G-四鏈體結(jié)構(gòu)用于固相納米孔增敏

王葉盛 于春淼 李艷茹 李冰凌*

1（中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，電分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130022）

2（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)與工程學(xué)院，合肥 230026）

納米孔技術(shù)是一種具有廣闊前景的單分子技術(shù)，可對(duì)蛋白質(zhì)、核酸及聚合物等多種分子進(jìn)行高靈敏度、高通量以及免標(biāo)記分析[1-11]。在直徑為納米級(jí)別的孔道兩端施加一定的電壓時(shí)，會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定的電流，當(dāng)尺寸與孔徑相近的單個(gè)待測(cè)分子穿過孔道時(shí)，會(huì)產(chǎn)生阻塞效應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)的電流改變[12]。通過對(duì)阻塞時(shí)間、阻塞電流強(qiáng)度、阻塞頻率以及阻塞電流形狀等進(jìn)行分析，有望得到待測(cè)物的長度、尺寸、濃度以及結(jié)構(gòu)等方面的相關(guān)信息。納米孔通常分為由蛋白質(zhì)構(gòu)成的生物納米孔[13-16]與由無機(jī)或有機(jī)材料制成的固相納米孔[17-20]兩類。生物納米孔作為最新一代測(cè)序方法，已被廣泛應(yīng)用于DNA 測(cè)序[2]，但其相對(duì)較小的孔徑（通常小于5 nm）限制了檢測(cè)對(duì)象的范圍。相比之下，固相納米孔具有更高的化學(xué)/機(jī)械穩(wěn)定性和尺寸可控性，并可以在相對(duì)寬松的環(huán)境（pH、溫度和離子強(qiáng)度）下進(jìn)行長時(shí)間穩(wěn)定的信號(hào)讀出，但較差的分辨率與制備重現(xiàn)性限制了其應(yīng)用，特別對(duì)于尺寸遠(yuǎn)小于固相孔孔徑的分子（如短鏈核酸等）時(shí)，無法滿足檢測(cè)的要求。

在本研究組前期的工作中，通過向納米孔電解質(zhì)中加入具有高介電常數(shù)的溶劑甲酰胺，使納米孔的低頻電噪聲降低了約3 個(gè)數(shù)量級(jí)，并首次使用無修飾的錐形玻璃裸孔對(duì)催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)（Catalytic hairpin assembly，CHA）進(jìn)行了原位跟蹤[21]?；谠撛雒舨呗裕墒褂霉滔嗉{米孔檢測(cè)到低至59 nt 的DNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)。但是，受孔徑因素的制約，在對(duì)100 bp 左右的CHA 單體產(chǎn)物進(jìn)行表征時(shí)，仍可能存在事件（Event）捕獲量較低的缺陷[22]。同時(shí)，甲酰胺對(duì)于蛋白質(zhì)和RNA 等具有一定的破壞性，這也在一定程度上限制了該策略檢測(cè)的靶標(biāo)范圍。另外，通過對(duì)核酸分子線路的設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，已經(jīng)能得到可控的單體[21]以及尺寸與聚合度可控的1～4 聚體[22]，但在單體表征方面，仍可能無法產(chǎn)生滿意的、可重復(fù)的放大效應(yīng)，需開發(fā)相應(yīng)的解決方案。

本課題組在前期工作中利用分裂模式G-四鏈體結(jié)構(gòu)放大雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）納米孔信號(hào)[23]，基于此，本研究以CHA 單體為模型，加入一條新的富G 短鏈與其結(jié)合，在組裝體的尾端形成了分裂模式的G-四鏈體。此結(jié)構(gòu)增加了組裝體的易位體積，可將組裝體的易位電流放大2～3 倍，并在未加入甲酰胺的條件下，對(duì)反應(yīng)單體的易位事件進(jìn)行了穩(wěn)定捕捉。不同于之前工作中的分裂G-四鏈體形成模式，即在底物發(fā)夾5′端或3′端添加分裂模式的G-四鏈體序列[23]，本研究在原有序列的基礎(chǔ)上，將其中單一反應(yīng)底物的3′端延長約10 nt，并基于單體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一條富G 短鏈與其結(jié)合?；诟籊 短鏈與結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)的可編輯性，本方法具有靈活性與普適性。同時(shí)，本方法無需加入甲酰胺，因此有望拓展檢測(cè)靶標(biāo)范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DS-11 FX+分光光度計(jì)（美國DeNovix 公司）；FlexCycler2多功能PCR 儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；Axon Axopatch 200B 膜片鉗放大器、Axon Digidata 1550B 數(shù)模轉(zhuǎn)換器（美國MD 公司）；SUTTER P-2000 激光微電極拉制器（美國Sutter Instrument 公司）。

