橡膠樹膜系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA 文庫構(gòu)建及HbSRPP7互作蛋白篩選

聶智毅　康桂娟　覃懷德　曾日中

關(guān)鍵詞：橡膠樹；HbSRPP7；膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)；cDNA 文庫；互作蛋白

中圖分類號：S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

天然橡膠（順式-聚異戊二烯，橡膠烴）作為重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資廣泛應(yīng)用于人們的日常生活、交通運輸、軍事裝備及航空航天等領(lǐng)域，在我國經(jīng)濟(jì)和國防建設(shè)中具有重要的戰(zhàn)略地位。天然橡膠產(chǎn)業(yè)是一種典型的資源約束型產(chǎn)業(yè)，在生產(chǎn)地域和產(chǎn)品性能上具有不可替代性。天然橡膠主要來源于巴西橡膠樹（ Hevea brasiliensis Muell. Arg.，簡稱橡膠樹）乳管細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的橡膠粒子[1]。橡膠粒子是橡膠樹乳管細(xì)胞中的一種特殊細(xì)胞器，作為橡膠樹乳管細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的主要成分，其體積約占膠乳總體積的30%～45%，是橡膠生物合成及其產(chǎn)物最終貯藏的場所[2]。橡膠生物合成的整個過程涉及乳管細(xì)胞產(chǎn)膠代謝的一系列生化反應(yīng)，其中發(fā)生在橡膠粒子上橡膠分子的起始、延長和終止是橡膠生物合成的關(guān)鍵步驟。橡膠粒子上的蛋白質(zhì)（酶）在這一系列反應(yīng)過程中起著關(guān)鍵作用，它們直接決定著橡膠烴分子的數(shù)量和大小，從而影響著天然橡膠的產(chǎn)量和質(zhì)量。深入研究橡膠粒子蛋白的功能，分析其與橡膠生物合成之間的關(guān)系，對揭示橡膠生物合成及其分子調(diào)控機制具有重要意義。DAI 等[3]提取洗滌過的橡膠粒子蛋白并采用“Shotgun（鳥槍法）”質(zhì)譜分析，鑒別了186 個橡膠粒子蛋白，其中已知參與橡膠生物合成的橡膠粒子蛋白主要有3種，分別是橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）、小橡膠粒子蛋白（small rubber particleprotein， SRPP ） 和順式- 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyltransferase， CPT）。除此之外，橡膠粒子上存在調(diào)控橡膠生物合成的焦磷酸酶[4]以及其他功能未知的蛋白[3]。REF、SRPP 及CPT 等蛋白可能通過相互作用，形成蛋白復(fù)合體[5-8]，在橡膠粒子上催化800～20 000 個IPP 分子中的異戊二烯基順式聚合，形成多聚順式異戊二烯（即天然橡膠分子），但這些橡膠粒子蛋白的具體功能及作用機制仍有待更深入研究[9]。SRPP 是豐度僅次于REF 的橡膠粒子蛋白組分，與橡膠粒子發(fā)育和橡膠生物合成密切相關(guān)[10-11]。DAI 等[3]研究表明，橡膠粒子上存在多個SRPP 蛋白，但大部分成員的功能尚未鑒定。進(jìn)一步鑒定橡膠粒子上SRPP家族其他成員的相互作用蛋白，有助于揭示橡膠粒子上參與橡膠生物合成的蛋白復(fù)合體組成，闡明橡膠生物合成及其調(diào)控的分子機制。HbSRPP7（GenBank 登錄號：XM_021791298.1）是一個在橡膠生物合成活躍度相對較低的大橡膠粒子上表達(dá)量較小橡膠粒子高的橡膠粒子蛋白，可能與大、小橡膠粒子的橡膠生物合成活性差異相關(guān)[12]，但其功能及其參與橡膠生物合成的機制需要進(jìn)一步深入研究。本研究利用位點特異性重組技術(shù)構(gòu)建高質(zhì)量膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)（membrane yeasttwo-hybrid system， MYTH）cDNA 文庫，使用DUALmembrane system 構(gòu)建pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體并進(jìn)行自激活及表達(dá)功能檢測。以pBT3STE-SRPP7 誘餌質(zhì)粒對膠乳MYTH cDNA 文庫進(jìn)行篩選，獲得21 個可能與HbSRPP7 互作的蛋白，為了解HbSRPP7 的功能及其功能發(fā)揮的機制，闡明橡膠生物合成的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以2000 年定植于海南省儋州市寶島新村的熱研7-33-97 品系橡膠樹膠乳為材料。多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司， Oligotex mRNA Kits 購自Qiagen 公司，SuperScript Double-Stranded cDNASynthesis Kit 購自Invitrogen 公司，Trimmer-2cDNA normalization kit 購自Evrogen 公司，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase 和DNA marker 購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA 凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega 公司，ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit 及Phanta EVO HS Super-Fidelity DNA Polymerase 購自南京諾唯贊生物科技有限公司，DUALmembrane starter kit 購自Dualsystems Biotech 公司，酵母缺陷培養(yǎng)基、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購自Clontech 公司，DH5α 大腸桿菌為本實驗室保存，其余生化試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成及測序委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹膠乳RNA 提取和cDNA 合成 根據(jù)多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒說明書提取橡膠樹膠乳總RNA，以分光光度計測定RNA純度及濃度并參照Oligotex mRNA Kits 說明書分離純化mRNA。參照SuperScript Double-StrandedcDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈以及第二鏈，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 橡膠樹膠乳MYTH系統(tǒng)cDNA 文庫制備及質(zhì)量檢測 （1）cDNA 的均一化處理。將合成的34 μL cDNA 第二鏈加入以下反應(yīng)體系：10×T4Ligase buffer 5 μL，1 μg/μL 5'Adapter（序列為5'-GCAGAGTGGCCATTACGGCCACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3'）10 μL，40 U/μL T4 DNALigase 1 μL，混勻后于16 ℃放置16 h。加入10 mmol/L dNTPs 2 μL，T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃放置20 min，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)2.5 倍體積無水乙醇沉淀DNA，并用14 μL ddH2O 溶解沉淀物，取其中12 μL 參照Trimmer-2 cDNA normalizationkit 說明書進(jìn)行均一化處理，切膠回收1000 bp 以上片段，溶解于14 μL ddHO 中。

