基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機(jī)制*

姜健,嚴(yán)軍

上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,上海 201800

防己黃芪湯出自張仲景的《金匱要略》,為固表益氣、祛風(fēng)利濕的經(jīng)典良方。全方由防己、黃芪、白術(shù)、甘草組成,防己和黃芪為君藥,具有益氣固表、祛風(fēng)行水之效;臣藥為白術(shù),佐以健脾補(bǔ)氣祛濕,助君藥之效;甘草為佐使藥,以助君臣,兼以調(diào)和諸藥[1]。防己黃芪湯在現(xiàn)代臨床運(yùn)用中較為廣泛,涉及肥胖、糖尿病等代謝性疾病及腎臟疾病、心肺疾病、肢體關(guān)節(jié)痛、風(fēng)濕性疾病、癌病等[2-3]。在中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)等撰寫的2021年《基于臨床的肥胖癥多學(xué)科診療共識(shí)》中指出,中醫(yī)辨證論治是治療肥胖癥的有效手段之一,推薦防己黃芪湯治療脾虛不運(yùn)型肥胖[4]。一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照的臨床研究表明,防己黃芪湯可有效改善單純性肥胖患者的肥胖指標(biāo)和血脂水平,提高臨床療效[5]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)方法探討防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機(jī)制,為后續(xù)深入進(jìn)行機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 防己黃芪湯有效活性成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)獲取防己黃芪湯組方中藥的化學(xué)成分,設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18,獲得防己黃芪湯的有效活性成分。同時(shí)通過(guò)TCMSP平臺(tái)預(yù)測(cè)有效藥物活性成分的作用靶點(diǎn)。最后利用 Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 單純性肥胖的疾病靶點(diǎn)獲取通過(guò)查詢 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)和 在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/),以“simple obesity”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選,將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行合并,刪除重復(fù)項(xiàng),獲取單純性肥胖的疾病靶點(diǎn)。其中,GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的疾病靶點(diǎn)選取相關(guān)度評(píng)分(relevance score)≥3的靶點(diǎn)。

1.3 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn)通過(guò)Omicshare平臺(tái)(https://www.omicshare.com/)將單純性肥胖疾病靶點(diǎn)與防己黃芪湯有效成分相關(guān)作用靶點(diǎn)取交集,繪制藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖,交集靶點(diǎn)即為防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 “中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵有效活性成分篩選將篩選獲得的防己黃芪湯治療單純性肥胖的交集靶點(diǎn)和其對(duì)應(yīng)的活性成分、中藥導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,并運(yùn)用Analyze Network進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?依據(jù)Degree值大小決定節(jié)點(diǎn)大小,節(jié)點(diǎn)越大,該節(jié)點(diǎn)越關(guān)鍵,并依此篩選出關(guān)鍵藥物活性成分[6]。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/),蛋白物種設(shè)置為“Homo sapiens”,最低相互作用閾值設(shè)為medium confidence>0.4,隱藏蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中孤立靶點(diǎn),其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置,獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果,并以TSV格式導(dǎo)出。運(yùn)用Cytoscape 3.9.1軟件將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化,利用“Cytohubba”插件進(jìn)行拓?fù)浞治?按照Degree大小排序,將Degree排名前8位的靶點(diǎn)進(jìn)行聚類展示,并以此作為核心靶點(diǎn)[7]。

1.6 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn)的富集分析應(yīng)用R軟件中Bioconductor模塊軟件包“org.Hs.eg.db”運(yùn)行完entrez ID轉(zhuǎn)換;采用R軟件中的“DOSE”“clusterProfiler”等模塊對(duì)篩選出防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析,以P<0.05為篩選參數(shù),輸出富集分析結(jié)果,然后使用ImageGP平臺(tái)(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將GO和 KEGG分析的結(jié)果進(jìn)行可視化調(diào)整,制成對(duì)應(yīng)的氣泡圖。