甲酰胺、LiCl（Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司）。除非另有說明，本研究使用的試劑均為分析純。CHA 緩沖液（pH=8.0）:20 mmol/L Tris-HCl、140 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L MgCl2。所有寡核苷酸序列均由上海生工有限公司合成，并在初次使用前使用PAGE 純化，其序列如表1 所示。所有寡核苷酸均溶解在1 × TE 緩沖液中（10 mmol/L Tris-HCL,l mmol/L EDTA,pH=7.5）中，于?20 ℃儲(chǔ)存。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的DNA序列Table 1 Sequences of DNA primers used in the experiment

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玻璃錐形納米孔的制備與表征

玻璃錐形納米孔由石英玻璃管（外徑1 mm，內(nèi)徑0.7 mm，美國Sutter Instrument 公司）拉制而成，在使用前將玻璃管在現(xiàn)制的食人魚溶液（98% H2SO4/30% H2O2，3∶1，V/V）中浸泡約1.5 h，以除去其表面的有機(jī)雜質(zhì)。使用去離子水將玻璃管沖洗干凈，置于丙酮中超聲20 min，置于丙酮中保存。在采集納米孔信號(hào)前，將玻璃管置于真空干燥箱中，于70 ℃下干燥20 min，使用P-2000 移液管拉制器拉制納米孔，備用。本研究中使用的所有納米孔均使用同一拉制參數(shù)：HEAT=760，F(xiàn)IL=4，VEL=31，DEL=120，PUL=170。

1.2.2 納米孔數(shù)據(jù)的采集與分析

所有納米孔數(shù)據(jù)的采集均在實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)與搭建的納米孔測(cè)試平臺(tái)[21-23]上進(jìn)行。在進(jìn)行DNA 易位實(shí)驗(yàn)前，樣品溶液被注入納米孔尖端外側(cè)的玻璃樣品池（cis端），向玻璃錐形納米孔（trans端）中注入與樣品池中溶液離子強(qiáng)度一致的電解質(zhì)溶液，并排出孔中氣泡，確保電解質(zhì)溶液完全注入納米孔孔尖。在樣品池和孔內(nèi)腔中分別放置2 個(gè)氯化銀電極，用于施加電位。在采集納米孔數(shù)據(jù)時(shí)，在納米孔兩端施加600 mV 的恒電位，從而驅(qū)動(dòng)樣品池中的DNA 樣品定向穿孔。離子電流由Axopatch 200B 電流放大器采集，使用5 kHz 的低通Bassel 濾波器，并使用Digidata 1550B 數(shù)字化儀以250 kHz 的采樣頻率進(jìn)行數(shù)字化。使用Clampfit 11.2 軟件對(duì)電流信號(hào)進(jìn)行處理，根據(jù)閾值收集易位數(shù)據(jù)，其中，最小電流幅度水平為20 pA，最小易位時(shí)間為0.02 ms。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫（25 ℃）下進(jìn)行。

1.2.3 三通催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)

選擇三通催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)（3-way catalytic hairpin assembly reaction，3w-CHA reaction）為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始前，將C1、H1、H2 和H3 的儲(chǔ)備液在CHA 緩沖液中稀釋至5 μmol/L，在95 ℃下孵育5 min，以0.1 ℃/s 的變溫速度降溫至25 ℃。在40 μL CHA 反應(yīng)體系中，C1 的最終濃度為0.025 μmol/L，H1、H2 和H3 的最終濃度為0.25 μmol/L，并加入終濃度為40 mmol/L 的KCl 溶液。25 ℃下孵育反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物與2 μL 上樣緩沖液混合，采用2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，每毫升瓊脂糖凝膠含有0.07 μL Gel Red 染料。電泳在1×TAE 緩沖液中進(jìn)行，在120 V 電壓下運(yùn)行35 min 后，在紫外燈下對(duì)核酸條帶進(jìn)行觀察。另取20 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，與10 μL 甲酰胺（100%）和20 μL 10 mol/L LiCl 混合，制成樣品溶液，采用納米孔表征。