（2）cDNA 文庫制備。按照DUALmembranestarter kit 以及ClonExpress Ultra One Step CloningKit 說明書，使用位點特異性重組的方式，將14 μL均一化cDNA 與6 μL 線性化的MYTH 系統(tǒng)載體pPR3-N 加入50 μL 2×ClonExpress Mix，30 μLddHO，置于50 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入10 μL 10 μg/μL 的Proteinase K 滅活重組酶。并依次加入90 μL ddHO、20 μg/μL Glycogen 2 μL、7.5 mol/L NH4OAc 100 μL、無水乙醇750 μL，混合均勻并置于–80 ℃ 2 h。于4 ℃，16000 r/min離心30 min，去上清，加入150 μL 70%乙醇；4 ℃，16 000 r/min 離心3 min；重復(fù)此步驟1 次，小心去除上清，室溫晾干10 min。用10 μL ddHO 置冰上重懸沉淀。重組產(chǎn)物每2.5 μL 電轉(zhuǎn)化50 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入LB 培養(yǎng)基1 mL，合并4 次轉(zhuǎn)化后的菌液，用培養(yǎng)基補足至5 mL，置于37 ℃，以250 r/min 震蕩培養(yǎng)2 h 后，取2 μL 培養(yǎng)物梯度稀釋10、100、1000、10 000 倍，其余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%保存于–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）cDNA 文庫質(zhì)量檢測。取轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌梯度稀釋液10 μL 涂布于氨芐抗性（100 μg/mL）LB 平板，培養(yǎng)16 h 后計數(shù)。CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/10× 稀釋倍數(shù)×1000 ， 文庫總CFU=CFU/mL×文庫菌液總體積（mL）。以無菌槍尖從原始文庫滴度測定平板上隨機挑取菌斑克隆，利用3'AD（5'-CTCGAGAGGCCGAGGCGGCC-3'）和5'AD（5'-GCAGAGTGGCCATTACGGCC-3'）引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)擴(kuò)增5 min；然后94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃2 min，共30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫插入片段大小。

