基于SSR分子標記構建19個杧果品種（系）的DNA指紋圖譜

劉榮　張正學　劉清國　黨志國　吳小波　黃海

關鍵詞：杧果；SSR 標記；毛細管電泳；DNA 指紋圖譜；DNA 分子身份證

中圖分類號：S667.7 文獻標識碼：A

杧果（Mangifera indica Linn.），是一種熱帶亞熱帶常綠喬木果樹，屬漆樹科（Anacardiaceae）杧果屬（Mangifera）[1-2]。因其果實香甜、營養(yǎng)豐富、肉質細滑多汁，被稱為“熱帶果王”，備受消費者青睞[3]。杧果原產于印度，我國于20 世紀初引進象牙杧杧果，已收集保存杧果種質資源1000 余份，結合實生選種、雜交育種等育種方法創(chuàng)制了熱農1 號、紅玉杧、桂熱82 號等優(yōu)良品種[4]。以杧果品種阿方索為試材，通過測序和組裝得到了393 Mb 的基因組圖譜[5]。目前，我國杧果主要種植在海南、廣西、四川等熱帶亞熱帶地區(qū)，其種植面積達343 400 hm2，產量達331.2 萬t，居世界第二位[6-7]。

目前，應用于杧果遺傳育種的分子標記技術有SSR[8]、RAPD[9]、AFLP[10]等。SSR（simplesequence repeats， SSR）標記是一種以特異引物PCR 為基礎的分子標記技術，具有數量豐富、多態(tài)性高；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；技術重復性好、易操作等特性[11]。近年來，SSR 標記被廣泛應用于植物遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建，在水稻[12]、大豆[13]以及黃瓜[14]等作物上已有報道。孫浩男等[15]利用MISA 軟件以金雞菊為試材，檢測得到6546 個SSR 位點；結合引物篩選成功開發(fā)出22 對多態(tài)性較好的引物，擴增得到166 個多態(tài)性條帶。馮鵬龍等[16]以辣椒為試材，篩選得到6 對多態(tài)性較好的引物，共擴增到36 個基因位點，多態(tài)性比例為97% ； 并選用pepperSSR01 、pepperSSR04、pepperSSR06、pepperSSR08 構建了供試辣椒材料的指紋圖譜。董聚苗等[17]利用28f4、CH04f10、GD142 共3 對SSR 引物構建了74 個觀賞海棠品種的指紋圖譜。本研究采用SSR標記構建19 份杧果品種（系）的DNA 指紋圖譜和DNA 分子身份證，旨在為杧果遺傳育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料于2020 年9 月在貴州省興義市南盤江鎮(zhèn)田房村收集。采集杧果秋稍上的幼嫩葉片，將葉片用吸水紙吸干后放入裝有變性硅膠的采樣袋中，寫好標簽后帶回實驗室備用。

1.1.2 試劑與儀器 Taq Plus DNA 聚合酶、10×PCR Buffer（含Mg）、dNTPs（10 mmol/L）、50×TAE、瓊脂糖H 等均采購于生工生物工程（上海）股份有限公司，6×DNA Loading Dye、DNALadder Mix（100～3000 bp）、POP-7 Polymer和HiDiForma-mide 采購于ThermoFisher （AppliedBiosystemsTM）公司。

VeritiTM 96well 型PCR 儀購自美國ABI 公司；FR-980A 型凝膠成像儀購自上海復日科技有限公司；3730XL 型測序儀購自美國ABI 公司；SMA4000型UV-Vis Spectrophotometer 購自Merinton 公司；TD5A-WS 型臺式高速離心機購自湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；F619703-05 型BP 系列精密單道可調移液器購自加拿大BBI 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 以杧果幼嫩葉片為原材料，采用Ezup 柱式植物組織基因組DNA 抽提試劑盒提取杧果基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書（產品編號：B518261）。

1.2.2 SSR 分析 所用SSR 標記引物序列來源于前人的研究開發(fā)[18-20]，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應體系：10 μmol/L正反向引物各 0.5 μL，5 μmol/L dNTPs 0.5 μL，10×Taq buffer （含Mg2+） 2.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，20～50 ng/μL 基因組DNA 1 μL，ddH2O 19.8 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性5min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃修復延伸10 min，4 ℃保存。引物篩選時，PCR 產物通過PAGE 檢測；毛細管電泳時，將篩選得到的SSR 引物進行5修飾，得到的PCR 產物使用3730XL 設備進行檢測。

1.3 數據處理

采用Genemapper 軟件分析獲得擴增片段大小。DNA 指紋圖譜代碼、DNA 分子身份證的構建參照郭艷春等[21]和李志強等[22]的方法，即：將每一對引物擴增得到的所有等位基因按照從小到大的順序進行排列，先用數字1～9 依次排序，超出9 的部分用字母順序排列，構建形成19 個杧果品種（系）的指紋圖譜代碼。每個品種的條形碼DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證分別在網址http：//t-x-m.com/和http：//t-x-m.com/QRCode/QRCodeGenerator.asp 上完成。

