• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    卵巢上皮性癌轉移的關鍵基因篩選與功能分析*

    2023-11-08 01:12:16吳巧鈴陳雨微
    現(xiàn)代婦產科進展 2023年10期
    關鍵詞:劃痕隊列卵巢癌

    吳巧鈴,姜 山,2**,陳雨微,孫 陽***

    (1.福建省腫瘤醫(yī)院婦科 福建醫(yī)科大學腫瘤臨床醫(yī)學院,福州 350014;2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,福州 350122)

    卵巢癌死亡率居于婦科惡性腫瘤首位,由于臨床表現(xiàn)隱匿、早期癥狀不典型且缺乏有效的篩查手段,大多數患者確診時已為晚期[1-2]。卵巢癌亞型復雜,具有不同的分子生物學特征,即使采用外科手術輔以全身化療這一首選治療方案,幾乎所有患者都會復發(fā)[3-4]。進一步深入研究卵巢癌轉移機制,并在此基礎上尋找新的治療靶點具有重要意義。PXN作為一種蛋白質編碼基因,編碼細胞骨架蛋白——樁蛋白(paxillin),該蛋白聯(lián)合VCL(vinculin)和ZYX(zyxin)蛋白通過LC3參與細胞和黏著斑(FAs)位點的黏附過程,影響癌細胞的遷移和侵襲[5-7]。本研究挖掘卵巢癌中高表達的遷移侵襲相關基因PXN并驗證其生物學功能,以期為晚期卵巢癌轉移機制提供新的理論依據和治療新靶點。

    1 材料與方法

    1.1 細胞系與試劑 卵巢癌細胞系SKOV3細胞由福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院贈送。McCoy's 5A培養(yǎng)基購自上海源培生物科技公司;新生胎牛血清購自德國PAN公司;兔抗人PXN單克隆抗體購自英國Abcam公司;兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國CST公司;HRP標記的羊抗兔第二抗體購自北京中杉金橋公司;ECL化學發(fā)光試劑購自大連美侖生物公司;RNA提取試劑盒購自美國Promega公司;逆轉錄試劑盒購自Roche公司;Transwell透明小室及Matrigel基質膠購自美國Corning公司;PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體購自上海吉凱基因公司。

    1.2 篩選、分析卵巢上皮性癌(卵巢癌)轉移的關鍵基因

    1.2.1 卵巢癌公共測序數據獲取及處理 通過UCSC Xena(University Of Cingifornia Sisha Cruz,加州大學圣克魯茲分校)門戶下載來自于TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌癥基因組圖譜)數據庫的卵巢癌組織測序數據作為訓練集,以及來自GTEx(Genotype-Tissue Expression Project,基因型-組織表達數據庫)的正常卵巢組織測序數據,并通過TCGA數據庫補充訓練集缺失的臨床信息[8]。通過GEO(Gene Expression Omnibus,基因表達綜合)數據庫下載卵巢癌基因芯片數據及臨床信息GSE26712作為驗證集[9]。所有數據利用軟件R進行基因注釋,并處理為log2(TPM+1)進行后續(xù)分析,刪除缺失值,相同基因取平均值去重。

    1.2.2 遷移侵襲能力相關基因的獲取 在GeneCards(人類基因數據庫,https://www.genecards.org/)綜合數據庫中分別輸入搜索詞“migration”和“invasion”,從該數據庫下載遷移侵襲相關基因,以相關分數“Relevance score”>7為條件,篩選出與細胞遷移侵襲能力相關性較高的基因。

    1.2.3 差異表達分析 利用R 4.2.2及l(fā)imma算法聯(lián)合TCGA與GTEx數據庫進行差異表達分析,對比遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達水平。以差異表達倍數logFC>1和adj.P<0.001為篩選條件,尋找在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因。應用“ggplot2”R包繪制火山圖對差異表達分析結果進行可視化。

    1.2.4 生存分析 根據遷移侵襲相關基因表達中位值將全部卵巢癌樣本分為高低表達兩組,應用“survival”R包計算高低表達兩組之間生存差異。通過交集獲取在訓練集TCGA隊列及驗證集GSE26712隊列都具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的遷移侵襲相關基因,應用“survminer”R包進行生存曲線可視化。