（4）cDNA 文庫的擴(kuò)增與文庫質(zhì)粒提取。將上步檢驗合格的原始cDNA 文庫，根據(jù)其庫容量，以每個涂布約3 萬個克隆的密度鋪板培養(yǎng)于35 cm氨芐抗性（100 μg/mL）LB 培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)完成后以LB 液體培養(yǎng)基洗脫菌斑克隆，以質(zhì)粒大抽試劑盒抽提質(zhì)粒，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體構(gòu)建、自激活檢測及功能檢測 根據(jù)HbSRPP7的開放閱讀框（open reading frame， ORF）序列以及ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit 說明書設(shè)計包含Sfi Ι 酶切位點引物（SRPP7-F：5'-GGATCTTCCAGAGATGGCCATTACGGCCATGGAGATGGAGAAGAAGAACCC-3'，SRPP7-R：5'-CTGCCGTTCGACGATGGCGCCTCGGCCCCATCCGAATCTGATGAATCATGTGC-3'。），用于擴(kuò)增HbSRPP7 的ORF 片段。PCR 反應(yīng)體系：PhantaEVO HS Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、稀釋50 倍的橡膠樹膠乳第一鏈cDNA 2 μL、5×EVOBuffe 10 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10 μmol/L的SRPP7-F 及SRPP7-R 引物各1 μL，以ddHO補至體積50 μL。PCR 擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)擴(kuò)增5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，切膠回收擴(kuò)增條帶，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Sfi Ι 限制性內(nèi)切酶酶切誘餌載體質(zhì)粒pBT3STE 和pBT3SUC，切膠回收線性化載體片段，根據(jù)ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit試劑盒說明書將HbSRPP7 的ORF 片段克隆至pBT3STE 和pBT3SUC 載體的Sfi Ι 位點中，然后將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。涂布于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落至LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h 并提取質(zhì)粒，以Sfi Ι 酶切鑒定為陽性的克隆送測序。根據(jù)測序結(jié)果將無移碼無堿基突變的重組質(zhì)粒分別命名為pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7。參照DUALmembrane starter kit 試劑盒說明書，將各種質(zhì)粒組合（表1）轉(zhuǎn)入受體菌NMY32 中，培養(yǎng)4 d，記錄每塊篩選平板上的克隆數(shù)量，并計算其相對生長率，對構(gòu)建的誘餌載體進(jìn)行自激活檢測及表達(dá)功能檢測。

1.2.4 HbSRPP7 互作蛋白篩選及回轉(zhuǎn)驗證 使用pBT3STE-SRPP7 誘餌載體參照DUALmembranestarter kit 試劑盒說明書進(jìn)行互作蛋白篩選及回轉(zhuǎn)驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取與cDNA 合成

本研究提取的橡膠樹膠乳總RNA 的OD/OD為2.10，OD/OD 為1.88，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A 所示，呈現(xiàn)2 條相對集中的亮帶，帶型完整，邊緣清晰，說明RNA 樣品的完整性好。分離的mRNA 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠（圖1B）電泳顯示呈彌散狀分布，條帶分布均勻，紫外分光光度測定總量為6.5 μg，OD/OD280 為1.91，表明分離的mRNA 總量及純度滿足建庫要求。取5 μg mRNA 合成cDNA 第二鏈，進(jìn)行均一化處理后直接用于cDNA 文庫的制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取與cDNA 合成

本研究提取的橡膠樹膠乳總RNA 的OD/OD 為2.10，OD/OD 為1.88，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A 所示，呈現(xiàn)2 條相對集中的亮帶，帶型完整，邊緣清晰，說明RNA 樣品的完整性好。分離的mRNA 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠（圖1B）電泳顯示呈彌散狀分布，條帶分布均勻，紫外分光光度測定總量為6.5 μg，OD/OD 為1.91，表明分離的mRNA 總量及純度滿足建庫要求。取5 μg mRNA 合成cDNA 第二鏈，進(jìn)行均一化處理后直接用于cDNA 文庫的制備。

2.2 cDNA 文庫制備、質(zhì)量檢測及質(zhì)粒提取

構(gòu)建的重組產(chǎn)物經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，稀釋100 倍細(xì)菌培養(yǎng)物的LB 平板共長了約266 個克隆子，稀釋1000 倍的LB 平板共長了約32 個克隆子，稀釋1000 倍的LB 平板共長了3 個克隆子（圖2），經(jīng)計算其原始cDNA 文庫的滴度約為3.0×10CFU/mL，總庫容為1.5×10 CFU，符合篩庫要求。通過PCR 鑒定制備的cDNA 文庫插入片段多數(shù)介于1000～4000 bp 之間（圖3），平均插入片段長度約為1500 bp，重組率為100%。將上述經(jīng)檢測的cDNA 文庫涂布于500 個35 cmLB 平板，經(jīng)培養(yǎng)、洗脫及質(zhì)粒提取后獲得庫容大于1.0×10 CFU/mL 的文庫質(zhì)粒，用于下一步的篩庫實驗。

