超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)的對映選擇性富集代謝

張?zhí)O 孫曉芳 鐘言茹 孔令茹 吳琦琦 施海燕 王鳴華

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，南京 210095）

農(nóng)藥施用后會經(jīng)地表徑流、淋溶和降雨沉降等方式進入水環(huán)境，在環(huán)境生物體內(nèi)發(fā)生吸收、分布和代謝，并進一步對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生如致死性、酶活性影響和“三致”性等毒性效應(yīng)行為，從而威脅水生生物安全。魚類模式生物斑馬魚（Danio rerio）具有軀體透明、周期短、易檢測且與人類基因同源性高等優(yōu)點，最初用于檢測水體中環(huán)境污染物[1]，目前已被廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)、遺傳學(xué)、藥物代謝和新藥篩選創(chuàng)制等研究領(lǐng)域[2-3]。生態(tài)毒理學(xué)研究常采用生物富集因子（BCF）、清除速率常數(shù)和半衰期評估農(nóng)藥在其體內(nèi)的吸收、分布和代謝過程的動力學(xué)終點[4]。

氯氟醚菌唑（Mefentrifluconazole）是由巴斯夫公司研發(fā)并上市的首個新型異丙醇三唑類殺菌劑[5]，與傳統(tǒng)三唑類殺菌劑相比，具有更高的選擇性和內(nèi)吸性，對多種抗性病原菌防治效果顯著，可延緩抗性發(fā)展[6]。氯氟醚菌唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有1 個手性中心，包含2 個對映體。對映體具有相同的理化性質(zhì)，但通常在活性、毒性和環(huán)境行為方面表現(xiàn)出較大差異[7]。國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）報告顯示，氯氟醚菌唑?qū)λ锞哂卸拘?，且其毒性還具有遺傳性，被視為潛在的肝臟有毒物質(zhì)。目前，已有研究表明氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚早期胚胎發(fā)育和幼魚生長具有選擇性致畸和神經(jīng)毒性[8]，并對其成魚具有肝臟毒性，進而影響其脂質(zhì)代謝過程[9]，但其在斑馬魚體內(nèi)的生物富集及代謝行為尚未明確。

本研究以斑馬魚為供試水生生物，從對映體水平研究氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚的急性毒性、富集代謝行為及代謝途徑，為揭示氯氟醚菌唑的對映體選擇性水生生物毒性效應(yīng)及其水生態(tài)風(fēng)險評估提供了理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC Xevo TQ-S Micro 型超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（沃特世科技（上海）有限公司）；Triple TOF?5600+型液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）；FA-25 型高剪切分散乳化機（德國FLUKO 公司）；JN25-12D 型超聲波清洗儀（寧波江南儀器廠）；Talboys 數(shù)顯型渦旋混合器（美國Henry Troemn 公司）；TDL-40B 型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；N-EVAP111 氮吹儀（美國Organomation 公司）。

甲酸和乙腈（色譜純，德國默克公司）；丙酮（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；C18吸附劑（46～60 μm）和Florisil 吸附劑（100～200 目，即篩孔0.154～0.075 mm）（天津Agela 生物技術(shù)有限公司）；氯氟醚菌唑標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥93.0%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）；氯氟醚菌唑?qū)τ丑w（純度≥99.9%，上海勤路生物技術(shù)有限公司）。

1.2 供試生物預(yù)培養(yǎng)

野生型品系斑馬魚成魚（3 月齡，體長1.5～2.5 cm）購自南京市夫子廟花鳥魚蟲市場，在實驗室條件下用脫氯自來水馴化培養(yǎng)14 d，水溫（24±1）℃，pH=7.5±0.5，光暗周期為14 h∶10 h，水中溶解氧濃度≥60%，自然死亡率低于5%方可開展實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性試驗

