卵巢上皮性癌轉移的關鍵基因篩選與功能分析*

吳巧鈴,姜 山,2**,陳雨微,孫 陽***

(1.福建省腫瘤醫(yī)院婦科 福建醫(yī)科大學腫瘤臨床醫(yī)學院,福州 350014;2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,福州 350122)

卵巢癌死亡率居于婦科惡性腫瘤首位,由于臨床表現(xiàn)隱匿、早期癥狀不典型且缺乏有效的篩查手段,大多數患者確診時已為晚期[1-2]。卵巢癌亞型復雜,具有不同的分子生物學特征,即使采用外科手術輔以全身化療這一首選治療方案,幾乎所有患者都會復發(fā)[3-4]。進一步深入研究卵巢癌轉移機制,并在此基礎上尋找新的治療靶點具有重要意義。PXN作為一種蛋白質編碼基因,編碼細胞骨架蛋白——樁蛋白(paxillin),該蛋白聯(lián)合VCL(vinculin)和ZYX(zyxin)蛋白通過LC3參與細胞和黏著斑(FAs)位點的黏附過程,影響癌細胞的遷移和侵襲[5-7]。本研究挖掘卵巢癌中高表達的遷移侵襲相關基因PXN并驗證其生物學功能,以期為晚期卵巢癌轉移機制提供新的理論依據和治療新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系與試劑 卵巢癌細胞系SKOV3細胞由福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院贈送。McCoy's 5A培養(yǎng)基購自上海源培生物科技公司;新生胎牛血清購自德國PAN公司;兔抗人PXN單克隆抗體購自英國Abcam公司;兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國CST公司;HRP標記的羊抗兔第二抗體購自北京中杉金橋公司;ECL化學發(fā)光試劑購自大連美侖生物公司;RNA提取試劑盒購自美國Promega公司;逆轉錄試劑盒購自Roche公司;Transwell透明小室及Matrigel基質膠購自美國Corning公司;PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體購自上海吉凱基因公司。

1.2 篩選、分析卵巢上皮性癌(卵巢癌)轉移的關鍵基因

1.2.1 卵巢癌公共測序數據獲取及處理 通過UCSC Xena(University Of Cingifornia Sisha Cruz,加州大學圣克魯茲分校)門戶下載來自于TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌癥基因組圖譜)數據庫的卵巢癌組織測序數據作為訓練集,以及來自GTEx(Genotype-Tissue Expression Project,基因型-組織表達數據庫)的正常卵巢組織測序數據,并通過TCGA數據庫補充訓練集缺失的臨床信息[8]。通過GEO(Gene Expression Omnibus,基因表達綜合)數據庫下載卵巢癌基因芯片數據及臨床信息GSE26712作為驗證集[9]。所有數據利用軟件R進行基因注釋,并處理為log2(TPM+1)進行后續(xù)分析,刪除缺失值,相同基因取平均值去重。

1.2.2 遷移侵襲能力相關基因的獲取 在GeneCards(人類基因數據庫,https://www.genecards.org/)綜合數據庫中分別輸入搜索詞“migration”和“invasion”,從該數據庫下載遷移侵襲相關基因,以相關分數“Relevance score”>7為條件,篩選出與細胞遷移侵襲能力相關性較高的基因。

1.2.3 差異表達分析 利用R 4.2.2及l(fā)imma算法聯(lián)合TCGA與GTEx數據庫進行差異表達分析,對比遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達水平。以差異表達倍數logFC>1和adj.P<0.001為篩選條件,尋找在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因。應用“ggplot2”R包繪制火山圖對差異表達分析結果進行可視化。

1.2.4 生存分析 根據遷移侵襲相關基因表達中位值將全部卵巢癌樣本分為高低表達兩組,應用“survival”R包計算高低表達兩組之間生存差異。通過交集獲取在訓練集TCGA隊列及驗證集GSE26712隊列都具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的遷移侵襲相關基因,應用“survminer”R包進行生存曲線可視化。

1.2.5 GO/KEGG功能富集分析 基于TCGA卵巢癌數據集以“cortest”函數進行相關性分析,以|R|>0.7及P<0.05為篩選標準,獲得與遷移侵襲基因顯著相關的基因群,應用“clusterProfiler”R包對基因群進行功能富集分析,“GOplot”R包進行富集結果可視化,富集分析結果以adjP<0.05為標準過濾。

