• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    卵巢上皮性癌轉移的關鍵基因篩選與功能分析*

    2023-11-08 01:12:16吳巧鈴陳雨微
    現(xiàn)代婦產科進展 2023年10期
    關鍵詞:劃痕隊列卵巢癌

    吳巧鈴,姜 山,2**,陳雨微,孫 陽***

    (1.福建省腫瘤醫(yī)院婦科 福建醫(yī)科大學腫瘤臨床醫(yī)學院,福州 350014;2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,福州 350122)

    卵巢癌死亡率居于婦科惡性腫瘤首位,由于臨床表現(xiàn)隱匿、早期癥狀不典型且缺乏有效的篩查手段,大多數患者確診時已為晚期[1-2]。卵巢癌亞型復雜,具有不同的分子生物學特征,即使采用外科手術輔以全身化療這一首選治療方案,幾乎所有患者都會復發(fā)[3-4]。進一步深入研究卵巢癌轉移機制,并在此基礎上尋找新的治療靶點具有重要意義。PXN作為一種蛋白質編碼基因,編碼細胞骨架蛋白——樁蛋白(paxillin),該蛋白聯(lián)合VCL(vinculin)和ZYX(zyxin)蛋白通過LC3參與細胞和黏著斑(FAs)位點的黏附過程,影響癌細胞的遷移和侵襲[5-7]。本研究挖掘卵巢癌中高表達的遷移侵襲相關基因PXN并驗證其生物學功能,以期為晚期卵巢癌轉移機制提供新的理論依據和治療新靶點。

    1 材料與方法

    1.1 細胞系與試劑 卵巢癌細胞系SKOV3細胞由福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院贈送。McCoy's 5A培養(yǎng)基購自上海源培生物科技公司;新生胎牛血清購自德國PAN公司;兔抗人PXN單克隆抗體購自英國Abcam公司;兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國CST公司;HRP標記的羊抗兔第二抗體購自北京中杉金橋公司;ECL化學發(fā)光試劑購自大連美侖生物公司;RNA提取試劑盒購自美國Promega公司;逆轉錄試劑盒購自Roche公司;Transwell透明小室及Matrigel基質膠購自美國Corning公司;PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體購自上海吉凱基因公司。

    1.2 篩選、分析卵巢上皮性癌(卵巢癌)轉移的關鍵基因

    1.2.1 卵巢癌公共測序數據獲取及處理 通過UCSC Xena(University Of Cingifornia Sisha Cruz,加州大學圣克魯茲分校)門戶下載來自于TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌癥基因組圖譜)數據庫的卵巢癌組織測序數據作為訓練集,以及來自GTEx(Genotype-Tissue Expression Project,基因型-組織表達數據庫)的正常卵巢組織測序數據,并通過TCGA數據庫補充訓練集缺失的臨床信息[8]。通過GEO(Gene Expression Omnibus,基因表達綜合)數據庫下載卵巢癌基因芯片數據及臨床信息GSE26712作為驗證集[9]。所有數據利用軟件R進行基因注釋,并處理為log2(TPM+1)進行后續(xù)分析,刪除缺失值,相同基因取平均值去重。

    1.2.2 遷移侵襲能力相關基因的獲取 在GeneCards(人類基因數據庫,https://www.genecards.org/)綜合數據庫中分別輸入搜索詞“migration”和“invasion”,從該數據庫下載遷移侵襲相關基因,以相關分數“Relevance score”>7為條件,篩選出與細胞遷移侵襲能力相關性較高的基因。

    1.2.3 差異表達分析 利用R 4.2.2及l(fā)imma算法聯(lián)合TCGA與GTEx數據庫進行差異表達分析,對比遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達水平。以差異表達倍數logFC>1和adj.P<0.001為篩選條件,尋找在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因。應用“ggplot2”R包繪制火山圖對差異表達分析結果進行可視化。

    1.2.4 生存分析 根據遷移侵襲相關基因表達中位值將全部卵巢癌樣本分為高低表達兩組,應用“survival”R包計算高低表達兩組之間生存差異。通過交集獲取在訓練集TCGA隊列及驗證集GSE26712隊列都具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的遷移侵襲相關基因,應用“survminer”R包進行生存曲線可視化。