參照國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價實驗準(zhǔn)則 魚類急性毒性試驗》（GB/T 31270.12-2014）[10]和OECD 指南203 試驗準(zhǔn)則[11]開展氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚成魚的96 h 急性毒性試驗。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，選取致死率在10%～90%范圍的劑量進行正式實驗。Rac-氯氟醚菌唑、R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑的暴露濃度分別設(shè)置6 檔濃度梯度，每個濃度處理組隨機置入10 條斑馬魚，另設(shè)空白對照和0.1%丙酮溶劑對照組，每個實驗組設(shè)置3 個重復(fù)。實驗周期為96 h，觀察并記錄斑馬魚死亡數(shù)并及時清除死魚，使用DPS 7.05 計算半數(shù)致死濃度（LC50）。

1.3.2 斑馬魚生物富集和代謝清除試驗

參照GB/T 31270.7-2014[10]和OECD 指南305 試驗準(zhǔn)則[12]開展氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)的對映體選擇性生物富集和代謝清除試驗。根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果的1/10 和1/100，設(shè)置20 和200 μg/L 外消旋體濃度暴露組，另設(shè)0.1%丙酮對照組，每個實驗組放置200 條斑馬魚，不設(shè)重復(fù)。藥劑暴露14 d 后，將所有實驗組更換為清水進入7 d 代謝清除階段，整個實驗階段每24 h 更換50%的培養(yǎng)溶液。分別于暴露2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d 和14 d 后，以及代謝清除開始后2 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d 和7 d，從各實驗組隨機取10～12 條斑馬魚，流水反復(fù)沖洗，用濾紙吸取表面水分后于–80 ℃凍存。同時于暴露階段各取樣時間點取5 mL 暴露水樣于–20 ℃保存。

1.3.3 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w含量測定

Li 等[13]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）結(jié)合Chiralpak IG-3 手性色譜柱實現(xiàn)了氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的基線分離，并通過旋光儀和電子圓二色譜確定了氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的旋光性和絕對構(gòu)型。本研究在此基礎(chǔ)上測定斑馬魚和水樣中的氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的含量。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件 Chiralpak IG-3 手性色譜柱，柱溫35 ℃；流動相為0.1%甲酸-乙腈（10∶90，V/V）混合溶液，流速0.5 mL/min；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件 毛細管電壓為2.56 kV；去溶劑溫度為550 ℃；離子源溫度為500 ℃；去溶劑氣（氮氣）流速為650 L/h；電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測模式；母離子m/z398.3，子離子m/z70.0 和m/z182.2，錐孔電壓為23 V，碰撞能量為21 eV。

1.3.5 樣品前處理

斑馬魚樣品前處理 準(zhǔn)確稱取0.50 g 經(jīng)液氮粉碎的斑馬魚樣品，加入1 mL 水和5 mL 乙腈，渦旋5 min、超聲10 min，加入1 g NaCl，渦旋2 min，4000 r/min 離心5 min，經(jīng)C18和Florisils 凈化后，氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾后進行UPLC-MS/MS 分析。

水樣前處理 準(zhǔn)確量取5 mL 水樣，加入20 mL 乙腈，振蕩5 min，加入3.0 g NaCl，渦旋2 min，離心5 min，上清液過0.22 μm 有機濾膜后進行UPLC-MS/MS 分析。

1.3.6 方法驗證

準(zhǔn)確稱取氯氟醚菌唑外消旋體標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0101 g，用乙腈配制成1000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)母液，梯度稀釋成0.2～1000 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。根據(jù)1.3.5 節(jié)的方法制備空白基質(zhì)樣品，分別使用0.2～1000 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.4 節(jié)的儀器條件下進行測定。繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和各基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)斜率比評價基質(zhì)效應(yīng)[14]。

在空白樣品中添加4 個濃度水平（2、10、100 和1000 μg/kg）的氯氟醚菌唑?qū)τ丑w標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加濃度設(shè)5 個重復(fù)。按照1.3.5 節(jié)的方法提取凈化后進行UPLC-MS/MS 分析，計算回收率，評價其準(zhǔn)確度和精密度，并分別考察方法的日間精密度和日內(nèi)精密度[14]。

1.3.7 氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定

斑馬魚樣品按照1.3.5 節(jié)的方法前處理后，采用液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS/MS）對代謝產(chǎn)物進行分析鑒定[15-16]。

