基于可培養(yǎng)技術的中國不同城市家用冰箱中細菌多樣性研究

蔡云虹,劉學孜,劉麗娜,葛媛媛 ,謝九艷,張軍,高逸,張健,袁帥,龐玲玲,王喆*,姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)2(合肥華凌股份有限公司,安徽 合肥,230601) 3(中標能效科技(青島)有限公司,山東 青島,266200)

在全球倡導“健康環(huán)?！贝蟊尘跋?跨領域的健康家電技術研發(fā)成為推動輕工業(yè)高質量發(fā)展的趨勢。冰箱內環(huán)境衛(wèi)生狀況及微生物多樣性研究近年來備受關注。而微生物通過未清洗的食材、食材包裝表面或消費者手部攜帶等途徑進入冰箱內環(huán)境,且部分菌株如假單胞菌(Pseudomonassp.)、氣單胞菌(Aeromonassp.)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)可在低溫環(huán)境下生長[1-2],造成冰箱使用過程中的微生物污染[3],或引起食品腐敗而產生異味[4]。此外,不良存儲習慣也可能造成食材交叉污染,在食用即食產品時帶來潛在安全隱患[5-6]。

目前,國內外關于家用冰箱衛(wèi)生狀況調研、微生物群落多樣性的研究,大部分集中于冰箱中食源性致病菌的檢測,而針對不同地域及不同位點下的冰箱在使用過程中的細菌多樣性鮮有報道。KENNEDY等[7]調研了愛爾蘭地區(qū)1 020戶用戶使用習慣與其中900臺冰箱的衛(wèi)生狀況,發(fā)現(xiàn)使用習慣較好的消費者冰箱中檢出的菌落總數相對較低。CATELLANI等[8]研究意大利293臺受試冰箱后發(fā)現(xiàn),不同位點衛(wèi)生狀況存在差異性,冷藏室底部相較冷藏室側壁的菌落總數較高。利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術的研究表明,冰箱冷藏室中的細菌主要以不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽胞桿菌屬(Bacillus)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為主[1]。羊宋貞等[9]在中國5臺冰箱中分離得到14株條件致病菌,主要為葡萄球菌屬(Staphylococcus),占總分離細菌株數的16.67%。而廣泛關注的L.monocytogenes在伊朗180臺家用冰箱的檢出率為0.5%[10]。

本研究選取中國5個不同城市的冰箱樣品,采集不同位點,基于可培養(yǎng)技術開展細菌多樣性分析,系統(tǒng)性摸底調研家用冰箱使用過程中的微生物污染狀況,探究細菌多樣性及優(yōu)勢菌株分布,重點關注食品腐敗菌、產異味能力菌株或有潛在致病風險菌株的分布狀況,為升級優(yōu)化保鮮技術,實現(xiàn)針對不同位點的精準控菌,研發(fā)健康家電奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 采樣對象和試劑

依據地理位置以及不同地域飲食習慣差異,選取哈爾濱、北京、青島、成都、廣州5個城市,每個城市3臺冰箱,共15臺樣品開展入戶采集。針對冰箱主要存放食品類型,兼顧不同用戶的家庭結構、冰箱使用頻率及清潔頻率,根據冰箱結構特征及文獻調研,確定冷藏室果蔬籃及內壁、冷藏室門擱架、冷凍室內壁和冷藏室空氣等4個采樣位點。

2021年11月至2022年5月共采集60個樣本,采樣前要求用戶2周內不做徹底清潔。詳細信息見表1。

表1 家用冰箱樣品信息表Table 1 Information of the tested domestic refrigerators

TSA(BD)、R2A瓊脂(BD)、哥倫比亞血瓊脂平板、0.85%生理鹽水,北京陸橋技術股份有限公司;丙三醇,國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂糖,北京全式金生物技術有限公司,PCR引物,生工生物工程(上海)股份有限公司;QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit,QIAGEN。

1.2 儀器與設備

AC2-6S1生物安全柜,ESCO公司;DK-8AX隔水式培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司;微量可調移液器,德國Eppendorf公司;648L冰箱,海爾智家股份有限公;電子天平,常熟市佳衡天平儀器有限公司;高壓滅菌鍋,日本HIRAYAMA公司;旋渦震蕩儀,德國Votex公司;基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)儀,德國BRUKER公司;EC250-90電泳儀、Gel DoCqM EZ凝膠成像儀,美國BIO-RAD;PCR儀,美國ABI公司;MA-100ST浮游菌采樣器,西瓦卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 采樣方法

