功能、凝血常規(guī)、Child-Pugh評分,MELD評分等.詳見表1.

表1 ATN組與其他類型AKI組間資料對比及生物標志物水平比較

標本采取與保存: AKI組患者在首次診斷為AKI后的24 h內(nèi)及第3天,非AKI組在入院后的24 h內(nèi)健康體檢者在體檢當天,取晨尿10 mL,標本離心10 min(1000 rpm),上清液在-80 ℃冰箱保存.

標本的檢測: AKI組用發(fā)生AKI后第3天的尿標本檢測NGAL,用發(fā)生AKI后24 h內(nèi)尿標本檢測TFF3及KIM-1,NGAL的利用乳膠增強免疫透射比濁法在天津市第三中心醫(yī)院及天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科生化室于8200全自動生化分析儀上進行測定.采用ELISA法(R&D Systems,Minneapolis,USA)在天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院臨床檢驗科免疫科檢測尿液中的KIM-1和TFF3.

統(tǒng)計學處理所用數(shù)據(jù)通過SPSS 2.0分析.滿足或接近正態(tài)分布的計量用平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,非正態(tài)分布計量用中位數(shù)及四分位數(shù)表示,兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗,多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗,分類變量以例(%)表示,組間用卡方檢驗χ2比較,顯著性用aP＜0.05或bP＜0.001(P＞0.05不注).如同一表中另有一套P值,則用cP＜0.05和dP＜0.001;第三套為eP＜0.05和fP＜0.001等;第四套為gP＜0.05和hP＜0.001等;用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線探究診斷效能、診斷截斷值,曲線下面積(area under the curve,AUC)值越接近1,診斷價值越高.

2 結果

2.1 ATN組與其他類型AKI組間基本資料及生物標志物水平比較 ATN組與其他類型AKI組患者的年齡平均值、男性比率、基礎疾病情況、肝硬化病因情況在兩組間差異無統(tǒng)計學意義,ATN組有較差的生化(肝腎功)指標,腹水發(fā)生率明顯高于其他類型AKI組.通過Wilcoxon檢驗發(fā)現(xiàn)尿NGAL、尿KIM-1及尿TFF3在ATN組均高于其他類型AKI組,兩組間差異均具有統(tǒng)計學意義.詳見表1.

2.2 不同類型AKI組間生物標志物水平比較 本試驗進一步分析不同病因AKI患者中生物標志物表達的情況,并與未發(fā)生AKI的肝硬化患者(非AKI組)及健康體檢者進行比較,通過Kruskal-Wallis秩和檢驗發(fā)現(xiàn),尿NGAL、尿TFF3及尿KIM-1在健康體檢者及非AKI組中無表達差異,尿NGAL和尿TFF3在任何類型AKI組中濃度均明顯大于非AKI組,差異均有統(tǒng)計學意義,但尿KIM-1在PRA及HRS-AKI組患者中表達水平與非AKI組相比,差異無統(tǒng)計學意義.進一步通過兩兩成對比較發(fā)現(xiàn),3個指標在HRS組與PRA組表達差異均無統(tǒng)計學意義,且部分數(shù)值存在重疊,而兩個指標在ATN組中數(shù)值明顯大于PRA組及HRS組,差異均有統(tǒng)計學意義,詳見表2.

表2 不同類AKI組間生物標志物水平比較

2.3 生物標志物對于ATN的診斷價值 本試驗進一步利用ROC曲線評估生物指標對于肝硬化合并AKI患者中ATN的診斷價值,探究其診斷截斷值,并與及臨床現(xiàn)有的常有的評估腎功能指標(FeNa及尿Albumin)進行對比,3個指標的總體診斷效能均高于FeNa及尿Albumin,診斷價值最高的是尿NGAL,AUC是0.902,診斷臨界值為271.80 ug/g Cr時,敏感度為81.3%,特異性為85.0%.其次,指標組合可提高鑒別診斷能力,其中尿NGAL聯(lián)合尿TFF3的診斷能力最強(AUC=0.933),其次是uNGAL聯(lián)合uKIM-1(AUC=0.918),均高于FeNa%及尿白蛋白,詳見表3,ROC曲線圖見圖1.