    1.2.5 GO/KEGG功能富集分析 基于TCGA卵巢癌數據集以“cortest”函數進行相關性分析,以|R|>0.7及P<0.05為篩選標準,獲得與遷移侵襲基因顯著相關的基因群,應用“clusterProfiler”R包對基因群進行功能富集分析,“GOplot”R包進行富集結果可視化,富集分析結果以adjP<0.05為標準過濾。

    1.3 藥物IC50值預測 依據TCGA-OV隊列相應的臨床信息,利用GDSC(癌癥藥物敏感性基因組學)數據庫預測了每個樣本的化療反應。預測過程由R包pRRophetic實現(xiàn),其中樣品的半數最大抑制濃度(IC50)通過嶺回歸估計,所有參數均按默認值設置,使用“combat”的批次效應和“all”的組織類型,并將重復基因表達總結為平均值。

    1.4 細胞實驗方法

    1.4.1 細胞培養(yǎng) 將SKOV3細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的McCoy's 5A培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),細胞密度達80%時,進行傳代培養(yǎng)。

    1.4.2PXN穩(wěn)定敲減卵巢癌細胞系的構建PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體(GV493-PXN-EGFP)由上海吉凱基因公司設計并合成,感染敲減慢病毒的組別為實驗組(shPXN),以不轉染病毒作為空白對照(Mock)、轉染空載病毒(Ctrl)作為對照。具體方法:除去多余培養(yǎng)基,分別加病毒、培養(yǎng)基及相應感染增強液,輕柔混勻,常規(guī)培養(yǎng)。12h后除去多余培養(yǎng)基,用PBS輕柔清洗2次,加常規(guī)培養(yǎng)基。采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染細胞株,若熒光顯微鏡下感染效率>80%,表明嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定感染細胞株,可收集細胞擴大培養(yǎng)并進行后續(xù)實驗。

    1.4.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR) 取各組SKOV3細胞樣本,按試劑盒說明書提取總RNA。逆轉錄的反應程序:55℃反應30min,85℃反應5min,4℃反應至結束;qPCR反應程序:95℃預變性10min,95℃變性15s,60℃反應1min,共30個循環(huán)。PXN基因引物序列,上游:5'-CAATGGCACAATCCTTGACC-3',下游:5'-GTGATGAGGACTGAGGCTG-3';GAPDH基因為內參照,其引物序列,上游:5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',下游:5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。采用2-ΔΔCt方法計算PXNmRNA表達水平,其中Ct表示循環(huán)閾值。

    1.4.4 蛋白免疫電泳(Western blot) 取各組SKOV3細胞樣本,加細胞裂解液,提取總蛋白,進行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)電泳,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)轉膜,5%脫脂奶粉封閉2h,加稀釋后的一抗(PXN按1∶1000稀釋,GAPDH按1∶5000稀釋),4℃搖床過夜。洗膜,加二抗,37℃搖床孵育60min。取強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑A、B液按體積1∶1混合,加至PVDF膜,用蛋白曝光儀對目的蛋白條帶進行曝光、掃描、照相。

    1.4.5 細胞劃痕實驗 將實驗組、陰性對照組和空白對照組細胞分別按2×105細胞/孔接種于6孔板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜,觀察細胞融合率達90%以上并在6孔板底部形成單層細胞。除去多余培養(yǎng)基,采用無菌槍頭垂直于板底進行劃痕,加無血清培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)0、24h,顯微鏡下觀察、測量劃痕的寬度,并拍照,采用Image J軟件分析劃痕面積,計算細胞遷移率以評估細胞的遷移能力,細胞遷移率(%)=(0h的劃痕面積-24h的劃痕面積)/0h的劃痕面積×100%。

    1.4.6 Transwell遷移侵襲實驗 在Transwell小室(24孔板)上室加稀釋后(稀釋倍數1∶5)的Matrigel基質膠70μL(遷移實驗則無需)。取對數生長期SKOV3細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,按1×105/孔細胞加入Transwell小室的上室,在下室中加含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基,隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。經甲醛固定、結晶紫染色,顯微鏡下觀察、拍照,Image J軟件計數穿膜細胞數,以此反映細胞的遷移侵襲能力。

    2 結 果

    2.1 影響卵巢癌遷移侵襲能力的預后相關基因

    2.1.1 篩選在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因 從GeneCard數據庫分別下載影響細胞遷移與侵襲能力的基因,以相關分數(Relevance score)>7為條件,篩選出與遷移侵襲相關性均較高的基因55個。聯(lián)合TCGA和GTEx數據庫,基于R語言“l(fā)imma”算法對篩選出的55個基因進行差異表達分析,火山圖用于可視化。以logFC(差異倍數)>1和adj.P(統(tǒng)計學方法校正后的P)<0.001為篩選條件,發(fā)現(xiàn)36個遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織高表達,1個遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織低表達(圖1)。