1.3.1.1 電冰箱內接觸表面采樣

參考GB/T 18204.4—2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分:公共用品用具微生物》附錄A 公共場所、公共用品用具采樣方法,分別在冷藏室門擱架、冷藏室果蔬籃及其上下左右內壁、冷凍室抽屜內壁各隨機選取6個點,將無菌棉拭子于5 mL無菌生理鹽水中浸潤,在采樣區(qū)(5 cm×5 cm)均勻涂抹5次,用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸部位,并將剩余棉拭子置于無菌生理鹽水,封口并置于采樣箱中,于2～8 ℃下保存并運輸,每個采樣位置收集2份樣品。

1.3.1.2 電冰箱空氣樣品采樣

參考GB/T 18204.3—2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第3部分:空氣微生物》中的方法,在采樣前使用75%的酒精分別對采樣人員雙手、培養(yǎng)皿和儀器表面進行消毒,將貼有玻璃紙的TSA培養(yǎng)基放裝入浮游菌采樣器內,再置于冰箱冷藏室進行采樣,設定采樣流量為100 L/min,采樣時間10 min。采樣完成后,將培養(yǎng)皿用封口膜封口,于2～8 ℃下保存并運輸。

1.3.2 分離方法

冰箱表面采集的樣品,以10倍梯度逐級稀釋,制得1∶10的樣品懸液。采集的冷藏室空氣樣品,將TSA培養(yǎng)基上的玻璃紙,置于無菌培養(yǎng)皿中,用5 mL PBS緩沖液進行反復沖洗回收,制成樣品懸液。

吸取100 μL原液和稀釋液分別涂布于TSA、R2A、哥倫比亞血平板,每組平行2個,然后分別置于30 ℃和6.5 ℃下好氧培養(yǎng)7～10 d。每天觀察不同條件下培養(yǎng)基上的菌落特征,選取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的單菌落,通過平板劃線進行純化,并記錄菌落形態(tài)特征和數量。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 MALDI-TOF MS鑒定

采用甲酸萃取法制備檢測樣本,分別挑取培養(yǎng)皿中各菌株菌體,混勻于300 μL超純水中,添加 900 μL無水乙醇充分振蕩,離心菌體并去除上清液,完全去除乙醇后,用50 μL 70%(體積分數)甲醇重懸菌體細胞,再加入50 μL乙腈,通過移液槍反復吹打混合懸液;將制備的懸液按照MALDI-TOF MS檢測規(guī)程進行鑒定分析,確定菌株種水平分類學地位。結果得分位于2.00～3.00,表示可鑒定到種水平;結果得分位于1.70～1.99,表示可鑒定到屬水平;結果得分位于0.00～1.69,表示沒有可信的鑒定結果。

1.3.3.2 16S rDNA基因序列測定

對于未有鑒定結果的菌株,分別提取各菌株的基因組DNA,以基因組DNA為模板,采用細菌16S rDNA通用正向引物27F和反向引物1492R進行PCR擴增,PCR反應條件參數如下:94 ℃,5 min,1 cycle;94 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、1.5 min,30 cycles;72 ℃,10 min,1 cycle。將得到的PCR產物送至生工生物進行16S rDNA基因序列測定。使用EzBioCloud服務器(www.ezbiocloud.net/identify) 進行相似性搜索,將菌株的16S rRNA基因序列與已發(fā)表的有效種進行比較,獲得菌株的分類學地位。

1.4 數據分析

使用Kruskal-Wallis test (www.statskingdom.com/kruskal-wallis-calculator.html)對冰箱不同部位及不同地區(qū)冰箱的菌落總數及嗜冷菌總數進行統(tǒng)計分析。P<0.05時認為數據間有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 家用冰箱使用過程中的微生物衛(wèi)生狀況