液相色譜條件 Poroshell 120 EC-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），流動相為0.1%甲酸-乙腈混合溶液，流速為0.2 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序為：0～5 min，5%乙腈；6～20 min，5%～30%乙腈；21～30 min，30%～95%乙腈；31～35 min，95%乙腈；36～38 min，95%～5%乙腈；36～38 min，5%乙腈。

高分辨質(zhì)譜條件 采用ESI+掃描模式，掃描范圍為m/z50～1000；毛細管電壓為5.5 kV；離子源溫度為550 ℃；霧化氣流量為650 L/h；錐孔電壓為30 V；碰撞能量為40 eV；霧簾氣壓為35 psi（1 psi=6.895 kPa）。利用PeakView 1.2 軟件根據(jù)精確分子質(zhì)量信息及二級質(zhì)譜圖等特征信息對實驗樣品中的氯氟醚菌唑及其代謝產(chǎn)物進行定性分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

農(nóng)藥化學(xué)品的生物富集能力通常通過生物富集系數(shù)（BCF）進行評估，當(dāng)農(nóng)藥化學(xué)品在生物體與環(huán)境中達到平衡時，兩者濃度之比即為穩(wěn)態(tài)生物富集因子（BCFss），計算公式見式（1）：

其中，Cf為達到穩(wěn)態(tài)時斑馬魚體內(nèi)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的濃度（mg/kg），Cw為達到穩(wěn)態(tài)時水中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的濃度（mg/L）。

在代謝清除階段，根據(jù)斑馬魚體內(nèi)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的殘留濃度隨時間的變化關(guān)系擬合一級動力學(xué)方程（式（2）），代謝半衰期（T1/2）通過式（3）計算：

其中，Ct為取樣時間點為t時樣品中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的質(zhì)量濃度（mg/kg），C0為氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的初始質(zhì)量濃度（mg/kg），k為代謝速率常數(shù)。

采用對映體分數(shù)（Enantiomeric fraction，EF，式（4））[17]作為評價氯氟醚菌唑?qū)τ丑w選擇性降解行為的指標(biāo)。

其中，CR和CS分別為樣品中R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑的濃度（mg/kg）。EF 值為某一對映體含量占消旋體含量的比值，取值范圍為0～1，通常用小數(shù)表示。EF=0.5 時，表示生物體內(nèi)兩對映體含量相同；EF 偏離0.5 時，表明該手性農(nóng)藥發(fā)生了對映體選擇性降解行為。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS分析方法評價

在1.3.4 節(jié)的UPLC-MS/MS 條件下，氯氟醚唑?qū)τ丑w在IG-3 手性柱上的流出順序為R-（-）-氯氟醚菌唑和S-（+）-氯氟醚菌唑。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

圖1 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的分離色譜圖Fig.1 Chromatogram of enantioseparation of mefentrifluconazole

斑馬魚空白樣品中，氯氟醚菌唑?qū)τ丑w出峰時間處均無干擾峰。氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在溶劑和各基質(zhì)中的線性回歸方程和基質(zhì)效應(yīng)見表1。在0.2～1000 μg/L 濃度范圍內(nèi)，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（R2>0.9932），LOQ 為2 μg/kg。分析結(jié)果表明，基質(zhì)斜率與溶劑斜率之比在0.8～1.2 之間，說明氯氟醚菌唑的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量檢測。

表1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定斑馬魚中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的線方程、基質(zhì)效應(yīng)及靈敏度Table 1 Linearity,matrix effects and sensitivity for determination of mefentrifluconazole enantiomers in zebrafish by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

在2、10、100 和1000 μg/kg 添加水平下，平均回收率為75.0%～106.1%，RSDs 為0.6%～8.2%（電子版文后支持信息表S1）。本方法滿足氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水和斑馬魚體內(nèi)的檢測要求。