圖1 生物標志物的ROC曲線圖.尿NGAL: 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白,AUC: 曲線下面積=0.902;尿KIM-1: 腎損傷因子-1,AUC=0.821;尿TFF3: 三葉因子3,AUC=0.807;尿NGAL+尿KIM-1,AUC=0.918;尿NGAL+尿TFF3,AUC=0.933;尿KIM-1+尿TFF3,AUC=0.810;尿白蛋白,AUC=0.756;尿鈉排泄分數(shù),AUC=0.708.ROC曲線: 受試者工作特征曲線;NGAL: 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白;KIM-1: 腎損傷因子-1;TFF3: 三葉因子3;AUC: 曲線下面積.

表3 診斷ATN的ROC曲線

3 討論

AKI是失代償期肝硬化及慢加急性肝衰竭的常見并發(fā)癥,常提示死亡率高且臨床預后差,及時準確地鑒別AKI的類型,對于指導治療及改善預后十分重要,尤其是如何早期識別結構性腎損傷ATN仍然是臨床亟待解決的問題,目前還沒有一種廣泛應用的無創(chuàng)診斷手段可以單獨實現(xiàn),前期研究顯示,尿NGAL對于鑒別ATN有一定的臨床價值,但其診斷臨界值仍需經(jīng)過更多研究的驗證,且其診斷效能有限,不能作為診斷ATN 的金標準,如何進一步提高尿NGAL的臨床診斷效能對于疾病的治療有重大意義.本研究發(fā)現(xiàn),尿NGAL對于ATN的診斷效能卓越,AUC為0.902.截止值為271.8 ug/g Cr時,敏感性為0.813,特異性為0.85.試驗還顯示,其他指標如尿TFF3和尿KIM-1對ATN也具有較高的鑒別診斷價值,令人興奮的是其中指標組合可提高鑒別診斷能力,其中尿NGAL聯(lián)合尿TFF3的診斷能力最強(AUC=0.933,敏感性為0.854,特異度為0.883).

Gambino和Piano等[11]2022年在意大利的單中心研究中證實尿NGAL可以區(qū)分ATN(1162 ng/mL)和非ATN(PRA、HRS-AKI和混合型AKI依次為87、111和109 ng/mL),P＜0.001),診斷最佳截斷點為220 ng/mL(AUC=0.854,靈敏度為89%,特異性為78%).另外兩項單中心研究也得出了類似的結果,分別為Huelin[10]等人2019年在西班牙巴塞羅那對320名肝硬化合并AKI患者的研究,研究證實發(fā)生AKI第3天的尿NGAL對ATN的鑒別診斷效能最佳,診斷閾值為220 μg/g Cr [AUC=0.87,(95%CI:0.78-0.95)].另一項研究為2021年Allegretti等人[12]在馬薩諸塞州波士頓的研究,研究顯示尿NGAL對ATN的診斷臨界值為244 ug/g Cr[AUC=0.762,(95%CI: 0.682-0.842)].本試驗也表明尿NGAL區(qū)分ATN與其他類型的AKI(包括PRA和HRS-AKI)的能力優(yōu)異,臨界值在271.8 ug/g Cr時,AUC為0.902,敏感性為0.813,特異性為0.85,與近期的類似研究結果相比非常相似甚至診斷效能更佳,結果優(yōu)于以往的研究,可能是由于總結了前人研究的經(jīng)驗及教訓,將尿NGAL用尿肌酐矯正后進行驗證,且選取了發(fā)生AKI后的第3天的尿標本進行試驗,同時排除了感染在試驗中的干擾[13],此外,試驗結果的不同可能與人群不同、樣本量過小、檢測方法不同相關,但總而言之,不同國家、人群及不同檢測方法得出試驗結果的一致性表明,NGAL在不同國家和不同肝硬化人群中對于ATN具有良好和可靠的診斷性能[14].