1.2.4 附加分裂模式G-四鏈體的催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)

在1.2.3 節(jié)的反應(yīng)體系中，增加一條S 鏈，其濃度與加入體積均與H2 相同。在40 μL CHA 反應(yīng)體系中，S 的最終濃度為0.25 μmol/L。在K+的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，在反應(yīng)開始2 h 后，向?qū)?yīng)的反應(yīng)體系中補(bǔ)充KCl溶液，使K+的終濃度為40 mmol/L，無K+的反應(yīng)體系則補(bǔ)充等體積的CHA 緩沖液，并繼續(xù)反應(yīng)1 h，使反應(yīng)總時(shí)間為3 h。電泳與納米孔樣品的配制均與1.2.3 節(jié)相同。

1.2.5 附加完整G-四鏈體的催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)

在H2 的3′端加添加完整的G-四鏈體序列（GGGTGGGTGGGTGGGT，T30695），得到新的H2 發(fā)夾（H2-G）。與1.2.4 節(jié)的實(shí)驗(yàn)相比，將H2 替換為等體積與濃度的H2-G，并移除加入的S 鏈。其余步驟與1.2.4節(jié)相同。

1.2.6 熒光共振能量轉(zhuǎn)移表征

在熒光共振能量轉(zhuǎn)移表征中，新加入F 和Q，并使用H3-FQ 替換H3。在反應(yīng)開始前，將濃度相同的F 和Q 按體積比3∶4 混合，在95 ℃下孵育5 min，以0.1 ℃/s 的變溫速度降溫至25 ℃，備用，其它步驟與1.2.3～1.2.5 節(jié)對(duì)應(yīng)的反應(yīng)前準(zhǔn)備步驟相同。在終體積為40 μL 的CHA 反應(yīng)體系中，C1（若存在）的終濃度為0.01 μmol/L，H1、H2（H2-G）、H3-FQ 和S（若存在）的終濃度均為0.10 μmol/L，F(xiàn) 的終濃度為0.15 μmol/L，Q 的終濃度為0.20 μmol/L，并加入終濃度為2 μmol/L 的dT21，防止熒光吸附造成讀數(shù)損失。將反應(yīng)體系混合均勻，立刻取17 μL 產(chǎn)物于Cytation-5 全自動(dòng)微孔板檢測(cè)器（美國Bio Tek Instrument）中，在25℃條件下，每1.5 min 進(jìn)行一次讀數(shù)。

1.2.7 原卟啉(Protoporphyrin IX,PPIX)熒光表征

使用PPIX 熒光驗(yàn)證是否形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。在反應(yīng)開始2 h 后，向反應(yīng)體系中加入終濃度為0.5 μmol/L 的PPIX 溶液，并繼續(xù)反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，取17 μL 產(chǎn)物于全自動(dòng)微孔板檢測(cè)器中，在25 ℃、410 nm 的激發(fā)波長下，記錄580～660 nm 的熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)的原理以及附加G-四鏈體的催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)的設(shè)計(jì)