2 結果與分析

2.1 19 個杧果品種（系）的基本特性

19 個杧果品種（系）主要從廣西、海南引進以及貴州自育品系中獲得，其中8 個品系處于中期試驗階段，待鑒定；11 個品種（系）是單胚，8 個品種（系）是多胚；其基本特性如表1 所示。

2.2 引物篩選

根據所選材料的表型特征，選擇其差異較大的5 份杧果材料（紅象牙杧、金煌杧、紅杧6 號、紅玉杧、南逗邁4 號杧）為模板，經PCR 擴增以及PAGE 電泳檢測，從115 對引物中篩選得到穩(wěn)定性較好、多態(tài)性較高的引物9 對，并采用HEX、FAM 兩個熒光標記對引物進行5端修飾（毛細管電泳檢測備用），引物詳細信息見表2。

2.3 DNA 指紋圖譜構建

對篩選得到的9 對引物進行熒光標記后，毛細管電泳檢測19 份杧果品種（系），構建其DNA指紋圖譜。擴增片段大小通過數字和字母對每對引物的多態(tài)性位點進行編碼，如表3 所示，9 對引物擴增得到多態(tài)性條帶數158 條，其中引物M53 含有19 個多態(tài)性位點，從小到大依次是：167.44/175.74（1）、167.44/188.75（2）、168.34/176.5（3）、168.4/184.64（4）、168.42/176.72（5）、168.58/176.81（6）、175.6/179.53（7）、175.63/179.6（8）、176.48/184.63（9）、176.58/182.55（A）、176.61（B）、176.64/182.62（C）、176.69/182.61（D）、176.69/188.69（E）、176.71/182.57（F）、176.79/182.72（G）、176.85/188.87（H）、177.5/179.55（ I ） 、177.65/181.71（J）。

依據表3 的多態(tài)性片段編碼，按照引物M9、M15、M35、M40、M53、M59、M101、M102、M103 順序，通過每個品種對應的每個引物多態(tài)性位點進行組合統計，構建形成19 份杧果品種（系）的指紋圖譜代碼（表4）。如金煌杧，通過9 個SSR 位點毛細管電泳檢測得到帶型（圖1），統計分析形成其指紋圖譜代碼為9EE9F8933，對應表3 表示第1 個數字9 表明杧果品種金煌杧對應引物M9 的擴增片段在該引物多態(tài)性片段梯度中排第9；第2 個字母E 表明杧果品種金煌杧對應引物M15 的擴增片段在該引物多態(tài)性片段梯度中排第14；第3 個字母E 表明杧果品種金煌杧對應引物M35 的擴增片段在該引物多態(tài)性片段梯度中排第14；后續(xù)代碼以此類推。將19 個品種（系）的指紋圖譜代碼和基本信息導入在線條形碼生成程序、二維碼生成程序，得到各品種的條形碼DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證（表4）。

3 討論

由于SSR 標記具有共顯性、等位變異多、重復性好等優(yōu)勢，已被廣泛應用于果樹DNA 指紋圖譜構建。本研究從115 對引物中初步篩選得到多態(tài)性較好的引物9 對，毛細管電泳檢測19 份杧果品種（系），依據擴增片段大小對每對引物的多態(tài)性位點進行編碼，9 對引物擴增得到多態(tài)性條帶數158 條，其中引物M53 含有19 個多態(tài)性位點，這與黃麗芳等[23]、王明等[19]的研究結果相似。

DNA 分子身份證由于可以直觀便捷呈現品種信息，在品種識別、鑒定等方面得以廣泛應用。武志江等[24]采用20 對SSR 標記引物，結合數字和小寫字母對145 份火龍果不同帶型進行編碼，成功構建了火龍果種質資源的DNA 分子身份證，實現不同種質資源的有效區(qū)分。侯麗媛等[25]選取7 對熒光SSR 引物，并運用條形碼技術生成了‘赤霞’的分子身份證。白曉倩等[26]利用6 對SSR 引物構建了55 份板栗品種的DNA 分子身份證，這對板栗品種的識別和鑒定提供了參考價值。相對這些果樹來說，SSR 分子標記在杧果DNA 分子身份證構建方面的應用相對較少。本研究通過PCR 擴增得到多態(tài)性片段編碼，按照引物M9、M15、M35、M40、M53、M59、M101、M102、M103 順序對19 份杧果品種（系）的指紋圖譜代碼進行編輯，構建了19 份杧果品種（系）的DNA分子身份證，為標準化構建杧果DNA 分子身份證庫奠定基礎。

4 結論

本研究以19 個杧果品種（系）為試材，利用熒光標記的9 對引物，通過毛細管電泳檢測后，結合“數字+字母”處理獲得19 個杧果品種（系）的指紋圖譜代碼、條形碼DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證，為標準化構建杧果DNA分子身份證庫奠定基礎。