1.3 藥物IC50值預測 依據TCGA-OV隊列相應的臨床信息,利用GDSC(癌癥藥物敏感性基因組學)數據庫預測了每個樣本的化療反應。預測過程由R包pRRophetic實現(xiàn),其中樣品的半數最大抑制濃度(IC50)通過嶺回歸估計,所有參數均按默認值設置,使用“combat”的批次效應和“all”的組織類型,并將重復基因表達總結為平均值。

1.4 細胞實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將SKOV3細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的McCoy's 5A培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),細胞密度達80%時,進行傳代培養(yǎng)。

1.4.2PXN穩(wěn)定敲減卵巢癌細胞系的構建PXN穩(wěn)定敲減慢病毒載體(GV493-PXN-EGFP)由上海吉凱基因公司設計并合成,感染敲減慢病毒的組別為實驗組(shPXN),以不轉染病毒作為空白對照(Mock)、轉染空載病毒(Ctrl)作為對照。具體方法:除去多余培養(yǎng)基,分別加病毒、培養(yǎng)基及相應感染增強液,輕柔混勻,常規(guī)培養(yǎng)。12h后除去多余培養(yǎng)基,用PBS輕柔清洗2次,加常規(guī)培養(yǎng)基。采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染細胞株,若熒光顯微鏡下感染效率>80%,表明嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定感染細胞株,可收集細胞擴大培養(yǎng)并進行后續(xù)實驗。

1.4.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR) 取各組SKOV3細胞樣本,按試劑盒說明書提取總RNA。逆轉錄的反應程序:55℃反應30min,85℃反應5min,4℃反應至結束;qPCR反應程序:95℃預變性10min,95℃變性15s,60℃反應1min,共30個循環(huán)。PXN基因引物序列,上游:5'-CAATGGCACAATCCTTGACC-3',下游:5'-GTGATGAGGACTGAGGCTG-3';GAPDH基因為內參照,其引物序列,上游:5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',下游:5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。采用2-ΔΔCt方法計算PXNmRNA表達水平,其中Ct表示循環(huán)閾值。

1.4.4 蛋白免疫電泳(Western blot) 取各組SKOV3細胞樣本,加細胞裂解液,提取總蛋白,進行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)電泳,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)轉膜,5%脫脂奶粉封閉2h,加稀釋后的一抗(PXN按1∶1000稀釋,GAPDH按1∶5000稀釋),4℃搖床過夜。洗膜,加二抗,37℃搖床孵育60min。取強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑A、B液按體積1∶1混合,加至PVDF膜,用蛋白曝光儀對目的蛋白條帶進行曝光、掃描、照相。

1.4.5 細胞劃痕實驗 將實驗組、陰性對照組和空白對照組細胞分別按2×105細胞/孔接種于6孔板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜,觀察細胞融合率達90%以上并在6孔板底部形成單層細胞。除去多余培養(yǎng)基,采用無菌槍頭垂直于板底進行劃痕,加無血清培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)0、24h,顯微鏡下觀察、測量劃痕的寬度,并拍照,采用Image J軟件分析劃痕面積,計算細胞遷移率以評估細胞的遷移能力,細胞遷移率(%)=(0h的劃痕面積-24h的劃痕面積)/0h的劃痕面積×100%。

1.4.6 Transwell遷移侵襲實驗 在Transwell小室(24孔板)上室加稀釋后(稀釋倍數1∶5)的Matrigel基質膠70μL(遷移實驗則無需)。取對數生長期SKOV3細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,按1×105/孔細胞加入Transwell小室的上室,在下室中加含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基,隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。經甲醛固定、結晶紫染色,顯微鏡下觀察、拍照,Image J軟件計數穿膜細胞數,以此反映細胞的遷移侵襲能力。