本研究的基礎(chǔ)是產(chǎn)物為三叉（也稱三臂）結(jié)構(gòu)的CHA 反應(yīng)，簡(jiǎn)稱3w-CHA 反應(yīng)。該反應(yīng)涉及3 個(gè)發(fā)夾底物H1、H2 與H3，彼此之間存在部分互補(bǔ)的序列，但受動(dòng)力學(xué)勢(shì)阱的制約，相互之間的雜交反應(yīng)被嚴(yán)重抑制。如圖1A 所示，當(dāng)存在長度為24 nt 的引發(fā)劑C1 時(shí)，1*結(jié)構(gòu)域與發(fā)夾底物H1 的1 結(jié)構(gòu)域雜交，啟動(dòng)一個(gè)基于立足點(diǎn)遷移的鏈置換反應(yīng)，進(jìn)而將發(fā)夾底物H1 的莖打開，釋放出3*結(jié)構(gòu)域；基于同樣的原理，3*結(jié)構(gòu)域與發(fā)夾底物H2 的3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，可將發(fā)夾底物H2 的莖打開，釋放出4 結(jié)構(gòu)域；4 結(jié)構(gòu)域與發(fā)夾底物H3 的4*結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，可將發(fā)夾底物H3 的莖打開，最終形成H1·H2·H3 結(jié)構(gòu)，并將C1釋放回溶液中，繼續(xù)進(jìn)行催化反應(yīng)[24，25]。如圖1B 所示，在底物發(fā)夾H2 被打開后，S 鏈的5*與8*結(jié)構(gòu)域可與H2 的5、8 結(jié)構(gòu)域雜交，并在H2 與S 鏈連接端的外側(cè)保留a 與b 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)存在一定濃度的K+時(shí)，a 與b 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可形成3∶9 分裂模式的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。如圖1C 所示，將3w-CHA 中的H2 替換為H2-G 后，通過CHA 反應(yīng)，可得到反應(yīng)產(chǎn)物H1·H2-G·H3。當(dāng)存在一定濃度的K+時(shí)，其結(jié)構(gòu)域c 可自身形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。在下文中，將附加分裂模式G-四鏈體序列的催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)產(chǎn)物（3w-CHA with split G-quadruplex tail）簡(jiǎn)稱為sG4-CHA，該反應(yīng)簡(jiǎn)稱為sG4-CHA 反應(yīng)；對(duì)于附加完整G-四鏈體序列的催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)產(chǎn)物（3w-CHA with full G-quadruplex tail）稱為G4-CHA，該反應(yīng)簡(jiǎn)稱為G4-CHA 反應(yīng)。將加入了C1 的反應(yīng)體系作為反應(yīng)組，未加入C1 的反應(yīng)體系作為對(duì)照組。

圖1 3 種催化發(fā)夾自組裝（CHA）反應(yīng)的原理示意圖：（A）3w-CHA 反應(yīng)；（B）sG4-CHA 反應(yīng)；（C）G4-CHA 反應(yīng)Fig.1 Schematic diagram of three kinds of catalytic hairpin assembly(CHA)reactions: (A)3w-CHA reaction;(B)sG4-CHA reaction;(C)G4-CHA reaction

2.2 3w-CHA、G4-CHA以及sG4-CHA的電泳與熒光表征

首先采用凝膠電泳和熒光共振能量轉(zhuǎn)移兩種方式對(duì)2.1 節(jié)中的3 種CHA 反應(yīng)進(jìn)行了表征。由圖2A的電泳條帶可見，3w-CHA、G4-CHA 與sG4-CHA 在有無C1 加入時(shí)區(qū)分明顯，可以由此判斷C1 的確對(duì)反應(yīng)具有驅(qū)動(dòng)作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方式如圖2B 所示，當(dāng)未發(fā)生CHA 反應(yīng)時(shí)，H3-FG 的結(jié)構(gòu)域“7”被包埋在發(fā)夾的莖中；發(fā)生反應(yīng)后，結(jié)構(gòu)域“7”被釋放，在溶液中可與F-Q 形成的Reporter 雙鏈體（Reporter duplex）發(fā)生基于立足點(diǎn)遷移的鏈遷移反應(yīng)，將標(biāo)記有猝滅基團(tuán)的探針Q 從雙鏈體上置換，并產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光信號(hào)。分析圖2C 的熒光動(dòng)力學(xué)曲線可知，對(duì)于3w-CHA、G4-CHA 與sG4-CHA反應(yīng)，在K+不存在時(shí)，反應(yīng)組均展現(xiàn)出遠(yuǎn)快于對(duì)照組的熒光增強(qiáng)速度，進(jìn)一步驗(yàn)證了C1 對(duì)于CHA 反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)（催化）作用。并且G4-CHA 與sG4-CHA 反應(yīng)組的產(chǎn)物電泳條帶深度和熒光增強(qiáng)速度均與3w-CHA 非常相近，說明替換H2 或引入S 鏈后，并不會(huì)對(duì)CHA 反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面影響。值得注意的是，在不含K+的反應(yīng)體系下，G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成趨勢(shì)較弱，因此，同時(shí)考察了K+對(duì)于G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成的影響。由圖2A 可見，K+加入與否，電泳條帶幾乎沒有區(qū)別，因此僅從電泳圖上無法判斷是否形成了G-四鏈體結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證G4-CHA 與sG4-CHA 兩種反應(yīng)是否能夠按照預(yù)期設(shè)計(jì)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，利用PPIX熒光法驗(yàn)證G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成，其原理圖如圖2D 所示，PPIX 在水溶液中通常聚集成低熒光背景的膠束，與G-四鏈體結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。對(duì)比了K+存在與否時(shí)G4-CHA 與sG4-CHA 反應(yīng)的反應(yīng)組，結(jié)果如圖2E 所示。因?yàn)镠2-G 自身具有完整的G-四鏈體序列，在較高濃度一價(jià)陽離子（Na+）存在下，也會(huì)誘導(dǎo)形成一部分G-四鏈體結(jié)構(gòu)[26]，所以G4-CHA 的兩組PPIX 信號(hào)相差不大。sG4-CHA 的PPIX 信號(hào)較弱，加入K+后，信號(hào)較強(qiáng)，表明隨著K+的加入形成了分裂模式的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。K+存在時(shí)，sG4-CHA的PPIX 信號(hào)強(qiáng)度低于G4-CHA，這是由于分裂模式的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的[27]。

