成鏡 黃天帶 戴雪梅 徐正偉
關(guān)鍵詞:橡膠樹(shù);花藥;胚性愈傷組織;植株再生
中圖分類(lèi)號(hào):S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
橡膠樹(shù)體胚植株具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn),其產(chǎn)量較同源老態(tài)芽接無(wú)性系增加了25.8%~66.3%[1-3],生長(zhǎng)快10%~20%[1],是天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新一代種植材料。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“中國(guó)熱科院橡膠所”)組培與轉(zhuǎn)基因課題組建立了以花藥為外植體的橡膠樹(shù)熱研7-33-97 品種的體胚發(fā)生再生技術(shù)體系,目前能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)的橡膠樹(shù)品種僅熱研7-33-97,橡膠樹(shù)體胚植株品種覆蓋度不足限制了其應(yīng)用面積。因此,為了提高橡膠樹(shù)體胚植株的推廣應(yīng)用面積,亟待研發(fā)其他優(yōu)良品種的體胚再生技術(shù)體系。
橡膠樹(shù)熱墾628 品種具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、冠幅小、宜植區(qū)域廣的優(yōu)點(diǎn),是中國(guó)熱科院橡膠所自主選育的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“十四五”主推品種。通過(guò)對(duì)海南、云南、廣東3 個(gè)區(qū)域試驗(yàn)點(diǎn)適應(yīng)性試種的熱墾628 的系統(tǒng)觀(guān)測(cè),整體表現(xiàn)出了速生、產(chǎn)量高、抗逆性好的特性及良好的適應(yīng)性,是具有較大推廣應(yīng)用價(jià)值的膠木兼優(yōu)品種[4]。膠園產(chǎn)值低是目前天然橡膠產(chǎn)業(yè)面臨的難題,在橡膠林下間作耐陰作物可提高膠園產(chǎn)值,由于熱墾628 樹(shù)型是單桿型,分支較少,是最適合林下間作的品種。常規(guī)膠園每667 m 種植33 株(株行距3 m×7 m),中國(guó)熱科院橡膠所進(jìn)行示范種植的寬窄行(株距2 m,窄行距4 m,寬行距20 m)種植每667 m 種植28 株,使用體胚苗理論上可以增產(chǎn)20%,達(dá)到節(jié)本增效的效果。
為了成功地建立橡膠樹(shù)體胚發(fā)生再生技術(shù)體系,首先需要獲得較高質(zhì)量的胚性愈傷組織,否則難以進(jìn)行后續(xù)的體胚發(fā)生和植株再生過(guò)程。為了誘導(dǎo)出胚性愈傷組織,研究者們從基因型[5]外植體類(lèi)型[6-7]植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[8]、蔗糖、鈣[9-10]、其他添加物[11]等方面進(jìn)行研究,但效果不明顯。
本研究以橡膠樹(shù)雄花花蕾為材料,通過(guò)改變培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖、氨基酸、鈣含量、硝酸銀等研究其對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響,以期在較短的時(shí)間內(nèi)獲得胚性愈傷組織,為后續(xù)的體胚發(fā)生再生技術(shù)體系打下基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
以種植于中國(guó)熱科院試驗(yàn)場(chǎng)三隊(duì)的橡膠樹(shù)熱墾628 品種的花藥為材料,在春花期采集花蕾長(zhǎng)度為2.5~3.0 mm、顯微鏡觀(guān)察花粉粒處于單核期且發(fā)育良好的雄花進(jìn)行接種培養(yǎng)。
1.2 方法
1.2.1 花藥愈傷的誘導(dǎo) 摘取新鮮的雄花花蕾,75%的乙醇處理30 s,0.1%的HgCl 溶液浸泡10 min,浸泡期間不?;蝿?dòng),使滅菌徹底,無(wú)菌水沖洗4~5 次,每次5 min。解剖針剝開(kāi)花蕾,將花藥柱連同花藥接種于試管中,每管接種4 個(gè)花藥外植體。滅菌和接種均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將經(jīng)過(guò)無(wú)菌消毒的橡膠樹(shù)雄蕊接種于含有MS 大量、MS 微量、MS 有機(jī)、肌醇0.1 g/L,0.4 mg/L 硫胺素,不同毒莠定、KT、6-BA、IAA 濃度的培養(yǎng)基中,并補(bǔ)充天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸、鹽酸鹽50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝膠2.2 g/L,毒莠定、KT、6-BA、IAA 濃度采用五因素四水平正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1);培養(yǎng)容器為帶透氣膜的玻璃試管,pH 5.8,在溫度為28 ℃的條件下培養(yǎng)30 d。采用五因素四水平L16(45)正交表設(shè)計(jì),分別設(shè)置毒莠定濃度(因素A)、KT 濃度(因素B)、6-BA 濃度(因素C)、IAA 濃度(因素D)的五因素四水平正交試驗(yàn)(表2)。每個(gè)處理組合40 個(gè)外植體,重復(fù)3 次,接種20 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)情況。
1.2.3 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo) 將上述愈傷組織轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)以測(cè)試其是否為胚性愈傷,體胚發(fā)生為25 ℃暗培養(yǎng)。體胚發(fā)生培養(yǎng)基配方參照黃天帶等[12]的配方。每個(gè)處理重復(fù)3 次,每個(gè)處理2 皿,每個(gè)處理共20 個(gè)外植體,轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基后45 d,統(tǒng)計(jì)體胚誘導(dǎo)率。