2 結 果

2.1 影響卵巢癌遷移侵襲能力的預后相關基因

2.1.1 篩選在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因 從GeneCard數據庫分別下載影響細胞遷移與侵襲能力的基因,以相關分數(Relevance score)>7為條件,篩選出與遷移侵襲相關性均較高的基因55個。聯(lián)合TCGA和GTEx數據庫,基于R語言“l(fā)imma”算法對篩選出的55個基因進行差異表達分析,火山圖用于可視化。以logFC(差異倍數)>1和adj.P(統(tǒng)計學方法校正后的P)<0.001為篩選條件,發(fā)現(xiàn)36個遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織高表達,1個遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織低表達(圖1)。

圖1 篩選在卵巢癌組織中高表達的遷移侵襲相關基因A:Genecards數據庫中遷移與侵襲相關基因的集合情況;B:火山圖展示遷移侵襲相關基因在卵巢癌組織與正常卵巢癌組織中的表達差異

2.1.2 各隊列生存預后相關基因情況 基于TCGA-OV隊列(訓練集)和GEO數據庫中的GSE26712數據集(驗證集),依據基因表達的中位數將樣本分為高低表達組,利用R語言和Kaplan-Meier生存曲線對36個高表達基因進行生存分析后取交集,發(fā)現(xiàn)1個遷移侵襲相關基因具有生存預后意義(P<0.05),該基因為PXN。見圖2。

圖2 各隊列生存預后相關基因情況

利用Kaplan-Meier生存曲線對36個高表達基因進行生存分析后取交集,GSE26712隊列中有1個基因具有預后意義,TCGA-OV隊中有4個基因具有預后意義,在兩個隊列中均有預后意義的基因有1個

2.1.3PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響 進一步對交集中的PXN基因進行生存曲線可視化,發(fā)現(xiàn)其與卵巢癌患者不良預后相關,隨著基因表達量增加,患者的總生存期明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響A:利用TCGA數據庫探討PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響;B:利用GSE26712數據集探討PXN基因對卵巢癌患者總生存期的影響

2.1.4PXN基因GO功能富集分析結果 通過GO/KEGG功能富集分析探索PXN參與的生物過程(biological process,BP)。結果表明PXN的功能與組蛋白修飾、染色質共價修飾、賴氨酸肽基修飾、蛋白質去泛素化、通過去除小蛋白進行蛋白質修飾、組蛋白去泛素化及組蛋白H3-K4三甲基化等相關(P<0.05),見圖4。

圖4 PXN基因GO功能富集分析結果

2.2 敲減PXN基因對卵巢癌細胞遷移侵襲能力的影響

2.2.1 成功敲減PXN基因 利用敲減慢病毒載體感染卵巢癌細胞SKOV3后,Western blot檢測結果示,PXN敲減組(shPXN)的paxillin蛋白表達水平明顯低于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)(P<0.0001);RT-qPCR檢測結果示,PXN敲減組(shPXN)的PXNmRNA表達水平明顯低于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)(P<0.01)。表明慢病毒已成功感染卵巢癌細胞,并干擾PXN基因的轉錄及翻譯。見圖5。

圖5 驗證PXN基因敲減效果A、B:Western blot檢測各組細胞paxillin蛋白表達;C:RT-qPCR檢測各組細胞PXN mRNA表達;Mock:空白對照組,Ctrl:陰性對照組,shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,****P<0.0001

2.2.2 敲減PXN基因抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移侵襲能力 劃痕實驗進行到24h時,PXN敲減組(shPXN)的劃痕愈合面積明顯少于空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖6A)。表明敲減PXN基因抑制卵巢癌細胞SKOV3細胞愈合能力、遷移能力。

圖6 各組SKOV3細胞遷移侵襲能力A:細胞劃痕實驗檢測;B:PXN敲減后SKOV3細胞遷移數改變;C:PXN敲減后SKOV3細胞侵襲數改變;Mock:空白對照組;Ctrl:陰性對照組;shPXN:PXN敲減組,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

Transwell實驗檢測結果顯示,與空白對照組(Mock)和陰性對照組(Ctrl)比較,PXN敲減組(shPXN)穿膜細胞數明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖6B、C)。表明敲減PXN基因可抑制卵巢癌細胞SKOV3體外遷移侵襲能力。