圖2 3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的電泳與熒光表征：（A）3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的瓊脂糖凝膠電泳表征；（B）熒光動(dòng)力學(xué)原理示意圖；（C）3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的熒光動(dòng)力學(xué)表征；（D）原卟啉（PPIX）熒光原理示意圖；（E）G4-CHA 與sG4-CHA 的PPIX 熒光表征Fig.2 Electrophoretic and fluorescence characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(A)Agarose gel electrophoresis characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(B)Schematic diagram of fluorescence dynamics;(C)Fluorescence characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(D)Schematic diagram of protoporphyin IX (PPIX) fluorescence;(E)PPIX fluorescence characterization of G4-CHA and sG4-CHA

2.3 3w-CHA、G4-CHA以及sG4-CHA的納米孔表征

利用固相納米孔對(duì)3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 進(jìn)行了表征。固相納米孔的裝置如圖3A 所示。對(duì)于3w-CHA，截取基線電流與部分原始電流，對(duì)300 s 的原始電流進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，繪制穿孔電流與穿孔時(shí)間的散點(diǎn)圖（圖3B），反應(yīng)組與對(duì)照組的事件量與分布相差較明顯；對(duì)相應(yīng)的穿孔電流進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制其絕對(duì)值的分布圖（圖3C），反應(yīng)組的穿孔電流集中在?40 pA 附近，相比對(duì)照組的電流分布為5～10 pA，這也與本研究組此前的研究結(jié)果基本吻合[21-22]。

圖3 3w-CHA 的納米孔表征：（A）納米孔裝置的示意圖；（B）3w-CHA 對(duì)照組與反應(yīng)組的原始電流以及穿孔電流與穿孔時(shí)間的散點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖；（C）3w-CHA 對(duì)照組與反應(yīng)組的穿孔電流絕對(duì)值的分布圖。所有數(shù)據(jù)均由同一納米孔測(cè)得Fig.3 Nanopore characterization of 3w-CHA: (A)Schematic diagram of the nanopore set-up;(B)The current traces and the scatter statistics of the amplitude and duration time of 3w-CHA;(C)Distribution of absolute of amplitude of 3w-CHA.All the data are measured with the same nanopore

對(duì)于G4-CHA 及sG4-CHA，分別對(duì)不存在C1 與K+、僅存在C1、僅存在K+以及同時(shí)存在C1 與K+這4 種條件下的產(chǎn)物進(jìn)行了納米孔表征。對(duì)于G4-CHA，分別截取相應(yīng)的原始電流（圖4A），繪制了對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖（圖4B），不存在K+時(shí)，G4-CHA 的反應(yīng)組與對(duì)照組的事件量相差明顯；統(tǒng)計(jì)對(duì)應(yīng)的穿孔電流，繪制了絕對(duì)值的分布圖（圖4C），相較于對(duì)照組，反應(yīng)組的穿孔電流有較大偏移，在–50～–100 pA 的范圍內(nèi)存在較多事件。發(fā)生電流偏移的原因可能是H2-G 的G-四鏈體序列在Na+影響下形成了部分G-四鏈體結(jié)構(gòu)，剛性的G-四鏈體會(huì)增加組裝體的相對(duì)體積，從而增加穿孔電流。K+存在時(shí)，反應(yīng)組與對(duì)照組的事件量相差明顯，并且反應(yīng)組存在明顯的電流偏移，在–50～–150 pA 范圍內(nèi)存在較多事件。此時(shí)，事件數(shù)的差異與電流偏移均可歸結(jié)于G4-CHA 反應(yīng)的進(jìn)行程度不同。