如表2所示,5座城市15臺冰箱中,冷藏室果蔬籃及內壁、冷藏室門擱架、冷凍室內壁的微生物總數為102～103CFU/cm2,嗜冷菌總數為101～102CFU/cm2;冷藏室空氣微生物總數在10 CFU/m3左右,而冷藏室空氣嗜冷菌幾乎無法檢出。結果顯示,電冰箱的微生物總數和嗜冷菌總數的分布趨勢一致。使用Kruskal-Wallis test對冰箱不同采樣位點及不同城市冰箱的微生物總數及嗜冷菌總數開展統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn),P值均大于0.05,證明15臺冰箱不同采樣位點及不同城市間的微生物總數及嗜冷菌總數均無顯著差異。此外,研究發(fā)現(xiàn)樣品2的冷凍室內壁、樣品7的冷藏室果蔬籃及內壁2個采樣位點相比偏高,而樣品8各位點的微生物總數相對較少。結合用戶的清潔習慣及清潔頻率調研情況發(fā)現(xiàn),樣品2及樣品7的清潔頻率較低,且食品貯存時生熟混放,而樣品8使用時分區(qū)嚴格且定期進行徹底清潔,推測差異與個人清潔習慣和電冰箱衛(wèi)生狀況具有較大關聯(lián)。

表2 不同位點及不同城市間家用冰箱樣品的微生物總數及嗜冷菌總數結果Table 2 Total viable count of the tested domestic refrigerators

2.2 基于可培養(yǎng)技術的細菌分離鑒定

2.2.1 冰箱中可培養(yǎng)細菌整體分離結果

北京、廣州、哈爾濱、成都、青島5個城市15臺冰箱中共分離獲得63個屬155種459株細菌。在30 ℃培養(yǎng)條件下,共分離到50個屬131種350株細菌,結果如圖1-A所示。在屬水平上分離頻次較高的細菌主要為Bacillus101株、Staphylococcus29株、微桿菌屬(Microbacterium)22株、微球菌屬(Micrococcus)20株。Bacillus內分離頻次較高的為蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)28株,其可在米飯、牛奶、蔬菜等食物中定植,代謝產生腸毒素、催吐毒素等,導致腹瀉、嘔等,是一類分布較為廣泛的食源性致病菌[11];Staphylococcus內分離頻次較高的為松鼠葡萄球菌(S.sciuri),共5株,其廣泛在動物源食品中分布,具有脫羧酶活性,可產生生物胺,從而導致食品腐敗[11];Microbacterium內分離頻次較高的為樹狀微桿菌(M.arborescens),共7株,主要報道來源于植物根莖[11];Micrococcus內分離頻次較高的為藤黃微球菌(M.luteus),共19株,來源于人體皮膚表面及空氣環(huán)境,可代謝汗腺及皮脂,產生異味[11-12]。在6.5 ℃培養(yǎng)條件下,共獲得細菌24個屬46種108株細菌,結果如圖1-b所示。其中分離頻次較高的屬分別是Pseudomonas,共41株、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter),共15株和索絲菌屬(Brochothrix),共10株。Pseudomonas為文獻中廣泛報道的嗜冷微生物,其屬內的莓實假單胞菌(P.fragi)、陰城假單胞菌(P.umsongensis)及韓國假單胞菌(P.koreensis)均有報道可以在4 ℃下生長[11,13-14]。Psychrobacter也屬于嗜冷微生物,其中,海嗜冷桿菌(P.maritimus)及食物嗜冷桿菌(P.alimentarius)報道來自于海鮮產品,并可在4 ℃下生長[13-14]。這些具有低溫生長特性的菌株在冰箱冷藏室設定溫度內生長,不僅加速食物變質,還對人們的健康構成隱患,因此,在抗菌、除菌技術的優(yōu)化升級中需關注此類微生物。

a-30℃培養(yǎng)條件下,分離頻次>3;b-6.5℃培養(yǎng)條件下,分離頻次>1圖1 細菌分離株及其分離頻次Fig.1 Bacterial isolates and their isolation frequencies

圖2表明,30 ℃與6.5 ℃培養(yǎng)條件下共分離獲得15個屬的共有細菌,在2種培養(yǎng)條件下分離頻次均較高的有Pseudomonas、泛菌屬(Pantoea)、Acinetobacter與Psychrobacter,這些菌株可適應較廣的溫度范圍,可以在4～30 ℃下生長[11]。30 ℃培養(yǎng)條件下共分離獲得35個屬的特有細菌,其中分離頻次較高的有Staphylococcus、Micrococcus與考克氏菌屬(Kocuria)。6.5 ℃培養(yǎng)條件下共分離獲得9個屬的特有細菌,其中分離頻次較高的有嗜冷鏈球菌屬(Peribacillus)。