1.7 防己黃芪湯關(guān)鍵藥物活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載防己黃芪湯的關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu);利用PYMOL 2.5.0軟件對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去除水分子、去除配體等操作,并采用 AutoDock Tools 軟件進(jìn)行加氫、平衡電荷等修飾,最后將受體蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。利用 AutoDockVina軟件對(duì)受體蛋白與配體小分子進(jìn)行分子對(duì)接,獲得關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能參數(shù),最后運(yùn)用PYMOL 2.5.0軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 防己黃芪湯有效活性成分及靶點(diǎn)通過(guò)TCMSP平臺(tái)獲得防己黃芪湯各組方中藥的有效活性成分及作用靶點(diǎn),然后利用 Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,最終獲得黃芪的有效活性成分16個(gè),相應(yīng)靶點(diǎn)99個(gè);防己有效活性成分2個(gè),相應(yīng)靶點(diǎn)18個(gè);白術(shù)有效活性成分3個(gè),相應(yīng)靶點(diǎn)11個(gè);甘草有效活性成分88個(gè),相應(yīng)靶點(diǎn)107個(gè),見(jiàn)表1。將所有中藥的有效活性成分以及靶點(diǎn)整合,刪除重復(fù)項(xiàng),獲得防己黃芪湯有效活性成分101個(gè),相應(yīng)靶點(diǎn)110個(gè)。

表1 防己黃芪湯部分藥物活性成分

2.2 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn)整合GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得單純性肥胖的疾病靶點(diǎn)總數(shù)為1 195個(gè)。將單純性肥胖的疾病靶點(diǎn)與防己黃芪湯有效活性藥物成分的110個(gè)作用靶點(diǎn)取交集,獲得61個(gè)治療靶點(diǎn),即是防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

圖1 單純性肥胖疾病靶點(diǎn)與防己黃芪湯有效活性成分靶點(diǎn)VEEN圖

2.3 “中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖和關(guān)鍵有效藥物成分篩選結(jié)果將防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn)和其對(duì)應(yīng)的活性成分、中藥導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化,構(gòu)成“中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖2。運(yùn)用Analyze Network進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?獲得159個(gè)節(jié)點(diǎn),708個(gè)邊,按照Degree的大小排序,排名前4位的化合物為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素,即為防己黃芪湯的關(guān)鍵藥物活性成分,后續(xù)與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。

圖2 “中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)的篩選結(jié)果防己黃芪湯治療單純性肥胖的61個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),然后獲得PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果,以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化,形成涉及60個(gè)靶點(diǎn),578對(duì)蛋白互作關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。利用“Cytohubba”插件篩選出 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值前8位的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行聚類,并以此作為核心靶點(diǎn),即是白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3)、雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ESR1)、MYC、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)。見(jiàn)圖3。

圖3 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在作用靶點(diǎn)的富集分析結(jié)果GO富集分析選取生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC) 和 分子功能(molecular function,MF) 中可信度前20位的條目進(jìn)行注釋,見(jiàn)圖4。在BP中,潛在作用靶點(diǎn)主要富集在類固醇激素反應(yīng)(response to steroid hormone)、對(duì)酮的反應(yīng)(response to ketone)、活性氧代謝過(guò)程(reactive oxygen species metabolism process)、類固醇激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)(cellular response to steroid hormone stimulus)、缺氧反應(yīng)(response to hypoxia)等;在CC中,靶點(diǎn)蛋白集中在薄膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、囊泡腔(vesicle lumen)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)、血漿脂蛋白顆粒(plasma lipoprotein particle)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(RNA polymerase Ⅱ transcription factor complexe)等;而MF分析顯示,潛在作用靶點(diǎn)主要富集在核受體活性(nuclear receptor activity),轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合(transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding),類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity),DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase Ⅱ-specific),氧化還原酶活性、作用于NAD(P)H、血紅素蛋白作為受體(oxidoreductase activity,acting on NAD (P) H,heme protein as receptor),半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡過(guò)程(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process),氧化還原酶活性、作用于配對(duì)供體、結(jié)合或還原分子氧(oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen),泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding),ATP酶結(jié)合(ATPase binding),激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)等。