    圖1 篩選在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因A:Genecards數據庫中遷移與侵襲相關基因的集合情況;B:火山圖展示遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織與正常卵巢癌組織中的表達差異

    2.1.2 各隊列生存預后相關基因情況 基于TCGA-OV隊列(訓練集)和GEO數據庫中的GSE26712數據集(驗證集),依據基因表達的中位數將樣本分為高低表達組,利用R語言和Kaplan-Meier生存曲線對36個高表達基因進行生存分析后取交集,發(fā)現(xiàn)1個遷移侵襲相關基因具有生存預后意義(P<0.05),該基因為PXN。見圖2。

    圖2 各隊列生存預后相關基因情況

    利用Kaplan-Meier生存曲線對36個高表達基因進行生存分析后取交集,GSE26712隊列中有1個基因具有預后意義,TCGA-OV隊中有4個基因具有預后意義,在兩個隊列中均有預后意義的基因有1個

    2.1.3PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響 進一步對交集中的PXN基因進行生存曲線可視化,發(fā)現(xiàn)其與卵巢癌患者不良預后相關,隨著基因表達量增加,患者的總生存期明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

    圖3 PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響A:利用TCGA數據庫探討PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響;B:利用GSE26712數據集探討PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響

    2.1.4PXN基因GO功能富集分析結果 通過GO/KEGG功能富集分析探索PXN參與的生物過程(biological process,BP)。結果表明PXN的功能與組蛋白修飾、染色質共價修飾、賴氨酸肽基修飾、蛋白質去泛素化、通過去除小蛋白進行蛋白質修飾、組蛋白去泛素化及組蛋白H3-K4三甲基化等相關(P<0.05),見圖4。

    圖4 PXN基因GO功能富集分析結果

    2.2 敲減PXN基因對卵巢癌細胞遷移侵襲能力的影響

    2.2.1 成功敲減PXN基因 利用敲減慢病毒載體感染卵巢癌細胞SKOV3后,Western blot檢測結果示,PXN敲減組(shPXN)的paxillin蛋白表達水平明顯低于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)(P<0.0001);RT-qPCR檢測結果示,PXN敲減組(shPXN)的PXNmRNA表達水平明顯低于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)(P<0.01)。表明慢病毒已成功感染卵巢癌細胞,并干擾PXN基因的轉錄及翻譯。見圖5。

    圖5 驗證PXN基因敲減效果A、B:Western blot檢測各組細胞paxillin蛋白表達;C:RT-qPCR檢測各組細胞PXN mRNA表達;Mock:空白對照組,Ctrl:陰性對照組,shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,****P<0.0001

    2.2.2 敲減PXN基因抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移侵襲能力 劃痕實驗進行到24h時,PXN敲減組(shPXN)的劃痕愈合面積明顯少于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖6A)。表明敲減PXN基因抑制卵巢癌細胞SKOV3細胞愈合能力、遷移能力。

    圖6 各組SKOV3細胞遷移侵襲能力A:細胞劃痕實驗檢測;B:PXN敲減后SKOV3細胞遷移數改變;C:PXN敲減后SKOV3細胞侵襲數改變;Mock:空白對照組;Ctrl:陰性對照組;shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

    Transwell實驗檢測結果顯示,與空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)比較,PXN敲減組(shPXN)穿膜細胞數明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖6B、C)。表明敲減PXN基因可抑制卵巢癌細胞SKOV3體外遷移侵襲能力。

    2.3PXN基因對卵巢癌化療耐藥的潛在影響PXN高表達組中順鉑及紫杉醇的IC50值明顯高于PXN低表達組(P<0.001),而吉西他濱及多柔比星的IC50值明顯低于PXN低表達組(P<0.0001)。腫瘤細胞(PXN高表達組及PXN低表達組)中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細胞(P<0.0001),吉西他濱及多柔比星的IC50值高于正常卵巢細胞(P<0.0001)。見圖7。

    圖7 PXN基因表達水平對藥物IC50的影響A:不同組別順鉑的IC50;B:不同組別紫杉醇的IC50;C:不同組別吉西他濱的IC50;D:不同組別多柔比星的IC50;1:PXN高表達;2:PXN低表達;3:正常卵巢組織***P<0.001,****P<0.0001