2.3PXN基因對卵巢癌化療耐藥的潛在影響PXN高表達組中順鉑及紫杉醇的IC50值明顯高于PXN低表達組(P<0.001),而吉西他濱及多柔比星的IC50值明顯低于PXN低表達組(P<0.0001)。腫瘤細胞(PXN高表達組及PXN低表達組)中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細胞(P<0.0001),吉西他濱及多柔比星的IC50值高于正常卵巢細胞(P<0.0001)。見圖7。

圖7 PXN基因表達水平對藥物IC50的影響A:不同組別順鉑的IC50;B:不同組別紫杉醇的IC50;C:不同組別吉西他濱的IC50;D:不同組別多柔比星的IC50;1:PXN高表達;2:PXN低表達;3:正常卵巢組織***P<0.001,****P<0.0001

3 討 論

大多數卵巢癌患者確診時已為晚期,且70%的晚期上皮性卵巢癌患者會出現(xiàn)癌癥復發(fā)、生存率極低,因此腫瘤轉移的分子機制越來越引起研究者的重視[10]。本研究發(fā)現(xiàn),36個遷移侵襲相關基因(Relevance score>7)在卵巢癌中高表達(logFC>1和adj.P<0.001),它們可能是潛在的致癌基因,通過編碼相關蛋白促進卵巢癌的轉移。為進一步將基礎研究與臨床特征相關聯(lián),探索遷移侵襲相關基因的高表達與卵巢癌患者總生存時間是否存在聯(lián)系,對卵巢癌中高表達的36個遷移侵襲相關基因進行了多隊列生存分析,結果發(fā)現(xiàn)在不同隊列中PXN基因高表達都與患者不良預后相關(P<0.05)。GO/KEGG功能富集分析結果提示,PXN基因與染色質的修飾調控相關,PXN基因可能通過干預轉錄參與細胞的惡性化過程。

PXN基因編碼的paxillin蛋白分子量大小為68kDa,是整合素調節(jié)信號傳導的重要組成部分,能將肌動蛋白連接到富含整合素的細胞黏附位點,在細胞-基質和細胞-細胞黏附之間起重要作用[11]。多項研究已表明,PXN基因能調節(jié)腫瘤細胞的生物學功能,如PXN基因能通過維持細胞間黏附連接完整性來促進乳腺腫瘤細胞侵襲;通過增加Src表達促進NF-κB的活化,促進卵巢癌血管生成;降低PXN基因表達,抑制ERK信號通路抑制直腸癌的轉移和上皮-間充質轉化[12-14]。PXN作為遷移侵襲相關基因在卵巢癌中的作用機制尚不清楚,既往研究提示PXN基因可能作為致癌因子促進卵巢癌的轉移。

本研究結果顯示,PXN敲減抑制卵巢癌SKOV3細胞的愈合及體外遷移侵襲能力。PXN基因的生物學功能在其他腫瘤中也得到相應的驗證,敲減PXN基因抑制胃癌細胞、頭頸部鱗狀細胞癌細胞及非小細胞肺癌細胞的遷移侵襲[15-17];通過調控細胞凋亡抑制宮頸癌細胞增殖與黏附[18];抑制裸鼠體內結直腸癌的生長[19]。提示PXN基因能促進卵巢癌細胞侵襲轉移。這與本研究生物信息分析結果相吻合。PXN基因是卵巢癌治療的潛在靶點,可能通過調控細胞黏附影響細胞的遷移侵襲能力,其促癌能力或許是卵巢癌患者不良預后的因素之一。

本研究結果顯示,PXN高表達降低卵巢癌細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性,而吉西他濱和多柔比星或許是更具潛力的備選藥物。但總體來說,紫杉醇仍是最優(yōu)選擇,因腫瘤細胞中紫杉醇IC50明顯低于正常卵巢細胞,或許能最大程度地降低化療藥物對卵巢癌患者的傷害。

綜上所述,PXN作為遷移侵襲相關基因在卵巢癌中呈相對高表達,且與患者不良預后及對化療藥物的敏感性相關,敲減PXN能抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移侵襲,可能是潛在的轉移預測標志物。PXN基因調控卵巢癌遷移侵襲的機制及臨床轉化應用尚待進一步研究,本課題組將在后續(xù)的研究中為晚期卵巢癌的靶向治療尋找更多的理論依據和實驗基礎。