    1.2.5 GO/KEGG功能富集分析 基于TCGA卵巢癌數據集以“cortest”函數進行相關性分析,以|R|>0.7及P<0.05為篩選標準,獲得與遷移侵襲基因顯著相關的基因群,應用“clusterProfiler”R包對基因群進行功能富集分析,“GOplot”R包進行富集結果可視化,富集分析結果以adjP<0.05為標準過濾。

    1.3 藥物IC50值預測 依據TCGA-OV隊列相應的臨床信息,利用GDSC(癌癥藥物敏感性基因組學)數據庫預測了每個樣本的化療反應。預測過程由R包pRRophetic實現(xiàn),其中樣品的半數最大抑制濃度(IC50)通過嶺回歸估計,所有參數均按默認值設置,使用“combat”的批次效應和“all”的組織類型,并將重復基因表達總結為平均值。

    1.4 細胞實驗方法

    1.4.1 細胞培養(yǎng) 將SKOV3細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的McCoy's 5A培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),細胞密度達80%時,進行傳代培養(yǎng)。

    1.4.2PXN穩(wěn)定敲減卵巢癌細胞系的構建PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體(GV493-PXN-EGFP)由上海吉凱基因公司設計并合成,感染敲減慢病毒的組別為實驗組(shPXN),以不轉染病毒作為空白對照(Mock)、轉染空載病毒(Ctrl)作為對照。具體方法:除去多余培養(yǎng)基,分別加病毒、培養(yǎng)基及相應感染增強液,輕柔混勻,常規(guī)培養(yǎng)。12h后除去多余培養(yǎng)基,用PBS輕柔清洗2次,加常規(guī)培養(yǎng)基。采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染細胞株,若熒光顯微鏡下感染效率>80%,表明嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定感染細胞株,可收集細胞擴大培養(yǎng)并進行后續(xù)實驗。

    1.4.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR) 取各組SKOV3細胞樣本,按試劑盒說明書提取總RNA。逆轉錄的反應程序:55℃反應30min,85℃反應5min,4℃反應至結束;qPCR反應程序:95℃預變性10min,95℃變性15s,60℃反應1min,共30個循環(huán)。PXN基因引物序列,上游:5'-CAATGGCACAATCCTTGACC-3',下游:5'-GTGATGAGGACTGAGGCTG-3';GAPDH基因為內參照,其引物序列,上游:5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',下游:5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。采用2-ΔΔCt方法計算PXNmRNA表達水平,其中Ct表示循環(huán)閾值。

    1.4.4 蛋白免疫電泳(Western blot) 取各組SKOV3細胞樣本,加細胞裂解液,提取總蛋白,進行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)電泳,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)轉膜,5%脫脂奶粉封閉2h,加稀釋后的一抗(PXN按1∶1000稀釋,GAPDH按1∶5000稀釋),4℃搖床過夜。洗膜,加二抗,37℃搖床孵育60min。取強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑A、B液按體積1∶1混合,加至PVDF膜,用蛋白曝光儀對目的蛋白條帶進行曝光、掃描、照相。

    1.4.5 細胞劃痕實驗 將實驗組、陰性對照組和空白對照組細胞分別按2×105細胞/孔接種于6孔板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜,觀察細胞融合率達90%以上并在6孔板底部形成單層細胞。除去多余培養(yǎng)基,采用無菌槍頭垂直于板底進行劃痕,加無血清培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)0、24h,顯微鏡下觀察、測量劃痕的寬度,并拍照,采用Image J軟件分析劃痕面積,計算細胞遷移率以評估細胞的遷移能力,細胞遷移率(%)=(0h的劃痕面積-24h的劃痕面積)/0h的劃痕面積×100%。

    1.4.6 Transwell遷移侵襲實驗 在Transwell小室(24孔板)上室加稀釋后(稀釋倍數1∶5)的Matrigel基質膠70μL(遷移實驗則無需)。取對數生長期SKOV3細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,按1×105/孔細胞加入Transwell小室的上室,在下室中加含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基,隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。經甲醛固定、結晶紫染色,顯微鏡下觀察、拍照,Image J軟件計數穿膜細胞數,以此反映細胞的遷移侵襲能力。