2.3 pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體的構(gòu)建

瓊脂糖電泳檢測顯示，PCR 擴(kuò)增HbSRPP7 的ORF 片段大小正確（圖4），構(gòu)建的誘餌載體經(jīng)內(nèi)切酶檢測與預(yù)計相符（圖5）。測序結(jié)果顯示，目的片段正確插入pBT3STE 及pBT3STE 載體的Sfi Ι 位點中，且序列無移碼及堿基突變現(xiàn)象，說明誘餌載體pBT3STE-SRPP7 和pBT3STE-SRPP7 構(gòu)建成功。

2.4 誘餌載體的自激活檢測及功能檢測

自激活及功能檢測結(jié)果顯示（表2），陽性對照（反應(yīng)1）在SD/-Trp/-Leu（SD-TL）、SD/-Trp/-Leu/-His （ SD-TLH ） 及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（SD-TLHA）篩選平板上生長旺盛，陰性對照（反應(yīng)2）在SD-TL 篩選平板上生長正常，在SD-TLH和SD-TLHA 篩選平板上無生長，與預(yù)計相符合，說明實驗體系對照成立。而自激活檢測的反應(yīng)3和反應(yīng)4 在SD-TL 篩選平板上生長正常，在SD-TLH 和SD-TLHA 篩選平板上無生長，說明pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體對NMY32 酵母無自激活活性。功能檢測的反應(yīng)5和反應(yīng)6 在SD-TLH 和SD-TLHA 篩選平板上有生長，相對于SD-TL 篩選平板生長率在35%～61%之間，顯示pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7均可在酵母中正常表達(dá)，皆可應(yīng)用于下一步的篩庫實驗，pBT3STE-SRPP7 的相對生長率（60.7%和44.3%）較pBT3SUC-SRPP7（58.5%和35.8%）高，說明pBT3STE-SRPP7 誘餌載體表達(dá)功能相對更強，因此后續(xù)篩庫實驗選用pBT3 STE-SRPP7誘餌載體進(jìn)行。

2.5 HbSRPP7 的互作蛋白篩選及回轉(zhuǎn)驗證

文庫篩選共獲得34 個可激活A(yù)DE2 和HIS3報告基因的初始陽性克?。▓D6A）。LacZ 報告基因激活檢測顯示這34 個初始陽性克隆的β-半乳糖甘酶活性（OD/OD）值皆大于陰性對照值（ 圖6B ）， 表明這些初始陽性克隆均是與HbSR-PP7 存在相互作用的陽性克隆。初始陽性克隆的質(zhì)粒DNA 經(jīng)測序及Blastn 比對，結(jié)果顯示這34 個陽性克隆包含21 種不同編碼的基因（表3）。進(jìn)一步的回轉(zhuǎn)驗證結(jié)果顯示，全部陽性克隆均能通過對ADE2 和HIS3 報告基因激活的回轉(zhuǎn)驗證，但其中2、3、8、12、23、26、29 和30 號陽性克隆生長較弱（圖7A）且β-半乳糖甘酶活性值較低（圖7B），表明這些克隆所包含的相關(guān)蛋白與HbSRPP7 間存在的蛋白相互作用可能比較弱。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是目前最經(jīng)典的蛋白間相互作用研究方法，具有簡單高效的特點[13]。但傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)僅限于相互作用發(fā)生于細(xì)胞核中的2 個或者幾個可溶性蛋白的互作分析，并不能對相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中的膜蛋白或可溶蛋白進(jìn)行研究。MYTH 系統(tǒng)是傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的一種替代方法，無需核定位信號，主要依賴泛素降解途徑作為蛋白質(zhì)相互作用“感應(yīng)器”，對膜蛋白與膜蛋白、膜蛋白與可溶性蛋白之間相互作用進(jìn)行研究[14-16]，并且可以檢測3 個蛋白之間“橋接”的相互作用[7]。此外，因為檢測的誘餌和獵物蛋白之間相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，所以可以與傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)相互補充，分析更多的互作目標(biāo)蛋白[17-19]。橡膠生物合成發(fā)生于乳管細(xì)胞中的橡膠粒子表面[20-21]。SRPP 家族蛋白是主要存在于橡膠粒子上的高豐度蛋白質(zhì)之一[22]，其蛋白相互作用并非發(fā)生于細(xì)胞核中，使用MYTH系統(tǒng)，可更有效篩選HbSRPP7 的互作蛋白。