圖4 G4-CHA 與sG4-CHA 的納米孔表征：（A）不同條件下G4-CHA 的部分原始電流;（B）不同條件下G4-CHA 的穿孔電流與穿孔時(shí)間的散點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖;（C）不同條件下G4-CHA 的穿孔電流絕對(duì)值的分布圖;（D）不同條件下sG4-CHA 的部分原始電流;（E）不同條件下sG4-CHA 的穿孔電流與穿孔時(shí)間的散點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖;（F）不同條件下sG4-CHA 的穿孔電流絕對(duì)值的分布圖。所有數(shù)據(jù)均由同一納米孔測(cè)得Fig.4 Nanopore characterization of G4-CHA and sG4-CHA: (A) Current traces of G4-CHA under different conditions;(B) Scatter statistics of amplitude and duration time of G4-CHA under different conditions;(C) The distribution of absolute of amplitude of G4-CHA under different conditions;(D) Current traces of sG4-CHA under different conditions;(E) Scatter statistics of amplitude and duration time of sG4-CHA under different conditions;(F)The distribution of absolute of amplitude of sG4-CHA under different conditions.All the data are measured with the same nanopore

對(duì)于sG4-CHA，分別截取相應(yīng)的原始電流（圖4D），繪制了對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖（圖4E），不存在K+時(shí)，sG4-CHA 的反應(yīng)組與對(duì)照組的事件量相差明顯，此時(shí)即可判斷反應(yīng)是否發(fā)生；統(tǒng)計(jì)對(duì)應(yīng)的穿孔電流，并繪制了絕對(duì)值的分布圖（圖4F），其穿孔電流集中在?50 pA 附近，相較于3w-CHA，sG4-CHA 的穿孔電流整體有增大的趨勢(shì)，這是由于結(jié)合了S 鏈的sG4-CHA 尺寸略有增加。存在K+時(shí)，sG4-CHA 的對(duì)照組與反應(yīng)組相較于不存在K+時(shí)均有較大的電流偏移且事件數(shù)增加。事件數(shù)增加主要來自G-四鏈體帶來的結(jié)構(gòu)放大效應(yīng)，電流偏移則來自分裂模式形成的G-四鏈體。相較于背景組，反應(yīng)組在–100～–150 pA 范圍內(nèi)存在更多的穿孔事件，整體的電流分布也明顯偏移。兩者的分布圖差異較明顯，可以判斷反應(yīng)是否發(fā)生。

綜上，與3w-CHA 反應(yīng)相比，G4-CHA 反應(yīng)與sG4-CHA 反應(yīng)在K+的調(diào)控下，均能實(shí)現(xiàn)較大的信號(hào)增敏。即使在不加入K+時(shí)，G4-CHA 與sG4-CHA 的反應(yīng)組與對(duì)照組的電流分布區(qū)分明顯。同時(shí)，對(duì)于不加入C1 的對(duì)照組，加入K+也能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。相較于sG4-CHA，G4-CHA 在不加入K+時(shí)也具有一定的背景，而sG4-CHA 在不存在與存在K+時(shí)差距明顯。在底物發(fā)夾H2 未打開時(shí)，S 鏈與H2 只有6 個(gè)互補(bǔ)堿基，不足以使H2 與S 鏈穩(wěn)定結(jié)合。發(fā)生CHA 反應(yīng)后，或至少在H2 被H1 打開后，H2 與S 鏈存在12 個(gè)互補(bǔ)堿基，此時(shí)H2 與S 鏈才能較穩(wěn)定地結(jié)合，因此sG4-CHA 對(duì)K+的調(diào)控能力更出色。同時(shí)，鑒于H2-G自身帶來的高PPIX 背景，使得根據(jù)G4-CHA 反應(yīng)的PPIX 熒光無法判斷G-四鏈體結(jié)構(gòu)是否在CHA 產(chǎn)物上形成，相較之下，由于存在一步S 鏈與單體產(chǎn)物的結(jié)合步驟，sG4-CHA 反應(yīng)的PPIX 熒光大致能反映分裂模式G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成數(shù)量。因此，從序列設(shè)計(jì)與多角度表征等方面考慮，選擇引入表征方式相對(duì)較多、背景較低、序列靈活性較高的分裂模式G-四鏈體結(jié)構(gòu)作為增敏方法更合適。

