紅豆杉多糖對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟抗氧化作用研究

張宇彤,李欣然,焦文軒,郝浚含,史 巖,2

(1.佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007; 2.黑龍江省痛風(fēng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 佳木斯 154000)

衰老是機(jī)體無法抗拒的自然規(guī)律,是身體對客觀環(huán)境的生理及心理適應(yīng)能力的進(jìn)展性下降,逐漸走向死亡的現(xiàn)象[1-2]。個體衰老是自然因素、環(huán)境因素及病理因素共同作用的結(jié)果,其中病理因素是指慢性消耗性疾病(如惡性腫瘤、高血壓、糖尿病等),容易造成身體長期的營養(yǎng)不良,加速衰老進(jìn)程[3]。D-半乳糖能引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞DNA與細(xì)胞膜的氧化損傷,不利于細(xì)胞的正常生長及代謝,會加速衰老與凋亡進(jìn)程[4-5]。紅豆杉的藥用價(jià)值很高,含有紫杉萜、黃酮類、多糖類、糖苷類、揮發(fā)油等多種有效成分,具有溫腎通經(jīng)、利尿消腫、祛邪散結(jié)等功效,可治療腎病、高血壓、高脂血癥等慢性疾病[6],但在抗衰老方面的機(jī)制尚不明確。本研究分析了紅豆杉多糖對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟組織及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級雄性昆明小鼠,60日齡,體重18～22 g。D-半乳糖、維生素E均來自 Biotopped公司。丙二醛試劑盒(MDA)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH-PX)、谷胱甘肽還原酶試劑盒(GR)、過氧化氫酶試劑盒(CAT)、組織蛋白測定試劑盒均來自南京建成生物研究所。

UV1810紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)),HH-10恒溫水浴箱(常州市中貝儀器有限公司生產(chǎn)),Multiskan FC酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司生產(chǎn)]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及給藥

雄性昆明小鼠(清潔級)60只,除陰性對照組,其他各組小鼠均通過頸部皮下注射D-半乳糖150 mg/(kg.d),共 8 周。衰老小鼠分為5組,即衰老模型組、陽性對照組及紅豆杉多糖高、中、低劑量組,另設(shè)陰性對照組。各組均有10只小鼠樣本。造模第 3周起,紅豆杉高、中、低劑量組分別灌服800 mg/(kg.bw)、400 mg/(kg.bw)、200 mg/(kg.bw)紅豆杉多糖溶液,陽性對照組灌胃200 mg/(kg.bw)維生素E水溶液,另兩組灌服200 mg/(kg.bw)生理鹽水。連續(xù)給藥6周。

1.2.2 抗氧化測定指標(biāo)的測定

實(shí)驗(yàn)完成后,用乙醚麻醉小鼠,檢測其腎臟組織蛋白含量、MDA、 SOD、GSH-PX、GR及CAT,按照試劑盒上的方法操作。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況觀察

陰性對照組小鼠生長狀況良好。衰老模型組小鼠表現(xiàn)毛色無光澤,精神萎靡,活動力差。陽性對照組及紅豆杉多糖高劑量組小鼠均表現(xiàn)出良好的精神狀態(tài),活動能力良好,進(jìn)食量良好。

2.2 紅豆杉多糖對衰老小鼠抗氧化作用

2.2.1 對衰老小鼠腎臟臟器指數(shù)的影響

腎臟各組別間的臟器指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組相比,模型組及紅豆杉多糖低劑量組臟器指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而陰性對照組與陽性對照組及紅豆杉多糖高、中劑量組臟器指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比,5組的臟器指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,臟器指數(shù)均高于模型組,表示衰老模型成功。與低劑量組相比,陰性對照組、高劑量組、中劑量組臟器指數(shù)差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組與陽性對照組相比,臟器指數(shù)之間有明顯差異(P<0.05),紅豆杉多糖高劑量組與中劑量組相比,臟器指數(shù)相近,即差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),高劑量組的臟器指數(shù)最高。詳見表1與圖1。

圖1 臟器指數(shù)Fig.1 Visceral index

2.2.2 對衰老小鼠腎臟組織過氧化氫酶(CAT)活力的影響

腎臟各組別間CAT活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組小鼠CAT活力水平有差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組做相比,5組試驗(yàn)小鼠的CAT活力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),5組的CAT活力均高于模型組;與陽性對照組相比,模型組、紅豆杉多糖低劑量組CAT活力差異達(dá)到了顯著性水平(P<0.05),與紅豆杉多糖低劑量組相比,陰性對照組、模型組、陽性對照組、高劑量組CAT活力之間差異明顯(P<0.05);與紅豆杉多糖中劑量組相比,陰性對照組、模型組、高劑量組CAT活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中劑量組與低劑量組、陽性對照組CAT活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);陰性對照組與陽性對照組及紅豆杉多糖高劑量組CAT活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1與圖2。

2.2.3 對衰老小鼠腎臟組織中丙二醛(MDA)含量的影響

腎臟各組別間的MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,5組的MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,MDA含量均低于模型組;與陽性對照組相比,模型組、紅豆杉多糖低劑量組MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低劑量組相比,5組的MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。紅豆杉多糖高劑量組與中劑量組MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組及紅豆杉多糖高劑量組MDA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1與圖3。

圖3 MDA含量Fig.3 MDA content

2.2.4 對衰老小鼠腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

腎臟各組別間的超氧化物歧化酶活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組SOD活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,5組的SOD活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SOD活力均高于模型組;與陽性對照組相比,紅豆杉多糖中、低劑量組SOD活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低劑量組相比,其他5組的SOD活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與中劑量組相比,陽性對照組、高劑量組SOD活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組SOD活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1與圖4。