圖2 30 ℃及6.5 ℃培養(yǎng)條件下分離的共有細菌及特有細菌Fig.2 Common bacteria and endemic bacteria isolated under 30 ℃ and 6.5 ℃

2.2.2 不同城市冰箱中可培養(yǎng)細菌的分離鑒定

為探究地域因素對冰箱使用過程中細菌多樣性的影響,在屬水平上統(tǒng)計冰箱分離株種類和數量。5個城市中,哈爾濱共分離到細菌23個屬95株,主要為Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus;北京共分離到細菌35個屬124株,主要為Pseudomonas、Bacillus、Microbacterium;青島共分離到細菌23個屬56株,主要為Bacillus、Psychrobacter、Pseudomonas;成都共分離到細菌18個屬58株,主要為Pseudomonas、Bacillus、Micrococcus;廣州共分離到細菌24個屬126株,主要為Bacillus、Staphylococcus、Pantoea。通過主成分分析(圖3-a)可知,北京、廣州、成都、哈爾濱可培養(yǎng)細菌群落結構具有較高的相似性,廣州地區(qū)微生物集群聚集相對分離,表明廣州地區(qū)受試樣本的微生物群落結構相對獨特。

a-主成分分析;b-共有細菌情況(屬水平)圖3 不同城市冰箱中可培養(yǎng)細菌的共有性分析Fig.3 Commonality analysis in household refrigerator samples among different cities

結果顯示,Bacillus、Staphylococcus、Acinetobacter、Kocuria、Micrococcus和Psychrobacter在5個城市中均有分布。其中Bacillus在15臺冰箱中均有分布。這類菌屬常分離于土壤、水、空氣與食材中,是常見的環(huán)境微生物[11],容易通過環(huán)境與和冰箱貯存食物進入冰箱,對冰箱的衛(wèi)生環(huán)境造成潛在威脅。已有研究表明,在生的、洗過的和冷凍的蔬菜中,在新鮮的、冷凍的和貯存的魚產品中,以及在變質的肉、牛奶和奶酪中,都曾分離出這類菌屬。

2.2.3 冰箱不同采樣位點可培養(yǎng)細菌的分離鑒定

為探究冰箱不同采樣位點對冰箱使用過程中細菌多樣性的影響,統(tǒng)計對比4個采樣位點分離株種類和數量,冷藏室果蔬籃及內壁共分離得到細菌33個屬150株,主要為Bacillus、Pseudomonas、Pantoea;冷藏室門擱架共分離得到細菌36個屬126株,主要為Bacillus、Pseudomonas、Psychrobacter;冷凍室內壁共分離得到細菌30個屬141株,主要為Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus;冷藏室空氣共分離得到細菌16個屬42株,主要為Micrococcus、Staphylococcus、Moraxella。通過主成分分析(圖4-a)可知,冷藏室空氣位點的群落結構更加聚集,表明各冷藏室空氣樣品間差距較小。而冷藏室果蔬籃及內壁、冷藏室門擱架、冷凍室內壁的群落結構相對分散,且彼此之間沒有顯著差異。

a-主成分分析;b-共有細菌情況(屬水平)圖4 不同采樣位點樣品可培養(yǎng)細菌的共有性分析Fig.4 Commonality analysis in household refrigerator samples among different sample sites

如圖4所示,15臺冰箱各位點無共有細菌,其中10臺冰箱冷藏室果蔬籃及內壁分離得到Bacillus;12臺冰箱冷藏室門擱架分離得到Bacillus;7臺冰箱冷凍室內壁分離得到Bacillus;9臺冰箱冷藏室空氣中分離得到Micrococcus。對比不同位點下的分離結果,80%的冰箱的可接觸表面中均分離得到Bacillus。據文獻報道,部分Bacillus菌株具有獨特的具有S蛋白層(S-layers),該蛋白使微生物具有強烈的抗輻射能力[11]。因此,在后續(xù)冰箱研發(fā)接觸表面的抗菌材料時,應重點關注Bacillus在抗菌材料上的生長特性與抗性。同時,60%的冰箱的冷藏室空氣中分離得到Micrococcus,其廣泛報道來源于人體皮膚表面和空氣中,是空氣中的優(yōu)勢菌屬[15]。屬內主要為藤黃微球菌(M.luteus),該菌株可代謝產生揮發(fā)性物質,使人體及環(huán)境產生異味,同時具有較強的Grammar射線抗性[16],后續(xù)針對冰箱如光觸酶、離子法等主動殺菌方式的優(yōu)化中,應重點關注對該菌株的除菌效果。