注:圖中的點(diǎn)越大,說(shuō)明富集的基因越多,圓點(diǎn)顏色越紅,說(shuō)明富集的可信度越大。圖4 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析的結(jié)果選取可信度排名前30位的通路,見(jiàn)圖5。靶點(diǎn)基因主要富集的信號(hào)通路為胰島素抵抗(insulin resistance)、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、p53信號(hào)通路(p53 signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等,同時(shí)還涉及卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、丙型肝炎(hepatitis C)、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、乙型肝炎(hepatitis B)等病毒感染相關(guān)通路,以及結(jié)直腸癌(colorectal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、乳腺癌(breast cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)等癌癥相關(guān)通路。

注:圖中圓點(diǎn)越大,說(shuō)明富集的基因越多,圓點(diǎn)顏色越紅,說(shuō)明富集的可信度越大。圖5 KEGG信號(hào)通路富集分析

2.6 防己黃芪湯關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接將槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素四個(gè)關(guān)鍵活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選的核心靶點(diǎn)IL-6、PPARG、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、EGFR、HIF1A進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果見(jiàn)表2,圖6。一般認(rèn)為,當(dāng)配體與受體結(jié)合能量越低時(shí),其結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定,相互作用的可能性越大,當(dāng)最低化學(xué)結(jié)合能<0 kcal·mol-1

注:圖中關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)交叉點(diǎn)的顏色代表其分子對(duì)接結(jié)合能的大小,顏色越紅,代表其結(jié)合能越高;顏色越藍(lán),代表其結(jié)合能越低。圖6 防己黃芪湯關(guān)鍵藥物活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果熱圖

表2 防己黃芪湯關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果 (kcal·mol-1)

時(shí)可以在自然狀態(tài)下對(duì)接;最低化學(xué)結(jié)合能<-5 kcal·mol-1時(shí),對(duì)接結(jié)果良好;結(jié)合能<-7.0 kcal·mol-1表示受體與配體之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[8-9]。根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果可知,關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)均具有良好的結(jié)合活性。而HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR與關(guān)鍵活性成分結(jié)合能較低,因此上述4個(gè)蛋白是治療靶點(diǎn)的可能性更大,其中PPARG涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝信號(hào)通路;HIF1A涉及卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、化學(xué)致癌-活性氧、HIF-1信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖信號(hào)通路;CASP3涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、麻疹、酒精性肝病、TNF信號(hào)通路、大腸癌、弓形蟲病、丙型肝炎、EB病毒感染、乙型肝炎、IL-17信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、細(xì)胞凋亡、鉑類耐藥性、p53信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝、癌癥中的蛋白聚糖、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路;EGFR涉及化學(xué)致癌-受體激活、化學(xué)致癌-活性氧、前列腺癌、大腸癌、丙型肝炎、內(nèi)分泌抵抗、人巨細(xì)胞病毒感染、乳腺癌、HIF-1信號(hào)通路、胰腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、肝細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等。相關(guān)蛋白涉及的信號(hào)通路及蛋白間的網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖7。其中PPARG、HIF1A與關(guān)鍵活性成分(槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素)之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性,因此運(yùn)用PYMOL 2.5.0軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化,見(jiàn)圖8。