    3 討 論

    大多數卵巢癌患者確診時已為晚期,且70%的晚期上皮性卵巢癌患者會出現(xiàn)癌癥復發(fā)、生存率極低,因此腫瘤轉移的分子機制越來越引起研究者的重視[10]。本研究發(fā)現(xiàn),36個遷移侵襲相關基因(Relevance score>7)在卵巢癌中高表達(logFC>1和adj.P<0.001),它們可能是潛在的致癌基因,通過編碼相關蛋白促進卵巢癌的轉移。為進一步將基礎研究與臨床特征相關聯(lián),探索遷移侵襲相關基因的高表達與卵巢癌患者總生存時間是否存在聯(lián)系,對卵巢癌中高表達的36個遷移侵襲相關基因進行了多隊列生存分析,結果發(fā)現(xiàn)在不同隊列中PXN基因高表達都與患者不良預后相關(P<0.05)。GO/KEGG功能富集分析結果提示,PXN基因與染色質的修飾調控相關,PXN基因可能通過干預轉錄參與細胞的惡性化過程。

    PXN基因編碼的paxillin蛋白分子量大小為68kDa,是整合素調節(jié)信號傳導的重要組成部分,能將肌動蛋白連接到富含整合素的細胞黏附位點,在細胞-基質和細胞-細胞黏附之間起重要作用[11]。多項研究已表明,PXN基因能調節(jié)腫瘤細胞的生物學功能,如PXN基因能通過維持細胞間黏附連接完整性來促進乳腺腫瘤細胞侵襲;通過增加Src表達促進NF-κB的活化,促進卵巢癌血管生成;降低PXN基因表達,抑制ERK信號通路抑制直腸癌的轉移和上皮-間充質轉化[12-14]。PXN作為遷移侵襲相關基因在卵巢癌中的作用機制尚不清楚,既往研究提示PXN基因可能作為致癌因子促進卵巢癌的轉移。

    本研究結果顯示,PXN敲減抑制卵巢癌SKOV3細胞的愈合及體外遷移侵襲能力。PXN基因的生物學功能在其他腫瘤中也得到相應的驗證,敲減PXN基因抑制胃癌細胞、頭頸部鱗狀細胞癌細胞及非小細胞肺癌細胞的遷移侵襲[15-17];通過調控細胞凋亡抑制宮頸癌細胞增殖與黏附[18];抑制裸鼠體內結直腸癌的生長[19]。提示PXN基因能促進卵巢癌細胞侵襲轉移。這與本研究生物信息分析結果相吻合。PXN基因是卵巢癌治療的潛在靶點,可能通過調控細胞黏附影響細胞的遷移侵襲能力,其促癌能力或許是卵巢癌患者不良預后的因素之一。

    本研究結果顯示,PXN高表達降低卵巢癌細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性,而吉西他濱和多柔比星或許是更具潛力的備選藥物。但總體來說,紫杉醇仍是最優(yōu)選擇,因腫瘤細胞中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細胞,或許能最大程度地降低化療藥物對卵巢癌患者的傷害。

    綜上所述,PXN作為遷移侵襲相關基因在卵巢癌中呈相對高表達,且與患者不良預后及對化療藥物的敏感性相關,敲減PXN能抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移侵襲,可能是潛在的轉移預測標志物。PXN基因調控卵巢癌遷移侵襲的機制及臨床轉化應用尚待進一步研究,本課題組將在后續(xù)的研究中為晚期卵巢癌的靶向治療尋找更多的理論依據和實驗基礎。