    2 結 果

    2.1 影響卵巢癌遷移侵襲能力的預后相關基因

    2.1.1 篩選在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因 從GeneCard數據庫分別下載影響細胞遷移與侵襲能力的基因,以相關分數(Relevance score)>7為條件,篩選出與遷移侵襲相關性均較高的基因55個。聯(lián)合TCGA和GTEx數據庫,基于R語言“l(fā)imma”算法對篩選出的55個基因進行差異表達分析,火山圖用于可視化。以logFC(差異倍數)>1和adj.P(統(tǒng)計學方法校正后的P)<0.001為篩選條件,發(fā)現(xiàn)36個遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織高表達,1個遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織低表達(圖1)。

    圖1 篩選在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因A:Genecards數據庫中遷移與侵襲相關基因的集合情況;B:火山圖展示遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織與正常卵巢癌組織中的表達差異

    2.1.2 各隊列生存預后相關基因情況 基于TCGA-OV隊列(訓練集)和GEO數據庫中的GSE26712數據集(驗證集),依據基因表達的中位數將樣本分為高低表達組,利用R語言和Kaplan-Meier生存曲線對36個高表達基因進行生存分析后取交集,發(fā)現(xiàn)1個遷移侵襲相關基因具有生存預后意義(P<0.05),該基因為PXN。見圖2。

    圖2 各隊列生存預后相關基因情況

    利用Kaplan-Meier生存曲線對36個高表達基因進行生存分析后取交集,GSE26712隊列中有1個基因具有預后意義,TCGA-OV隊中有4個基因具有預后意義,在兩個隊列中均有預后意義的基因有1個

    2.1.3PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響 進一步對交集中的PXN基因進行生存曲線可視化,發(fā)現(xiàn)其與卵巢癌患者不良預后相關,隨著基因表達量增加,患者的總生存期明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

    圖3 PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響A:利用TCGA數據庫探討PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響;B:利用GSE26712數據集探討PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響

    2.1.4PXN基因GO功能富集分析結果 通過GO/KEGG功能富集分析探索PXN參與的生物過程(biological process,BP)。結果表明PXN的功能與組蛋白修飾、染色質共價修飾、賴氨酸肽基修飾、蛋白質去泛素化、通過去除小蛋白進行蛋白質修飾、組蛋白去泛素化及組蛋白H3-K4三甲基化等相關(P<0.05),見圖4。

    圖4 PXN基因GO功能富集分析結果

    2.2 敲減PXN基因對卵巢癌細胞遷移侵襲能力的影響

    2.2.1 成功敲減PXN基因 利用敲減慢病毒載體感染卵巢癌細胞SKOV3后,Western blot檢測結果示,PXN敲減組(shPXN)的paxillin蛋白表達水平明顯低于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)(P<0.0001);RT-qPCR檢測結果示,PXN敲減組(shPXN)的PXNmRNA表達水平明顯低于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)(P<0.01)。表明慢病毒已成功感染卵巢癌細胞,并干擾PXN基因的轉錄及翻譯。見圖5。

    圖5 驗證PXN基因敲減效果A、B:Western blot檢測各組細胞paxillin蛋白表達;C:RT-qPCR檢測各組細胞PXN mRNA表達;Mock:空白對照組,Ctrl:陰性對照組,shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,****P<0.0001

    2.2.2 敲減PXN基因抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移侵襲能力 劃痕實驗進行到24h時,PXN敲減組(shPXN)的劃痕愈合面積明顯少于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖6A)。表明敲減PXN基因抑制卵巢癌細胞SKOV3細胞愈合能力、遷移能力。

    圖6 各組SKOV3細胞遷移侵襲能力A:細胞劃痕實驗檢測;B:PXN敲減后SKOV3細胞遷移數改變;C:PXN敲減后SKOV3細胞侵襲數改變;Mock:空白對照組;Ctrl:陰性對照組;shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

    Transwell實驗檢測結果顯示,與空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)比較,PXN敲減組(shPXN)穿膜細胞數明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖6B、C)。表明敲減PXN基因可抑制卵巢癌細胞SKOV3體外遷移侵襲能力。

    2.3PXN基因對卵巢癌化療耐藥的潛在影響PXN高表達組中順鉑及紫杉醇的IC50值明顯高于PXN低表達組(P<0.001),而吉西他濱及多柔比星的IC50值明顯低于PXN低表達組(P<0.0001)。腫瘤細胞(PXN高表達組及PXN低表達組)中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細胞(P<0.0001),吉西他濱及多柔比星的IC50值高于正常卵巢細胞(P<0.0001)。見圖7。