2.4 sG4-CHA在水相中的納米孔表征

本研究已經(jīng)驗(yàn)證了3∶9 分裂模式G-四鏈體結(jié)構(gòu)的信號(hào)放大作用。為了進(jìn)一步探索此設(shè)計(jì)的增敏效果，移除了電解質(zhì)與樣品中的降噪組分（甲酰胺），并將其替換為等體積的水，對(duì)K+存在條件下的sG4-CHA 進(jìn)行了納米孔表征。分別截取相應(yīng)的原始電流（圖5A），繪制對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖（圖5B），統(tǒng)計(jì)對(duì)應(yīng)的穿孔電流分布，繪制其絕對(duì)值的分布圖（圖5C）。盡管原始電流波動(dòng)較大，但仍能捕捉到sG4-CHA 的穿孔事件（電流變化幅度大于50 pA）。從事件分布較多的穿孔電流范圍（–50～–150 pA）來看，反應(yīng)組在各個(gè)電流區(qū)間的事件數(shù)均多于對(duì)照組，且整體電流分布相較于對(duì)照組偏移約20 pA。反應(yīng)組的事件數(shù)接近于對(duì)照組的3 倍，這也與原始電流基本相符。上述結(jié)果說明固相納米孔在水相中也能成功識(shí)別反應(yīng)是否發(fā)生，即在無需加入降噪組分時(shí)，此增敏策略也能成功實(shí)現(xiàn)對(duì)sG4-CHA 的捕捉。

圖5 在水相中sG4-CHA 的納米孔表征：（A）sG4-CHA 的部分原始電流；（B）sG4-CHA 的穿孔電流與穿孔時(shí)間的散點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖；（C）sG4-CHA 穿孔電流絕對(duì)值的分布圖。所有數(shù)據(jù)均由同一納米孔測(cè)得Fig.5 Nanopore characterization of the products of sG4-CHA in water: (A)Current traces of sG4-CHA;(B)Scatter plots of sG4-CHA;(C)Columnar distribution of absolute of amplitude of sG4-CHA.All the data are measured with the same nanopore

3 結(jié)論

本研究提出了一種基于G-四鏈體結(jié)構(gòu)的納米孔增敏策略，能增加固相納米孔對(duì)小尺寸核酸組裝體的識(shí)別與捕捉。3w-CHA 反應(yīng)單體附加完整模式或分裂模式的G-四鏈體序列后，均可通過控制G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成實(shí)現(xiàn)納米孔信號(hào)放大。相較于完整模式的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，分裂模式的G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有更低的背景與更高的序列設(shè)計(jì)靈活性。本方法僅需對(duì)3w-CHA 反應(yīng)中單個(gè)底物略做修改，并加入一條經(jīng)過設(shè)計(jì)的約20 nt 的短鏈，即可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)在產(chǎn)物上附加分裂模式的G-四鏈體序列，通過控制G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成，可將產(chǎn)物的穿孔電流增大約2～3 倍，借此實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子組裝產(chǎn)物的高靈敏檢測(cè)。值得注意的是，在單體產(chǎn)物上附加分裂模式G-四鏈體序列后，固相納米孔能準(zhǔn)確捕捉與判斷是否形成G-四鏈體，這證明固相納米孔具有分析納米結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)構(gòu)象的能力，也表明此結(jié)構(gòu)具有作為K+特異性響應(yīng)的分子機(jī)器的潛力。在移除了具有較差生物相容性的降噪組分甲酰胺后，此增敏策略同樣能準(zhǔn)確檢測(cè)小分子核酸組裝體，這有利于靶標(biāo)范圍向RNA 等方向拓展。未來，通過對(duì)納米孔分析平臺(tái)裝置、納米孔孔徑等重要因素的優(yōu)化，可能為更小的靶標(biāo)檢測(cè)提供基礎(chǔ)，推動(dòng)固相納米孔在核酸分子層面的表征的發(fā)展與應(yīng)用。