    猜你喜歡
    劃痕隊列卵巢癌
    富馬酸盧帕他定治療皮膚劃痕癥的療效觀察
    隊列里的小秘密
    卵巢癌:被遺忘的女性“沉默殺手”
    基于多隊列切換的SDN擁塞控制*
    軟件(2020年3期)2020-04-20 00:58:44
    在隊列里
    冰上芭蕾等
    豐田加速駛入自動駕駛隊列
    Wnt3 a和TCF4在人卵巢癌中的表達及臨床意義
    犀利的眼神
    microRNA與卵巢癌轉移的研究進展
    av国产免费在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av在线亚洲专区| 国产午夜福利久久久久久| 久久久久精品久久久久真实原创| av在线播放精品| 久久久久性生活片| 波多野结衣巨乳人妻| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黑人高潮一二区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美3d第一页| 天天一区二区日本电影三级| 深夜a级毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 下体分泌物呈黄色| 赤兔流量卡办理| av在线蜜桃| 精品久久久久久电影网| 一级毛片我不卡| 成年av动漫网址| 九草在线视频观看| 国产成人91sexporn| 久久精品久久精品一区二区三区| 干丝袜人妻中文字幕| 免费看不卡的av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品午夜福利在线看| 免费观看性生交大片5| 听说在线观看完整版免费高清| 九草在线视频观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产爱豆传媒在线观看| 国产视频首页在线观看| 免费看av在线观看网站| 黄色一级大片看看| 久久99热这里只有精品18| 久久6这里有精品| 美女视频免费永久观看网站| 大香蕉久久网| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲,一卡二卡三卡| 热re99久久精品国产66热6| av在线亚洲专区| 一区二区三区精品91| 久久ye,这里只有精品| 国产成人aa在线观看| 日韩电影二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久久久久久午夜电影| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美高清成人免费视频www| 国产永久视频网站| 免费大片18禁| 内地一区二区视频在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 免费观看在线日韩| 2018国产大陆天天弄谢| 水蜜桃什么品种好| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品自拍成人| 观看美女的网站| 女人被狂操c到高潮| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久精品欧美日韩精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| a级一级毛片免费在线观看| av网站免费在线观看视频| 国产男女内射视频| 午夜激情福利司机影院| 特级一级黄色大片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 午夜福利视频精品| 黄色欧美视频在线观看| 午夜福利高清视频| 观看美女的网站| 特大巨黑吊av在线直播| 白带黄色成豆腐渣| xxx大片免费视频| 丝袜脚勾引网站| 99久久精品一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 日本av手机在线免费观看| 久久99热6这里只有精品| 国产欧美日韩精品一区二区| .国产精品久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 大码成人一级视频| 久久久久精品性色| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 91狼人影院| 街头女战士在线观看网站| 综合色丁香网| 国产精品蜜桃在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一本一本综合久久| 91狼人影院| 亚洲精品成人av观看孕妇| 18+在线观看网站| 街头女战士在线观看网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久a久久爽久久v久久| 国产午夜福利久久久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产色片| av专区在线播放| freevideosex欧美| 日本av手机在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 欧美精品一区二区大全| 午夜亚洲福利在线播放| videos熟女内射| 寂寞人妻少妇视频99o| xxx大片免费视频| 亚洲人与动物交配视频| 99re6热这里在线精品视频| 视频区图区小说| 最后的刺客免费高清国语| 一级爰片在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久99热这里只频精品6学生| 如何舔出高潮| 欧美日韩综合久久久久久| 国产成年人精品一区二区| 国产人妻一区二区三区在| kizo精华| 高清日韩中文字幕在线| 国产视频内射| 波野结衣二区三区在线| 国国产精品蜜臀av免费| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久久久久久久人人人人人人| 777米奇影视久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲精品色激情综合| 午夜爱爱视频在线播放| 黄色一级大片看看| 亚洲国产欧美人成| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产精品熟女久久久久浪| 午夜免费观看性视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 91在线精品国自产拍蜜月| 又爽又黄a免费视频| 亚洲av日韩在线播放| 久久久精品欧美日韩精品| 成人亚洲精品av一区二区| 大陆偷拍与自拍| 大片电影免费在线观看免费| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国内精品美女久久久久久| 激情五月婷婷亚洲| 99久久人妻综合| 1000部很黄的大片| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品456在线播放app| 91精品国产九色| 午夜免费鲁丝| 欧美成人一区二区免费高清观看| 韩国高清视频一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 1000部很黄的大片| 久久久精品94久久精品| 国产精品99久久99久久久不卡 | 午夜视频国产福利| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 免费看光身美女| 三级国产精品欧美在线观看| 99热国产这里只有精品6| 中国国产av一级| 五月天丁香电影| 欧美97在线视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 少妇的逼好多水| 久久久久九九精品影院| 亚洲天堂国产精品一区在线| 看十八女毛片水多多多| 国产黄色免费在线视频| 在线观看国产h片| 久久久久精品性色| 可以在线观看毛片的网站| 国产免费一级a男人的天堂| 国产亚洲最大av| 男人狂女人下面高潮的视频| www.av在线官网国产| 亚洲国产av新网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产高清三级在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 色视频www国产| 在线精品无人区一区二区三 | 成人黄色视频免费在线看| 亚洲自偷自拍三级| 免费黄色在线免费观看| 内射极品少妇av片p| 草草在线视频免费看| 亚洲四区av| 久久这里有精品视频免费| 精品人妻视频免费看| 日本爱情动作片www.