3 討論

肥胖是由遺傳和環(huán)境等因素共同作用,導(dǎo)致機(jī)體總脂肪含量過(guò)多和/或局部脂肪含量增多及分布異常的慢性代謝性疾病[10],其常導(dǎo)致或伴發(fā)心血管疾病、2型糖尿病、癌癥和膽囊疾病等[11]。雖然飲食、身體活動(dòng)和行為改變是減重的基石,但僅通過(guò)改變生活方式實(shí)現(xiàn)的體質(zhì)量減輕通常是有限的并且難以維持,而且從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看是無(wú)效的[12],因此藥物治療的手段必不可少。目前用于治療肥胖的藥物主要有奧利司他、利拉魯肽等[13],但其胃腸道反應(yīng)常導(dǎo)致患者不能耐受,而針灸、中藥等傳統(tǒng)中醫(yī)藥療法是減重的有效方法[14-15],其易于接受,引起的不良反應(yīng)相對(duì)較少。

中醫(yī)認(rèn)為肥胖的發(fā)生多與飲食不節(jié)、多逸少勞、脾虛不運(yùn)、腎陽(yáng)虛衰、肝氣郁結(jié)等因素有關(guān)[16],在2021年《基于臨床的肥胖癥多學(xué)科診療共識(shí)》[4]中指出,依據(jù)肥胖的病因病機(jī)進(jìn)行辨證分型論治是治療肥胖癥的有效手段之一,推薦防己黃芪湯治療脾虛不運(yùn)型肥胖。一項(xiàng)臨床研究結(jié)果表明,防己黃芪湯能夠有效降低肥胖患者的BMI和血脂,且可調(diào)節(jié)瘦素(leptin)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)水平[17]。

目前,尚無(wú)防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機(jī)制研究,因此,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討防己黃芪湯治療單純性肥胖的作用機(jī)制,為后續(xù)圍繞其關(guān)鍵靶點(diǎn)與信號(hào)通路進(jìn)一步深入開展實(shí)驗(yàn)研究提供方向。

本研究通過(guò)防己黃芪湯作用靶點(diǎn)和單純性肥胖靶點(diǎn)蛋白取交集,獲得潛在治療靶點(diǎn)61個(gè);潛在的治療靶點(diǎn)通過(guò)擴(kuò)展的網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出前8位關(guān)鍵治療靶點(diǎn),即IL-6、PPARG、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、EGFR、HIF1A;而結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果顯示,HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR與關(guān)鍵活性成分結(jié)合能的絕對(duì)值排名靠前,因此上述4個(gè)蛋白是治療靶點(diǎn)可能性更大。缺氧抑制因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF1A)是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,在組織對(duì)缺氧的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,在肥胖的脂肪組織中表達(dá)增加[18],從而誘導(dǎo)白色脂肪組織纖維化和炎癥,導(dǎo)致肥胖相關(guān)的代謝功能障礙[19]。CASP3是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,在多細(xì)胞生物中高度保守,作為細(xì)胞凋亡的中樞調(diào)節(jié)因子[20],可以誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的凋亡[21]。PPARG主要在白色和棕色的脂肪組織中表達(dá),與靶基因啟動(dòng)子調(diào)控序列結(jié)合,作為調(diào)節(jié)脂肪組織中前脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子,在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞代謝中起重要作用[22];EGFR是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員,在調(diào)節(jié)脂肪組織的存活、增殖、遷移和分化中起著核心作用,可以調(diào)控下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/Akt途徑影響糖酵解和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),改善胰島素抵抗[23]。

HIF1A表達(dá)增加受EGFR/MEK/ERK通路的激活控制[24],而HIF1A可誘導(dǎo)產(chǎn)生和分泌血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)。分泌到微環(huán)境中的PDGF通過(guò)作用于脂肪前體細(xì)胞表達(dá)的PDGF受體,從而激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK),特異性地磷酸化PPARG,從而抑制PPARG活性以及脂肪前體細(xì)胞的分化潛能[25]。CASP3轉(zhuǎn)化為其活性形式被認(rèn)為是細(xì)胞死亡信號(hào)級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵過(guò)程[26],而有研究結(jié)果顯示,抑制HIF1A蛋白水平可以誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞CASP3的表達(dá)[27],進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的凋亡。因此,HIF1A、EGFR、PPARG、CASP3可共同調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化與凋亡。