2.2 氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚的對映體選擇性毒性

氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚的96 h 急性毒性試驗結(jié)果見表2，氯氟醚菌唑外消旋體及其對映體對斑馬魚的毒性順序為S-氯氟醚菌唑（LC50=1.68 mg/L）>Rac-氯氟醚菌唑（LC50=2.42 mg/L）>R-氯氟醚菌唑（LC50=3.33 mg/L），S-氯氟醚菌唑的毒性分別是R-氯氟醚菌唑和Rac-氯氟醚菌唑的2.0 倍和1.4 倍。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 31270.7—2014[10]中農(nóng)藥對魚類毒性的等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，氯氟醚菌唑外消旋體及其對映體對斑馬魚為中等毒性。此實驗結(jié)果與文獻[9，18]的研究結(jié)果一致，氯氟醚菌唑?qū)ν寥郎锍嘧訍蹌衮竞退锇唏R魚均表現(xiàn)為S-氯氟醚菌唑比R-對映體具有更高的毒性。

表2 氯氟醚菌唑及其對映體對斑馬魚的96 h急性毒性Table 2 Acute toxicity of mefentrifluconazole and its enantiomers to zebrafish in 96 h

2.3 氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)的對映體選擇性生物富集和代謝

如圖2 所示，兩種暴露濃度下的斑馬魚體內(nèi)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w含量變化趨勢相同。在暴露期間，水體中氯氟醚菌唑濃度基本保持穩(wěn)定，而斑馬魚樣品中兩對映體濃度在暴露開始3 d 內(nèi)迅速積累到最大值后再降低，然后緩慢上升并趨于穩(wěn)定。

圖2 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在斑馬魚體內(nèi)的對映體選擇性生物富集和代謝及其對映體分數(shù)（EF）值變化:（A）氯氟醚菌唑暴露濃度為20 μg/L 時，對映體的選擇性生物富集和代謝;（B）氯氟醚菌唑暴露濃度為200 μg/L 時，對映體的選擇性生物富集和代謝;氯氟醚菌唑暴露濃度分別為（C）20 μg/L 和（D）200 μg/L時，EF 值的變化圖Fig.2 Enantioselective bioaccumulation and elimination of mefentrifluconazole and enantiomeric fraction(EF)values in zebrafish:(A)Enantioselective bioconcentration and metabolism of mefentrifluconazole at an exposure concentration of 20 μg/L;(B) Enantioselective bioconcentration and metabolism of mefentrifluconazole at an exposure concentration of 200 μg/L;Changes in EF values when exposure concentrations of mefentrifluconazole are (C) 20 μg/L and (D) 200 μg/L,respectively

在同一濃度處理組，斑馬魚體內(nèi)R-氯氟醚菌唑濃度始終高于S-氯氟醚菌唑，顯著性分析結(jié)果表明，氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)存在顯著的對映體選擇性吸收現(xiàn)象，表現(xiàn)為R-氯氟醚菌唑優(yōu)先被富集（p<0.05）。結(jié)合圖2C 和圖2D 中的富集階段，在兩種處理濃度下EF 值始終大于0.5，并且在高濃度處理組中EF 值偏離0.5 的程度更高，表明R-氯氟醚菌唑在高濃度暴露下具有更強的選擇性富集能力。進一步計算得到表3 中兩對映體在低濃度處理下的BCFss分別為1.02 和0.62，在高濃度處理下的BCFss分別為8.38 和3.41，R-氯氟醚菌唑的BCFss分別為S-氯氟醚菌唑的1.64 和2.46 倍，并且較高的暴露濃度可能導(dǎo)致生物富集程度增加。

表3 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的動力學(xué)參數(shù)和穩(wěn)態(tài)生物富集因子（BCFss）值Table 3 Kinetic parameters and bioconcentration factors in the steady state (BCFss) values of mefentrifluconazole enantiomers

在清除階段，斑馬魚體中的R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑在2 d 內(nèi)迅速被機體代謝，濃度隨時間的變化關(guān)系可通過一級毒力學(xué)方程擬合，相關(guān)參數(shù)及半衰期列于表3。結(jié)果表明，低濃度處理時斑馬魚體內(nèi)兩對映體之間存在顯著的代謝速率差異（p<0.05），R-氯氟醚菌唑和S-氯氟醚菌唑半衰期分別為0.83和1.19 d，表現(xiàn)為斑馬魚對R-氯氟醚菌唑具有更大的清除速率常數(shù)和較短的半衰期，其EF 值逐漸變?。▓D2C）。但是，高濃度處理組中兩對映體在清除階段半衰期均為0.44 d，不存在對映體選擇性代謝行為。