在线观看| 美女高潮的动态| 在线观看人妻少妇| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 五月玫瑰六月丁香| 久久久久精品性色| 日韩欧美一区视频在线观看 | 在线观看免费高清a一片| 中文字幕制服av| 免费看不卡的av| 交换朋友夫妻互换小说| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 久久精品国产亚洲av天美| 岛国毛片在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 九色成人免费人妻av| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 少妇高潮的动态图| 99久久精品热视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 五月开心婷婷网| 亚洲精品视频女| 国产精品av视频在线免费观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成年av动漫网址| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产男女内射视频| 国产乱来视频区| 伦精品一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品久久久精品久久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产一区二区在线观看日韩| 最近手机中文字幕大全| 久久这里有精品视频免费| 欧美日韩视频精品一区| av国产久精品久网站免费入址| 精品久久久噜噜| 在线看a的网站| 高清日韩中文字幕在线| 成人无遮挡网站| 久久99热6这里只有精品| 国产探花极品一区二区| 美女主播在线视频| 好男人视频免费观看在线| 久久久a久久爽久久v久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久热久热在线精品观看| www.av在线官网国产| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 内地一区二区视频在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久久久久久大av| 热99国产精品久久久久久7| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚州av有码| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 午夜激情久久久久久久| 日本一二三区视频观看| 青春草视频在线免费观看| av播播在线观看一区| 午夜福利视频精品| 欧美97在线视频| 亚洲精品,欧美精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久久久久久大尺度免费视频| av在线蜜桃| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产黄色免费在线视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产在线一区二区三区精| 两个人的视频大全免费| 在线观看国产h片| 久久久久久久国产电影| 国产午夜福利久久久久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 免费在线观看成人毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品第二区| 岛国毛片在线播放| 久久人人爽人人爽人人片va| 秋霞在线观看毛片| 精品酒店卫生间| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久久国产精品人妻一区二区| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲国产av新网站| 久久久久网色| 欧美人与善性xxx| 高清日韩中文字幕在线| 国产 精品1| 伊人久久精品亚洲午夜| 七月丁香在线播放| 水蜜桃什么品种好| 波野结衣二区三区在线| 夫妻午夜视频| 18禁动态无遮挡网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲最大成人av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 中文在线观看免费www的网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产成人a区在线观看| 久久久午夜欧美精品| 国产精品久久久久久av不卡| 国产日韩欧美在线精品| 欧美日韩在线观看h| 99久国产av精品国产电影| 一个人看视频在线观看www免费| 最近最新中文字幕免费大全7| 黄色视频在线播放观看不卡| 人妻一区二区av| 中国三级夫妇交换| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩欧美 国产精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久久国产一区二区| 中文字幕制服av| 国产成人精品久久久久久| 黄色怎么调成土黄色| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美日韩视频精品一区| 禁无遮挡网站| 天天一区二区日本电影三级| 九色成人免费人妻av| 美女高潮的动态| 特级一级黄色大片| 亚洲av男天堂| 又爽又黄无遮挡网站| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 一边亲一边摸免费视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产伦在线观看视频一区| 久久99热这里只有精品18| 在现免费观看毛片| 亚洲三级黄色毛片| 日韩中字成人| 97精品久久久久久久久久精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 日本熟妇午夜| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产综合精华液| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产 一区精品| 日本午夜av视频| 亚洲综合精品二区| 十八禁网站网址无遮挡 | 免费av不卡在线播放| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲精品一区蜜桃| 免费看a级黄色片| 国模一区二区三区四区视频| 国产淫语在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| freevideosex欧美| 亚洲综合精品二区| 亚洲性久久影院| 成人国产av品久久久| 日本一二三区视频观看| 91狼人影院| 国产成年人精品一区二区| 国产精品伦人一区二区| 在线看a的网站| 欧美zozozo另类| 黄色欧美视频在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品一区www在线观看| 免费看光身美女| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲最大成人中文| 久久久国产一区二区| 欧美成人午夜免费资源| 在线看a的网站| 男男h啪啪无遮挡| 尾随美女入室| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲精品成人av观看孕妇| 看十八女毛片水多多多| 色哟哟·www| 乱码一卡2卡4卡精品| av播播在线观看一区| 水蜜桃什么品种好| 人体艺术视频欧美日本| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产成人精品一,二区| 日本色播在线视频| 国产乱来视频区| 国产永久视频网站| 久久久色成人| 国产男女超爽视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品三级大全| av黄色大香蕉| av国产免费在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 