    圖7 PXN基因表達水平對藥物IC50的影響A:不同組別順鉑的IC50;B:不同組別紫杉醇的IC50;C:不同組別吉西他濱的IC50;D:不同組別多柔比星的IC50;1:PXN高表達;2:PXN低表達;3:正常卵巢組織***P<0.001,****P<0.0001

    3 討 論

    大多數卵巢癌患者確診時已為晚期,且70%的晚期上皮性卵巢癌患者會出現(xiàn)癌癥復發(fā)、生存率極低,因此腫瘤轉移的分子機制越來越引起研究者的重視[10]。本研究發(fā)現(xiàn),36個遷移侵襲相關基因(Relevance score>7)在卵巢癌中高表達(logFC>1和adj.P<0.001),它們可能是潛在的致癌基因,通過編碼相關蛋白促進卵巢癌的轉移。為進一步將基礎研究與臨床特征相關聯(lián),探索遷移侵襲相關基因的高表達與卵巢癌患者總生存時間是否存在聯(lián)系,對卵巢癌中高表達的36個遷移侵襲相關基因進行了多隊列生存分析,結果發(fā)現(xiàn)在不同隊列中PXN基因高表達都與患者不良預后相關(P<0.05)。GO/KEGG功能富集分析結果提示,PXN基因與染色質的修飾調控相關,PXN基因可能通過干預轉錄參與細胞的惡性化過程。

    PXN基因編碼的paxillin蛋白分子量大小為68kDa,是整合素調節(jié)信號傳導的重要組成部分,能將肌動蛋白連接到富含整合素的細胞黏附位點,在細胞-基質和細胞-細胞黏附之間起重要作用[11]。多項研究已表明,PXN基因能調節(jié)腫瘤細胞的生物學功能,如PXN基因能通過維持細胞間黏附連接完整性來促進乳腺腫瘤細胞侵襲;通過增加Src表達促進NF-κB的活化,促進卵巢癌血管生成;降低PXN基因表達,抑制ERK信號通路抑制直腸癌的轉移和上皮-間充質轉化[12-14]。PXN作為遷移侵襲相關基因在卵巢癌中的作用機制尚不清楚,既往研究提示PXN基因可能作為致癌因子促進卵巢癌的轉移。

    本研究結果顯示,PXN敲減抑制卵巢癌SKOV3細胞的愈合及體外遷移侵襲能力。PXN基因的生物學功能在其他腫瘤中也得到相應的驗證,敲減PXN基因抑制胃癌細胞、頭頸部鱗狀細胞癌細胞及非小細胞肺癌細胞的遷移侵襲[15-17];通過調控細胞凋亡抑制宮頸癌細胞增殖與黏附[18];抑制裸鼠體內結直腸癌的生長[19]。提示PXN基因能促進卵巢癌細胞侵襲轉移。這與本研究生物信息分析結果相吻合。PXN基因是卵巢癌治療的潛在靶點,可能通過調控細胞黏附影響細胞的遷移侵襲能力,其促癌能力或許是卵巢癌患者不良預后的因素之一。

    本研究結果顯示,PXN高表達降低卵巢癌細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性,而吉西他濱和多柔比星或許是更具潛力的備選藥物。但總體來說,紫杉醇仍是最優(yōu)選擇,因腫瘤細胞中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細胞,或許能最大程度地降低化療藥物對卵巢癌患者的傷害。

    綜上所述,PXN作為遷移侵襲相關基因在卵巢癌中呈相對高表達,且與患者不良預后及對化療藥物的敏感性相關,敲減PXN能抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移侵襲,可能是潛在的轉移預測標志物。PXN基因調控卵巢癌遷移侵襲的機制及臨床轉化應用尚待進一步研究,本課題組將在后續(xù)的研究中為晚期卵巢癌的靶向治療尋找更多的理論依據和實驗基礎。