圖4 SOD活力Fig.4 SOD vitality

2.2.5 對衰老小鼠腎臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力的影響

腎臟各組別間的谷胱甘肽過氧化物酶活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組相比,模型組、紅豆杉多糖高劑量組GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,5組的GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,GSH-PX活力均高于模型組;與低劑量組相比,模型組、陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組、紅豆杉多糖中劑量組GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。紅豆杉多糖高劑量組與陽性對照組相比,GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);紅豆杉多糖高劑量組與紅豆杉多糖中劑量組相比,GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組、紅豆杉多糖中、低劑量組GSH-PX活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1與圖5。

圖5 GSH-PX活力Fig.5 GSH-PX vitality

2.2.6 對衰老小鼠腎臟組織中谷胱甘肽還原酶(GR)活力的影響

腎臟各組別間的谷胱甘肽還原酶活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組之間做比較,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組GR活力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,5組的GR活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,GR活力均高于模型組;與低劑量組相比,其他5組的GR活力差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。紅豆杉多糖中劑量組與陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組GR活力差異明顯(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組GR活力體現(xiàn)出均衡性,即差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1與圖6。

圖6 GR活力Fig.6 GR vitality

表1紅豆杉多糖對衰老小鼠腎臟組織中MDA、SOD、CAT、GSH-PX、GR、臟器指數(shù)的影響

Tab.1InfluenceofTaxuspolysaccharideonMDA,SOD,CAT,GSH-PX,GRandorganindexinkidneytissueofagingmice

3 討論

腎臟很易被氧化應(yīng)激所傷,而自由基的增加會使機(jī)體出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng),糖尿病、高血脂癥等慢性消耗性疾病可能會引起氧化應(yīng)激,還可能是環(huán)境因素造成自由基增加導(dǎo)致的。腎臟是機(jī)體受衰老影響最顯著的一個器官,是功能減退最為快速的器官之一[7]。LDF被認(rèn)為是機(jī)體衰老的一個主要表征,與MDA、谷胱甘肽(GSH) 、SOD共同作為衰老標(biāo)志物[8]。植物多糖有廣泛的生物活性,目前,紅豆杉多糖的研究主要集中在降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面,在抗衰老方面報(bào)道較少。很多研究選擇MDA、SOD、GSH-PX等作為氧化應(yīng)激損傷分析的主要參考指標(biāo)。SOD是體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶,能催化超氧陰離子自由基歧化生成氧與過氧化氫,維持機(jī)體氧化與抗氧的平衡狀態(tài),減少細(xì)胞損傷問題。GSH-PX自身是一種過氧化物分解酶,能夠把有毒性的過氧化物還原成羥基化合物,減少過氧化物對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能的侵害,發(fā)揮良好的保護(hù)效用。MDA是具有代表性的硫代巴比妥酸反應(yīng)物,是衡量脂質(zhì)過氧化物水平的標(biāo)志。CAT是組成抗氧化系統(tǒng)的一部分,是過氧化物酶體的一類標(biāo)志酶,占所有過氧化物酶總量的40%左右,是催化過氧化氫(H2O2)分解的常用工具,抗氧化性較強(qiáng),能減輕因機(jī)體氧化應(yīng)激引起的功能或結(jié)構(gòu)損傷程度。CAT能強(qiáng)化機(jī)體對羥基自由基及超氧陰離子的抵制能力,可顯著減少M(fèi)DA含量[9-11]。

通過建立衰老模型檢測紅豆杉多糖對衰老小鼠腎臟的抗氧化功能,研究表明,與衰老模型組相比,陰性對照組、陽性對照組及紅豆杉多糖高、中、低劑量組的MDA含量、SOD、GSH-PX、GR、CAT的活力差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,5組的臟器指數(shù)差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,5組臟器指數(shù)均高于模型組,SOD、GSH-PX、GR、CAT活力均有提高,MDA含量水平均呈現(xiàn)出走低態(tài)勢,說明成功建設(shè)了衰老模型。與低劑量組相比,陰性對照組、高劑量組、中劑量組臟器指數(shù)差異顯著,紅豆杉多糖高劑量組與陽性對照組相比,臟器指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高劑量組的臟器指數(shù)為最高。結(jié)果表明,紅豆杉多糖可增加小鼠臟器指數(shù),對衰老小鼠具有抗氧化作用,劑量越高抗氧化作用越明顯。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組的MDA含量、CAT、SOD、GR活力差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與紅豆杉多糖低劑量組相比,陽性對照組、高劑量組的MDA含量、SOD、CAT、GR、GSH-PX活力差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。紅豆杉多糖中劑量組與高劑量組的MDA含量、CAT、SOD、GSH-PX、GR活力活力差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,紅豆杉多糖組抗氧化作用高劑量組優(yōu)于中劑量組優(yōu)于低劑量組。紅豆杉多糖高劑量組與陽性對照組相比,GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;陰性對照組、陽性藥對照組、紅豆杉多糖高劑量組的MDA含量、CAT、SOD、GR活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;陰性對照組與紅豆杉多糖高劑量組GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中紅豆杉多糖高劑量組GSH-PX活力高于陽性對照組。陽性對照組與紅豆杉多糖組對衰老小鼠腎臟均具有抗氧化作用,而高劑量的紅豆杉多糖抗氧化作用效果更為明顯,有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。

4 結(jié)論

紅豆杉多糖可提高衰老小鼠腎臟組織中的SOD、GSH-PX、GR、CAT活力,降低MDA含量,發(fā)揮抗氧化作用,且高劑量紅豆杉多糖抗氧化作用優(yōu)于維生素E,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為紅豆杉多糖對衰老小鼠腎臟抗氧化作用的應(yīng)用提供理論依據(jù)。