KIM-1是一種跨膜蛋白,在正常腎組織中幾乎不表達,但在腎小管損傷時在近曲小管內(nèi)皮細胞中明顯表達,前期研究證實其作為AKI早期診斷的新型生物標志物具有明顯的優(yōu)勢[15],而且KIM-1有很強的特異性,在身體其他器官中很少表達,同時又具有很高的穩(wěn)定性,使其易于在尿液中檢測到,因此其在腎臟中潛在的臨床價值值得進一步探究[16],既往研究顯示,尿KIM-1在ATN的識別中起重要作用,Belcher等[17]研究了尿KIM-1對于肝硬化合并AKI中ATN的有一定的鑒別作用,AUC=0.639,Ariza等[18]研究發(fā)現(xiàn)尿KIM-1在肝硬化合并AKI患者中的ATN的有一定鑒別診斷作用,AUC為0.704,敏感性為67%,特異度為74%.本試驗中發(fā)現(xiàn)尿KIM-1對于ATN的鑒別診斷作用不容忽視,AUC=0.821,敏感性及特異度均大于80%,有潛在的臨床價值,值得進一步研究.

自TFF3被發(fā)現(xiàn)以來,其在臨床中可能發(fā)揮的作用一直是研究者關注的焦點之一,大量臨床研究結果表明,TFF3在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要意義[19],隨著人們對TFF3生物學效應的關注,其在腎臟學領域的應用得到的關注越來越廣泛[20,21],前期研究表明[18],TFF3在肝硬化合并AKI中對于ATN有較好的診斷效能,AUC=0.824,敏感度為75%,特異性為81%,截斷點為3040 ug/g Cr.但相關的研究較少,其升高機制不僅與與腎小管損傷相關,更可能與炎癥及腎小管修復再生相關[21],與NGAL及KIM-1的升高機制不盡相同,值得臨床進一步探究.本研究中,尿TFF3對于肝硬化合并AKI患者中ATN的鑒別診斷有一定價值,AUC=0.807,特異度為85.0%,敏感度為79.2%.TFF3可能成為AKI新的生物標志物,其應用及作用機制仍需在多中心前瞻性臨床研究中進一步探索.

考慮到單一實驗室生物標志物的診斷效果有限,仍不能作為臨床鑒別ATN的金標準,既往研究顯示[17],多項指標的聯(lián)合能提高對于肝硬化合并AKI中ATN的診斷的準確性,且考慮到臨床醫(yī)生的檢查習慣及醫(yī)療成本,本研究聯(lián)合兩項指標分析對ATN患者的診斷價值.本試驗結果顯示,兩項指標聯(lián)合能進一步提高單個指標對于肝硬化患者中ATN的診斷效能,其中尿NGAL+尿TFF3診斷效能最高,AUC為0.933,敏感度為85.4%,特異度為88.3%,明顯提升了單個指標的診斷效能,其原因可能為兩項指標的升高機制不同,不同機制的指標間聯(lián)合可進一步提升診斷效能,但需更多研究的驗證,且TFF3與腎小管上皮細胞修復相關[22],其最佳的檢測時限需進一步探究總之,TFF3在肝硬化合并AKI患者中的作用值得進一步研究.

本實驗的創(chuàng)新之處在于: 采用不同指標的聯(lián)合檢測進行聯(lián)合檢測,不同于以往研究中單純血液或尿液中指標的檢測,進一步提升現(xiàn)在指標的診斷效能.本實驗的局限性在于樣本量過小,且以血清肌酐等現(xiàn)有臨床指標作為參考和診斷標準導致統(tǒng)計結果存在偏差.