GO富集分析結(jié)果表明,潛在的作用靶點(diǎn)主要集中在類固醇激素反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、缺氧反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程,定位在薄膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔等細(xì)胞部位,影響核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性,類固醇激素受體、細(xì)胞凋亡過(guò)程、氧化還原酶活性等分子功能,調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的生命活動(dòng)。KEGG 富集分析顯示,防己黃芪湯治療單純性肥胖的重要信號(hào)通路包括脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、p53信號(hào)通路、胰島素抵抗、HIF-1信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝等。脂肪毒性誘導(dǎo)的肝臟炎癥與肥胖引起的脂肪組織改變和重塑有關(guān),導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝病。脂聯(lián)素及其同源受體,特別是肝臟中的脂聯(lián)素受體-2的全面串?dāng)_通過(guò)與肝PPARG的相互作用改善肥胖誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病[28]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,可誘導(dǎo)人類癌癥低氧條件下的適應(yīng)性反應(yīng)[29],通過(guò)下調(diào)HIF-1信號(hào)通路中Akt1和HIF-1α的蛋白表達(dá),上調(diào)VEGFA蛋白表達(dá)[30],可以促進(jìn)微血管生成,改善細(xì)胞氧供。AGEs與AGE受體相互作用,產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥、胰島素抵抗和細(xì)胞衰老等生物過(guò)程;有研究表明,脂肪細(xì)胞中AGE/RAGE軸在調(diào)節(jié)肥胖和胰島素抵抗中具有關(guān)鍵作用;另外,RAGE可以上調(diào)Caspase 3,從而誘發(fā)細(xì)胞死亡[31-32]。TNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因有Ptgs2和Socs3、Caspase-3基因[33]。細(xì)胞膜上TNFR1在與活性形式的TNF-α結(jié)合后,可以激活Caspase等凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)細(xì)胞凋亡[34]。IL-17是一個(gè)重要的促炎癥細(xì)胞因子,由輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17,Th17)及先天性免疫細(xì)胞等分泌,在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[35];IL-17信號(hào)通路主要活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路、蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路,從而導(dǎo)致炎癥、腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多個(gè)生理過(guò)程[36]。因此,防己黃芪湯治療單純性肥胖的重要通路與炎癥、氧化過(guò)程、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡等通路密切相關(guān)。

分子對(duì)接的結(jié)果顯示,槲皮素、山柰酚、異鼠李素、芒柄花黃素與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合良好,其中槲皮素、山柰酚、異鼠李素分子對(duì)接結(jié)果更優(yōu)。有實(shí)驗(yàn)研究表明,槲皮素能夠抑制脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的MAPK信號(hào)因子ERK1/2、JNK、p38MAPK以及 MCP-1、TNF-α和炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的分泌,并刺激抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌,從而抑制脂肪形成和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[37]。山柰酚可抑制TLR4/NF-κB通路來(lái)改善腸屏障完整性并抑制腸道炎癥以及調(diào)節(jié)肥胖盲腸微生物群的生態(tài)失調(diào)[38]。另有一些研究顯示,山柰酚可能通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦中樞以達(dá)到減重效果[39]。異鼠李素可以降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物和產(chǎn)脂酶的mRNA表達(dá)以減少肝臟脂質(zhì)含量[40],亦有抗炎、減少高糖高脂誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的作用[41]。

綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接分析防己黃芪湯治療單純性肥胖的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯治療單純性肥胖可能的核心活性成分是槲皮素、山柰酚、異鼠李素等,潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)是 HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR等,關(guān)鍵信號(hào)通路包括AGE-RAGE、TNF、IL-17、細(xì)胞凋亡、p53、胰島素抵抗、HIF-1、非酒精性脂肪肝等。提示,防己黃芪湯可以通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同機(jī)制治療單純性肥胖,是臨床治療單純性肥胖的基方,后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)與信號(hào)通路開展實(shí)驗(yàn)及臨床研究。