雖然富集階段的變化規(guī)律不完全符合一級動力學(xué)模型，但與文獻報道過的其它化合物（如戊唑醇[19]、氟環(huán)唑[20]等）在斑馬魚體內(nèi)的富集規(guī)律相似。文獻[19，21]的研究結(jié)果表明，戊唑醇和己唑醇在成年斑馬魚中均顯示出顯著的對映選擇性生物富集行為。戊唑醇和己唑醇對映體之間表現(xiàn)為R-體優(yōu)先被富集，在代謝清除階段表現(xiàn)出S-體優(yōu)先被代謝。此外，Zhang 等[22]從對映體水平研究了經(jīng)不同濃度藥劑暴露的成年斑馬魚生物體對丙硫菌唑及其代謝物的對映體選擇性吸收和代謝行為。結(jié)果表明，不同濃度暴露下，對映體之間均表現(xiàn)為S-體優(yōu)先被富集而代謝階段無對映體選擇性。推測手性農(nóng)藥化合物在斑馬魚體內(nèi)富集階段的含量變化受富集行為和代謝行為共同作用。

2.4 氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)的代謝途徑

采用LC-Q-TOF-MS/MS 分別對氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進行了鑒定分析，氯氟醚菌唑及其代謝物的提取離子色譜圖和特征碎片離子比對結(jié)果見電子版文后支持信息圖S1，相關(guān)代謝物的分子式及特征性質(zhì)譜信息見電子版文后支持信息表S2。

母體氯氟醚菌唑出峰時間為10.33 min，m/z398.0877，二級質(zhì)譜中產(chǎn)生的m/z70.0425 特征碎片離子（電子版文后支持信息圖S1A）為三唑氮環(huán)的離子。在斑馬魚樣品中，共鑒定出8 種氯氟醚菌唑的代謝產(chǎn)物，其中包括3 種Ⅰ相代謝物和5 種Ⅱ相結(jié)合物。

代謝物1#（m/z288.0955）在5.80 min 處出峰，此化合物由母體化合物苯環(huán)上C—O 鍵斷裂產(chǎn)生，結(jié)合二級質(zhì)譜圖碎片離子m/z199.0585 與此結(jié)構(gòu)中斷開C—C 鍵和C—F 鍵后的結(jié)構(gòu)質(zhì)荷比一致，推斷代謝物1#為M003（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1B）。代謝物2#（m/z414.0826）在9.09 min 處出峰（電子版文后支持信息表S2），此化合物由母體化合物含Cl 苯環(huán)的鄰、間位羥基化形成代謝物M016 或M017（電子版文后支持信息圖S1C），也可以由母體化合物甲基羥基化反應(yīng)形成代謝物M039（電子版文后支持信息圖S1D），還可以由母體化合物三唑氮環(huán)的羥基化反應(yīng)形成M086（電子版文后支持信息圖S1E）。代謝物3#（m/z414.0934）在9.16 min 處出峰，此化合物由母體化合物甲基羥基化反應(yīng)形成代謝物M039 后進一步在含Cl 苯環(huán)的鄰、間位引入羥基形成，結(jié)合二級質(zhì)譜圖碎片離子m/z70.0427 和295.1744 與此結(jié)構(gòu)中斷鍵后的結(jié)構(gòu)質(zhì)荷比一致，推斷代謝物3#為M074（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1F）。