少妇的逼好多水| tube8黄色片| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲色图综合在线观看| 天堂网av新在线| 少妇丰满av| 亚洲成人一二三区av| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 成人免费观看视频高清| 色视频在线一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 一级毛片 在线播放| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日韩欧美精品v在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久久久久久久免费av| 国产免费视频播放在线视频| 成年版毛片免费区| 免费观看无遮挡的男女| 搞女人的毛片| 一级毛片电影观看| 波多野结衣巨乳人妻| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产探花在线观看一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人亚洲精品av一区二区| av在线观看视频网站免费| 久久国内精品自在自线图片| 免费大片黄手机在线观看| 欧美性感艳星| 联通29元200g的流量卡| av免费在线看不卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 中文天堂在线官网| 在线 av 中文字幕| 人体艺术视频欧美日本| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 黄色一级大片看看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产探花在线观看一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产毛片在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 五月开心婷婷网| 美女xxoo啪啪120秒动态图| a级一级毛片免费在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 久久久久久久久久久丰满| 男女边摸边吃奶| 春色校园在线视频观看| 欧美日韩综合久久久久久| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久久久久免费av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产欧美亚洲国产| 国产成人福利小说| 国产成人a区在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 美女高潮的动态| 精品人妻视频免费看| 青春草国产在线视频| 欧美xxⅹ黑人| 一本久久精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 欧美最新免费一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成人美女网站在线观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜福利在线在线| 秋霞在线观看毛片| 久久精品人妻少妇| 亚洲国产色片| 永久免费av网站大全| 在线免费十八禁| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 日韩亚洲欧美综合| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线| 日韩欧美 国产精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产高潮美女av| 午夜福利视频1000在线观看| 久久精品人妻少妇| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日本熟妇午夜| 老司机影院成人| 欧美日韩在线观看h| 最近最新中文字幕大全电影3| 在线观看国产h片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产人妻一区二区三区在| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产淫语在线视频| 丝袜美腿在线中文| 三级国产精品欧美在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲内射少妇av| 国产欧美亚洲国产| 国产人妻一区二区三区在| 欧美bdsm另类| 日韩欧美一区视频在线观看 | 一级二级三级毛片免费看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲av一区综合| 亚洲最大成人中文| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲性久久影院| 久久ye,这里只有精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 我要看日韩黄色一级片| 97在线人人人人妻| 亚洲自偷自拍三级| av专区在线播放| 少妇的逼好多水| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲av一区综合| 免费大片黄手机在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 内射极品少妇av片p| 搡老乐熟女国产| 91狼人影院| 丝袜美腿在线中文| 久久热精品热| 又爽又黄a免费视频| 18禁在线播放成人免费| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产一级毛片在线| 国产av不卡久久| 久久久久久久久久久免费av| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲av男天堂| 特级一级黄色大片| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 美女国产视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 99久久精品国产国产毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 男女无遮挡免费网站观看| 久久韩国三级中文字幕| 日产精品乱码卡一卡2卡三| av在线老鸭窝| 一区二区三区四区激情视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 又爽又黄a免费视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲久久久久久中文字幕| 91久久精品国产一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 香蕉精品网在线| 欧美国产精品一级二级三级 | 少妇高潮的动态图| 午夜激情福利司机影院| 亚洲精品乱久久久久久| 看免费成人av毛片| 免费黄色在线免费观看| 最新中文字幕久久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 99热国产这里只有精品6| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩三级伦理在线观看| 国产乱人偷精品视频| 亚洲精品色激情综合| 美女被艹到高潮喷水动态| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美人与善性xxx| 欧美zozozo另类| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 一区二区三区精品91| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产成年人精品一区二区| 免费看不卡的av| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产高清在线一区二区三| 97精品久久久久久久久久精品| 日本午夜av视频| 在线观看一区二区三区激情| 嫩草影院精品99| 白带黄色成豆腐渣| 一区二区三区乱码不卡18| 天堂中文最新版在线下载 | 国产在线男女|