近年來,新型腎臟標志物在肝硬化合并AKI患者的診斷、鑒別診斷、預后及治療應答預測方面顯示出廣闊的前景.大量研究證實,尿NGAL、尿KIM-1及尿TFF3等生物標志物能有效區(qū)分肝硬化人群中ATN與其他類型AKI,其中尿NGAL研究最多且證實能進入臨床應用的希望最大,但盡管取得了一些成果,仍需多中心、大樣本的臨床試驗,此外,兩項指標或多項指標聯(lián)合檢測對于肝硬化人群中ATN鑒別診斷的潛在價值不容忽視,有待進一步研究.總之,新的腎臟生物標志物有望成為肝硬化患者中對于不同類型AKI,尤其對于結構性腎損傷的鑒別手段,對于改善疾病預后及節(jié)約醫(yī)療成本有望起到重要作用.

4 結論

文章亮點

實驗背景

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是失代償期肝硬化常見的并發(fā)癥,預后較差且死亡率高,臨床上早期識別結構性腎損傷急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)對于治療方案的選擇及改善預后十分重要,前期研究顯示,尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)對于鑒別ATN有良好的效能,但其診斷臨界值仍需經(jīng)過更多研究的驗證,此外,三葉因子3(trefoil factor 3,TFF3)及腎損傷因子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)是近年來在肝硬化合并AKI中較為關注的生物標志物,對于ATN與其他類型的AKI也有潛在的鑒別診斷價值,本試驗進一步探究上述生物標志物及兩項指標聯(lián)合檢測在肝硬化合并AKI患者中對于ATN的鑒別診斷效能.

實驗動機

本試驗在多項國內(nèi)外研究的基礎上,探討NGAL、TFF3、KIM-1及指標間兩兩聯(lián)合檢測成為早期鑒別肝硬化合并AKI患者中ATN生物標志物.

實驗目標

探討NGAL、KIM-1、TFF3及2項指標間聯(lián)合檢測在肝硬化合并AKI患者中對于ATN的鑒別診斷價值,為臨床的早期診斷及治療探究新型指標,改善患者預后.

實驗方法

試驗于4月16日整地覆膜，4月23日播種，6月10日膜上覆土種植的小區(qū)開始覆土，采用人工覆土，覆土厚度3 cm，6月25日露地種植的小區(qū)開始中耕培土，結合培土追肥1次，7月20日（現(xiàn)蕾期）對每個小區(qū)噴施馬鈴薯專用液肥，并結合噴施烯酰錳鋅800倍液防治晚疫病，7月28日在保護行發(fā)現(xiàn)晚疫病中心病株3株，主要感染莖葉，做拔除處理，小區(qū)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)病株，并于7月29日噴施霜脲錳鋅防治晚疫病，晚疫病得到有效控制。8月12日，（盛花期）對每個小區(qū)噴施馬鈴薯專用液肥，并噴施甲霜靈防治晚疫病。

選取失代償期肝硬化患者190例,其中合并AKI患者108例,根據(jù)AKI病因分成不同亞組,包括33例腎前性氮質血癥,27例肝腎綜合征急性腎損傷型及48例ATN,探討血尿NGAL、TFF3、KIM-1及指標間聯(lián)合檢測對于ATN的鑒別作用.

實驗結果

尿NGAL對于肝硬化合并AKI患者中ATN的鑒別診斷價值較高,受試者工作曲線下面積(area under the curve,AUC)是0.902,診斷臨界值為271.8 ng/mL時,敏感度為81.3%,特異性為85.0%.指標組合可提高鑒別診斷能力,其中尿NGAL聯(lián)合尿TFF3的診斷能力最強(AUC=0.933,敏感度為85.4%,特異性為88.3%).

實驗結論

本試驗發(fā)現(xiàn)NGAL對于鑒別肝硬化合并AKI患者中ATN與其他類型AKI也有重要價值,且指標間聯(lián)合檢測可提高診斷能力,為臨床的診治提供新的思路.

展望前景

本試驗的為單中心研究,樣本量偏小,且以血肌酐而非腎臟穿刺作為AKI的診斷標準,存在與實際情況相悖的可能,存在明顯局限性,未來需進一步增加樣本量,多中心研究,探究生物標志物及指標間聯(lián)合在臨床中的應用價值.