    猜你喜歡
    劃痕隊列卵巢癌
    富馬酸盧帕他定治療皮膚劃痕癥的療效觀察
    隊列里的小秘密
    卵巢癌:被遺忘的女性“沉默殺手”
    基于多隊列切換的SDN擁塞控制*
    軟件(2020年3期)2020-04-20 00:58:44
    在隊列里
    冰上芭蕾等
    豐田加速駛入自動駕駛隊列
    Wnt3 a和TCF4在人卵巢癌中的表達及臨床意義
    犀利的眼神
    microRNA與卵巢癌轉移的研究進展
    99热6这里只有精品| 观看av在线不卡| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日本色播在线视频| 久久久久久久精品精品| 国产69精品久久久久777片| 午夜视频国产福利| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩三级伦理在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日本色播在线视频| 日日爽夜夜爽网站| 三上悠亚av全集在线观看 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产成人aa在线观看| 一级爰片在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 99热国产这里只有精品6| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 少妇人妻精品综合一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品人妻偷拍中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 老司机影院成人| 久久久a久久爽久久v久久| .国产精品久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久午夜福利片| 晚上一个人看的免费电影| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日日啪夜夜撸| 亚洲内射少妇av| 91精品伊人久久大香线蕉| 一级av片app| 亚洲无线观看免费| 男女边摸边吃奶| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 97在线人人人人妻| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 69精品国产乱码久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 秋霞在线观看毛片| 日韩电影二区| 日本免费在线观看一区| 七月丁香在线播放| 99九九在线精品视频 | 久久久国产一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 少妇精品久久久久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 少妇人妻久久综合中文| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲av不卡在线观看| 内射极品少妇av片p| av播播在线观看一区| 青春草亚洲视频在线观看| a级毛色黄片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| freevideosex欧美| 国产亚洲最大av| 亚洲精品第二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩一本色道免费dvd| 少妇的逼好多水| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日本欧美视频一区| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品色激情综合| 国产精品久久久久成人av| 久久久a久久爽久久v久久| 久久人妻熟女aⅴ| 各种免费的搞黄视频| 最新中文字幕久久久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 免费少妇av软件| 国产免费福利视频在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 在现免费观看毛片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线天堂最新版资源| 一级毛片 在线播放| 一本久久精品| 午夜影院在线不卡| 六月丁香七月| 另类精品久久| 男女无遮挡免费网站观看| 人体艺术视频欧美日本| 观看av在线不卡| 9色porny在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产色婷婷99| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 少妇丰满av| 天美传媒精品一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久影院123| 久久99热6这里只有精品| 国产精品99久久久久久久久| 欧美日韩在线观看h| 日日爽夜夜爽网站| av黄色大香蕉| 欧美三级亚洲精品| 久久久国产一区二区| 少妇 在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲熟女精品中文字幕| 综合色丁香网| 久久精品国产亚洲av天美| 色网站视频免费| 午夜激情久久久久久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品一二三| 成人黄色视频免费在线看| 男男h啪啪无遮挡| 新久久久久国产一级毛片| 三级国产精品欧美在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 超碰97精品在线观看| 国产在线免费精品| 日本vs欧美在线观看视频 | 久久99精品国语久久久| 久久久久久久精品精品| 乱人伦中国视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日韩av免费高清视频| 一级黄片播放器| 国产探花极品一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品久久久久成人av| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本与韩国留学比较| 日日爽夜夜爽网站| 久久久a久久爽久久v久久| 久久久亚洲精品成人影院| 国产高清国产精品国产三级| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 少妇 在线观看| 黄色配什么色好看| 美女国产视频在线观看| 老司机影院成人| 午夜福利,免费看| 一区二区av电影网| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲四区av| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产真实伦视频高清在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 黄色欧美视频在线观看| av播播在线观看一区| av国产久精品久网站免费入址| 国产免费又黄又爽又色| 一区二区三区精品91| 大片免费播放器 马上看| 国产免费又黄又爽又色| 寂寞人妻少妇视频99o| 观看av在线不卡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 女人精品久久久久毛片| 欧美另类一区| 热re99久久国产66热| 精品国产国语对白av| 久久久久网色| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 97超碰精品成人国产| 欧美三级亚洲精品| 观看av在线不卡| 搡老乐熟女国产| 日本欧美国产在线视频| 乱人伦中国视频| 少妇高潮的动态图| 草草在线视频免费看| 在线 av 中文字幕| 免费看光身美女| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 午夜激情福利司机影院| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 黑人高潮一二区| 