結(jié)合物1#（m/z368.0525）在4.88 min 處出峰，此化合物由母體代謝生成代謝物M003 后，在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生硫酸化反應(yīng)生成硫酸酯化合物，二級質(zhì)譜中脫硫酸基形成特征碎片離子m/z288.0969，因此推斷結(jié)合物1#為M071（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1G、S1H）。結(jié)合物2#（m/z460.0786）在6.94 min 處出峰，此化合物由母體經(jīng)脫氯羥基化后，酚羥基在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生硫酸化反應(yīng)生成硫酸酯化合物，二級質(zhì)譜中脫硫酸基形成特征碎片離子m/z380.1225，推斷結(jié)合物2#為M092（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1I）。類似地，結(jié)合物3#（m/z494.0395）在7.49 min 處出峰，結(jié)合物4#（m/z510.0343）在7.88 min 處出峰，兩種化合物均由母體經(jīng)羥基化后，繼而在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生硫酸化反應(yīng)生成硫酸酯化合物，二級質(zhì)譜中脫硫酸基分別形成特征碎片離子m/z414.0855 和m/z430.0814，因此推斷結(jié)合物3#為M072/M060（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1J 和圖S1K）、結(jié)合物4#為M057/M090（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1L 和圖S1M）。結(jié)合物5#（m/z590.1143）在7.21 min 處出峰，此化合物由母體代發(fā)生羥基化反應(yīng)后，在葡萄糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合生成葡萄糖醛酸絡(luò)合物，二級質(zhì)譜中脫硫酸基形成特征碎片離子m/z414.0852，因此推斷結(jié)合物5#為M035/M045（電子版文后支持信息表S2，電子版文后支持信息圖S1N）。

本研究初步鑒定獲得3 種Ⅰ相代謝物和5 種Ⅱ相結(jié)合物，首次在斑馬魚體內(nèi)鑒定出了羥基化代謝物M074 和葡萄糖醛酸絡(luò)合物M035、M045 以及硫酸酯化合物M057、M071。代謝物M003 被報道為氯氟醚菌唑在地表水和沉積物中的主要代謝產(chǎn)物，而M016/M017 被報道為大鼠體內(nèi)主要的代謝產(chǎn)物[7]，并鑒定出主要Ⅱ相代謝物M072 為硫酸酯化合物[7]。根據(jù)質(zhì)譜分析獲得的代謝產(chǎn)物信息，進一步推測了氯氟醚菌唑在斑馬魚體內(nèi)可能的代謝途徑（圖3）。結(jié)果表明，氯氟醚菌唑的羥基化作用為主要的Ⅰ相代謝途徑，進而在磺基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成水溶性更強的Ⅱ相代謝產(chǎn)物而排出體外。

圖3 氯氟醚菌唑在動物代謝中的Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑。圖中虛線箭頭標(biāo)注的產(chǎn)物為推斷的可能產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，但實際樣品中未檢測到Fig.3 Phase Ⅰand phase Ⅱmetabolic pathways of mefentrifluconazole in animals.The products labeled with dashed arrows in the figure are inferred possible intermediates that are not detected in the actual samples

3 結(jié)論

本研究探究了氯氟醚菌唑?qū)λ唏R魚的對映選擇性毒性及富集代謝行為。氯氟醚菌唑?qū)Π唏R魚為中等毒性，在斑馬魚體內(nèi)屬于低富集農(nóng)藥，R-氯氟醚菌唑優(yōu)先被富集；初步鑒定獲得3 種Ⅰ相代謝物和5 種Ⅱ相結(jié)合物，其中，羥基化代謝物M074 和葡萄糖醛酸絡(luò)合物M035、M045 以及硫酸酯化合物M057、M071 為首次鑒定。羥基化作用為其主要的Ⅰ相代謝途徑，進而在磺基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成水溶性更強的Ⅱ相代謝產(chǎn)物而排出體外。本研究可為氯氟醚菌唑?qū)λh(huán)境中的生物安全及人類健康風(fēng)險評估提供參考依據(jù)，但推測的代謝產(chǎn)物需要進一步驗證，代謝物的毒性有待進一步了解。

支持信息

Supporting Information

圖S1 氯氟醚菌唑及其代謝產(chǎn)物的二級質(zhì)譜圖Fig.S1 MS2 spectra of mefentrifluconazole and its metabolites in animals

表S2 氯氟醚菌唑及其代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息Table S2 Information of mass spectrometric data for mefentrifluconazole and its metabolites