1.2.4 植株再生測(cè)試 將上述獲得的正常體胚轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基中進(jìn)行植株再生,植株再生培養(yǎng)基參考華玉偉等[13]的配方及培養(yǎng)條件。
1.3 數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019 和SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理和分析,用Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析
從表3 可以看出,不同培養(yǎng)基配方對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響不同,其中處理8、12 愈傷誘導(dǎo)率最高,均達(dá)到100%;其次分別是處理9、10,愈傷誘導(dǎo)率均達(dá)93.3%;處理5 的愈傷誘導(dǎo)率最低,為63.3%。結(jié)果表明,處理8、9、10、12 與其余處理之間差異顯著,而處理1、2、3、4、6、7、14、16 之間無(wú)差異顯著。
從正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀(guān)分析(表4)可以看出,毒莠定濃度(因素A)對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響較大,而KT 濃度(因素B)和6-BA 濃度(因素C)以及IAA 濃度(因素D)對(duì)其影響次之。從表4 的極值可確定4 個(gè)因素對(duì)愈傷誘導(dǎo)率影響程度順序?yàn)椋篈>B>C>D;根據(jù)表4 中各因素水平均值的大小,可得愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)組合為ABCD, 即毒莠定濃度20 mg/L 、KT 濃度2 mg/L、6-BA 濃度1 mg/L、IAA 濃度0 mg/L。
2.2 不同處理愈傷組織誘導(dǎo)情況
從圖1 可以看出,處理9、10、11、12 的愈傷組織表面有一些光滑且球形的愈傷組織,而其余處理中很少看見(jiàn)有這種類(lèi)型的愈傷組織產(chǎn)生。
2.3 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)結(jié)果分析
從表5 可以看出,處理1、2、3、4、5、6、7、8、13、15 均未誘導(dǎo)出體胚,體胚誘導(dǎo)率均為0。處理10 的體胚誘導(dǎo)率最高,顯著高于其余處理,體胚誘導(dǎo)率由高到低依次為處理10>處理9>處理11>處理14>處理12>處理16,分別為33.3%、18.3%、16.7%、13.3、11.7%、6.7%。處理11、12、14 之間無(wú)顯著差異。
從圖2 可以看出,處理9、10、11 雖然能長(zhǎng)出體胚,但是多為不正常的體胚,僅有處理14 能產(chǎn)生個(gè)別正常體胚。
2.4 植株再生情況分析
從體胚發(fā)生培養(yǎng)基中挑選出11 個(gè)較正常的體胚,轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基中進(jìn)行再生(圖3),其中出苗2 株,7 個(gè)只長(zhǎng)根不抽芽,2 個(gè)既不抽芽也不長(zhǎng)根,植株再生率為18%。
3 討論
在橡膠樹(shù)中,胚性愈傷組織的獲得主要有花藥培養(yǎng)和內(nèi)珠被培養(yǎng)2 種途徑。其中,花藥培養(yǎng)是橡膠樹(shù)離體培養(yǎng)中研究最多的一個(gè)方向,也是橡膠樹(shù)生物技術(shù)育種的主要途徑[14]。經(jīng)由花藥培養(yǎng)獲得的易碎胚性愈傷組織可通過(guò)繼代培養(yǎng)快速增殖,再進(jìn)行批量的體胚誘導(dǎo)和植株再生[15],或者進(jìn)行懸浮培養(yǎng)建立胚性懸浮細(xì)胞系,以此作為原生質(zhì)體培養(yǎng)的最佳分離材料[16]。因此,如何獲得良好的胚性愈傷組織對(duì)開(kāi)展后續(xù)的研究具有重要的研究意義。
本研究明確了橡膠樹(shù)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)組合為ABCD,即毒莠定濃度20 mg/L、KT濃度2 mg/L、6-BA 濃度1 mg/L、IAA 濃度0 mg/L。本研究結(jié)果表明,對(duì)胚性愈傷的誘導(dǎo)起主要作用的是毒莠定濃度,其濃度在20~30 mg/L 之間時(shí),對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。低濃度的毒莠定雖然也能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生,但是這些愈傷組織幾乎為無(wú)胚胎發(fā)生能力的非胚性愈傷組織。
在體胚誘導(dǎo)階段所用培養(yǎng)基為橡膠樹(shù)熱研7-33-97 品種的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基,產(chǎn)生的多為不正常的體細(xì)胞胚,可能是由于體胚發(fā)生的基因型依賴(lài)所致,今后的研究中也需要針對(duì)熱墾628 品種研發(fā)針對(duì)性的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本研究所有處理在誘導(dǎo)愈傷組織25~28 d,愈傷組織達(dá)到快速增殖時(shí)期,為了更好地確定愈傷組織的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài),今后要更加關(guān)注25 d 以前的愈傷組織狀態(tài),在該研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方,使其能更快地從花藥誘導(dǎo)胚性愈傷,縮短胚性愈傷誘導(dǎo)時(shí)間,降低變異發(fā)生機(jī)率,以及為引進(jìn)法國(guó)RITA培養(yǎng)系統(tǒng)提供更好的起始培養(yǎng)材料。本研究中植株再生率為18%,遠(yuǎn)低于熱研7-33-97 的70%左右,原因可能有以下兩方面,一是所使用的體胚還不夠成熟,二是所使用的植株再生培養(yǎng)基不適用于橡膠樹(shù)熱墾628 品種植株再生。有1 株移栽于沙床中進(jìn)行馴化。但由于移栽時(shí)工人不慎將葉片弄掉以及后期管理不到位,很遺憾最終沒(méi)能移栽成活。由于初次誘導(dǎo)的植株較少,且沒(méi)有移栽成活,所以未對(duì)其進(jìn)行遺傳變異檢測(cè),但是從植株的葉片形態(tài)和株高上看,無(wú)明顯變異特征。