色视频www国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品久久久久久久久免| 九九在线视频观看精品| 伦理电影免费视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美精品一区二区大全| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 91成人精品电影| 亚洲av中文av极速乱| 精品少妇内射三级| 另类亚洲欧美激情| 日本vs欧美在线观看视频 | 少妇丰满av| 曰老女人黄片| 少妇高潮的动态图| 一级a做视频免费观看| 亚洲av不卡在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av国产精品久久久久影院| 免费少妇av软件| 精华霜和精华液先用哪个| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 日韩大片免费观看网站| 国产视频内射| 午夜激情福利司机影院| 免费av不卡在线播放| 黑人猛操日本美女一级片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品一区二区性色av| 亚洲,一卡二卡三卡| 中文字幕久久专区| 欧美bdsm另类| 国产精品一区www在线观看| www.av在线官网国产| 一边亲一边摸免费视频| 成年av动漫网址| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜老司机福利剧场| 尾随美女入室| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲成人一二三区av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 波野结衣二区三区在线| av一本久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久午夜欧美精品| 精品少妇内射三级| 国产在线男女| 99热网站在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费观看av网站的网址| av在线播放精品| 久久这里有精品视频免费| 一区二区av电影网| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久6这里有精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 美女cb高潮喷水在线观看| 免费看光身美女| 欧美少妇被猛烈插入视频| 又爽又黄a免费视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久国内精品自在自线图片| 伊人久久精品亚洲午夜| 免费av中文字幕在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| 大陆偷拍与自拍| 亚洲国产欧美在线一区| 免费看av在线观看网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 性色avwww在线观看| 免费看光身美女| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费黄频网站在线观看国产| 最黄视频免费看| 免费黄色在线免费观看| 在线天堂最新版资源| 嫩草影院新地址| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人国产av品久久久| 97在线人人人人妻| 深夜a级毛片| 免费黄色在线免费观看| 日本黄大片高清| 热re99久久国产66热| 欧美激情国产日韩精品一区| 丰满乱子伦码专区| 少妇精品久久久久久久| 精品国产一区二区久久| 国产69精品久久久久777片| 在线观看av片永久免费下载| 日韩免费高清中文字幕av| 久久鲁丝午夜福利片| 黑人猛操日本美女一级片| 99热这里只有是精品50| 极品人妻少妇av视频| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲四区av| 亚洲成人av在线免费| 久久6这里有精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | tube8黄色片| 亚洲欧洲国产日韩| 香蕉精品网在线| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品日本国产第一区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产av国产精品国产| 亚洲精品一二三| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品国产一区二区久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久99蜜桃精品久久| 精品人妻熟女av久视频| 精品熟女少妇av免费看| 日本爱情动作片www.在线观看| av在线app专区| 男女免费视频国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 五月天丁香电影| 国产又色又爽无遮挡免| 99热国产这里只有精品6| 大香蕉97超碰在线| 蜜桃在线观看..| 久久久久精品久久久久真实原创| 一区二区三区乱码不卡18| 国产av一区二区精品久久| 久久国产乱子免费精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产毛片在线视频| 亚洲综合色惰| 国产91av在线免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 成人影院久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 老熟女久久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 男人舔奶头视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线看a的网站| 日韩免费高清中文字幕av| 色网站视频免费| 久久午夜福利片| 波野结衣二区三区在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 黄色配什么色好看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人一区二区在线| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲精品国产成人久久av| 精品一品国产午夜福利视频| 精品久久久久久久久av| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美精品国产亚洲| 日日啪夜夜爽| 亚洲欧美精品专区久久| 99热这里只有是精品在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久精品夜色国产| 国产黄色免费在线视频| 免费黄色在线免费观看| 日日啪夜夜撸| 国产中年淑女户外野战色| 美女大奶头黄色视频| 久久久久精品性色| 中文天堂在线官网| 国产成人aa在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产永久视频网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 22中文网久久字幕| 水蜜桃什么品种好| 这个男人来自地球电影免费观看 | 最近最新中文字幕免费大全7| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 少妇人妻久久综合中文| 精品亚洲成国产av| 色吧在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲av福利一区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 日韩三级伦理在线观看| 日本欧美视频一区| 国产男女内射视频| 精品一品国产午夜福利视频| 丰满乱子伦码专区| 国产伦理片在线播放av一区| 观看美女的网站| 久久久久国产网址| 亚洲成人手机| 久久国产精品大桥未久av | 最新的欧美精品一区二区| 99热全是精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 