MYTH 系統(tǒng)與傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)類似，均存在假陽性率較高的缺點。誘餌蛋白在宿主酵母菌中的自激活活性是造成篩選結(jié)果假陽性的重要原因之一[23]。本研究所用MYTH 系統(tǒng)誘餌蛋白自激活常見的表現(xiàn)是NMY32 中表達(dá)的誘餌（bait）融合蛋白和任意獵物（prey）載體（NubG）結(jié)合啟動下游的轉(zhuǎn)錄[24]。需要比對陽性對照或進(jìn)一步通過競爭抑制劑3-AT（3-Aminotriazole， 3-氨基三唑）抑制較為輕微的自激活活性，降低干擾背景。此外，誘餌蛋白的正確翻譯與定位是本研究所使用MYTH 系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)的前提。因此為保證后續(xù)利用MYTH 系統(tǒng)篩選HbSRPP7 的互作蛋白獲得較為可靠結(jié)果，在文庫篩選前，本課題組對誘餌載體的自激活活性以及在酵母中表達(dá)的誘餌蛋白功能進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示所構(gòu)建誘餌載體pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 在NMY32 酵母中均不存在自激活現(xiàn)象，排除誘餌蛋白自激活活性對篩選結(jié)果的干擾。同時功能檢測顯示pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 均在NMY32酵母中有功能，確認(rèn)誘餌蛋白能在NMY32 酵母中正確表達(dá)。

本研究利用表達(dá)功能相對更強的pBT3STESRPP7誘餌載體對構(gòu)建的MYTH cDNA文庫進(jìn)行篩選，并通過回轉(zhuǎn)驗證最終獲得21 個候選的HbSRPP7 互作蛋白。在這21 個候選互作蛋白中，有3 個REF 家族蛋白及2 個SRPP 家族蛋白。其中HbREF1（XM_021797910.1）及HbSRPP1（XM_021797905.1）已被證實與橡膠粒子發(fā)育相關(guān)[11， 21， 25-27]，并通過與CPT 蛋白直接或間接互作參與橡膠生物合成[7-8]。顯示HbSRPP7 可能通過與HbREF1 及HbSRPP1 等橡膠粒子互作，在橡膠粒子發(fā)育過程中發(fā)揮作用，或者作為橡膠生物合成相關(guān)蛋白復(fù)合體的組分之一參與橡膠生物合成。此外，HbSRPP7 候選互作蛋白中有2 個活性氧清除相關(guān)蛋白（thioredoxin H-type-like、L-ascorbateperoxidase 2）[28-29]和5 個脅迫相關(guān)蛋白（highmobility group B protein 2-like、RPM1- interactingprotein 4-like、stress-related protein-like、salt stressinducedhydrophobic peptide ESI3-like、F-box/kelch-repeat protein）[30-34]，表明HbSRPP7 可能通過蛋白互作參與橡膠樹乳管生物和非生物逆境脅迫的響應(yīng)。橡膠樹的膠乳是一種與生物和非生物逆境脅迫的響應(yīng)關(guān)聯(lián)的保護(hù)物質(zhì)，割膠可以顯著促進(jìn)膠乳中的橡膠生物合成[ 3 5 ] 。因此，HbSRPP7 除了可能通過與橡膠生物合成相關(guān)的橡膠粒子蛋白互作參與橡膠生物合成，也可能通過與生物和非生物逆境脅迫相關(guān)蛋白互作，響應(yīng)橡膠樹乳管細(xì)胞生物和非生物逆境脅迫系統(tǒng)信號，參與橡膠粒子上的橡膠生物合成調(diào)控。HbSRPP7與這些蛋白的相互作用在橡膠粒子上的具體功能尚有待確認(rèn)，下一步以免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）及雙分子熒光互補技術(shù)（bimolecular fluorescence complementation， BiFC）鑒定互作蛋白，并通過橡膠體外合成實驗及反向遺傳學(xué)研究手段對HbSRPP7 及其互作蛋白進(jìn)行功能研究，將有助于了解HbSRPP7 的功能及其功能發(fā)揮的機制，揭示橡膠粒子上參與橡膠生物合成的蛋白復(fù)合體組成，闡明橡膠生物合成及其調(diào)控的分子機制。