色5月婷婷丁香| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲在久久综合| 久久青草综合色| 大香蕉久久网| 99久久综合免费| 国产黄片美女视频| 亚洲综合精品二区| 成人毛片60女人毛片免费| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品视频女| 性色av一级| 婷婷色综合大香蕉| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 欧美国产精品一级二级三级 | 中文字幕高清在线视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 精品高清国产在线一区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美性长视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 激情视频va一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲伊人色综图| 大码成人一级视频| 久热这里只有精品99| 久久热在线av| www.av在线官网国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 久久国产精品影院| 国产欧美日韩一区二区精品| 乱人伦中国视频| 精品欧美一区二区三区在线| 另类亚洲欧美激情| 久久99热这里只频精品6学生| av有码第一页| 高清欧美精品videossex| 国产福利在线免费观看视频| 日韩一区二区三区影片| 69精品国产乱码久久久| 国产野战对白在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产又色又爽无遮挡免| 窝窝影院91人妻| 国产有黄有色有爽视频| 九色亚洲精品在线播放| 男人操女人黄网站| 新久久久久国产一级毛片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美激情 高清一区二区三区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成在线人永久免费视频| a 毛片基地| 两性夫妻黄色片| 老熟女久久久| 亚洲国产欧美在线一区| 宅男免费午夜| 精品少妇内射三级| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲人成电影观看| 自线自在国产av| 91麻豆av在线| 免费在线观看完整版高清| 精品高清国产在线一区| 大型av网站在线播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人国产av品久久久| 天天添夜夜摸| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲少妇的诱惑av| 高清在线国产一区| 岛国毛片在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产黄频视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲久久久国产精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品 国内视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久久久精品精品| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产日韩欧美在线精品| 91麻豆av在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲专区字幕在线| 国产黄色免费在线视频| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品免费大片| 国产精品九九99| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 丝袜脚勾引网站| 又大又爽又粗| 亚洲少妇的诱惑av| 制服人妻中文乱码| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲欧美激情在线| 国产区一区二久久| 午夜福利,免费看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久精品成人免费网站| 亚洲 国产 在线| 欧美中文综合在线视频| 国产在线免费精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 视频区图区小说| av欧美777| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 中文字幕色久视频| www.999成人在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 黄片大片在线免费观看| 精品人妻1区二区| 久久ye,这里只有精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲天堂av无毛| 搡老岳熟女国产| 淫妇啪啪啪对白视频 | 色播在线永久视频| 久久久久久久久久久久大奶| 自线自在国产av| 欧美另类一区| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲色图综合在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 黄色 视频免费看| 成人三级做爰电影| 国产三级黄色录像| 欧美日韩精品网址| 一进一出抽搐动态| 热99久久久久精品小说推荐| 午夜日韩欧美国产| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久中文字幕一级| 999精品在线视频| av网站在线播放免费| 日韩三级视频一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 日本一区二区免费在线视频| 另类亚洲欧美激情| 丰满少妇做爰视频| 青草久久国产| 男人添女人高潮全过程视频| 真人做人爱边吃奶动态| 又大又爽又粗| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品少妇久久久久久888优播| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产亚洲一区二区精品| 老司机午夜福利在线观看视频 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 人妻 亚洲 视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品自拍成人| 十八禁高潮呻吟视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 最近最新中文字幕大全免费视频| 午夜精品国产一区二区电影| 一级片'在线观看视频| 国产三级黄色录像| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲免费av在线视频| 十八禁网站免费在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99香蕉大伊视频| av视频免费观看在线观看| 9191精品国产免费久久| 香蕉国产在线看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99久久综合免费| 久久性视频一级片| 久久狼人影院| 热re99久久国产66热| 91国产中文字幕| 国产淫语在线视频| 99九九在线精品视频| 国产一区二区三区av在线| h视频一区二区三区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品一品国产午夜福利视频| 午夜91福利影院| 男人操女人黄网站| 两个人免费观看高清视频| 日韩免费高清中文字幕av| 最黄视频免费看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 桃红色精品国产亚洲av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲第一av免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品成人在线| 国产主播在线观看一区二区| 一本久久精品|