3 討論與結論

冰箱作為家庭生活必不可缺的食品貯存電器,其細菌多樣性備受關注。本研究從5個城市15個冰箱樣品中共分離獲得細菌63個屬155種459株細菌。30 ℃培養(yǎng)條件下分布較多的為Bacillus、Staphylococcus和Microbacterium,6.5 ℃培養(yǎng)條件下分布較多的為Pseudomonas、Psychrobacter和Brochothrix。其中,Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus和Pantoea在文獻中廣泛報道[1,8-10]。而Psychrobacter、Brochothrix、Erwinia、明串珠菌屬(Leuconostoc)、氣球菌屬(Aerococcus)為本研究新發(fā)現(xiàn)的分離頻次較高的菌株,可能由于參研冰箱所處地理環(huán)境位置不同,存放的食材及樣品部件采集位置不同等原因造成的差異性。

本研究也重點關注具有潛在致腐性、產異味性及條件致病性的細菌,其中分布較廣、且分離頻次較高的關鍵細菌有Pseudomonas、Bacillus、Staphylococcus、Brochothrix、Moraxella和Micrococcus,具體分離城市與位點如表3所示。其中,具有潛在低溫致腐性的關鍵細菌應重點關注莓實假單胞菌(P.fragi)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)及熱殺索絲菌(B.thermosphacta)。據文獻報道,P.fragi具有脂酶和蛋白酶的活性,4 ℃條件下在肉、魚等食材表面形成帶有黏液的生物膜,在食物變質過程中可產生乙基己酸酯、乙基辛酸酯、乙基壬酸酯等揮發(fā)性有機物,在低溫條件下具有潛在的致腐特性和產異味特性[17-18];P.fluorescens可在食品中產生蛋白酶、脂酶導致食品腐敗,是水產品、蔬菜、肉制品、乳制品的優(yōu)勢腐敗菌[18];S.sciuri廣泛在動物源食品中分布,具有脫羧酶活性,可產生生物胺,從而導致食品腐敗[11];B.thermosphacta可在低溫有氧條件下生長并使食物產生綠色腐敗液、代謝惡臭終產物(乙偶姻等)致使食物變質,在低溫條件下具有潛在的致腐特性和產異味特性[11]。具有產異味性的關鍵細菌應重點關注奧斯陸莫拉氏菌(M.osloensis)與M.luteus。據報道,M.osloensis是人類生活環(huán)境中常見的產異味細菌,部分菌株可能代謝惡臭終產物4-甲基-3-己烯酸,具有潛在的產異味特性[19];M.luteus廣泛來源于哺乳動物皮膚和環(huán)境中,可以通過賴氨酸脫羧酶代謝尸胺,具有潛在產異味特性[12]。參考《人間傳染病目錄》報道條件致病菌,本研究重點關注的三級條件致病菌有蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、成團泛菌(P.agglomerans)、淺綠氣球菌(A.viridans)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)。其中,B.cereus的部分菌株能夠引起腹痛和腹瀉、急性惡心和嘔吐2種典型癥狀[20],可來源于肉類、菜類、醬料(香草),也是冰箱中廣泛報道的菌株;P.agglomerans的部分菌株可引起人體產生菌血癥[20];A.viridans的部分菌株可引起心內膜炎、尿路感染等癥狀產生[11];S.saprophyticus的部分菌株可引起女性泌尿系統(tǒng)感染[11]。而文獻中廣泛關注的條件致病菌L.monocytogenes、小腸結腸炎耶氏菌(Y.enterocolitica)、大腸桿菌(E.coliO157)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和沙門氏菌(Salmonella)并未在本研究中分離得到。

表3 冰箱使用過程中關鍵細菌的特性及分離情況Table 3 Characteristics and isolation of key bacteria in tested domestic refrigerators

綜上,本研究基于可培養(yǎng)技術,探究不同地域和電冰箱不同采樣位置的微生物的細菌多樣性。從5個城市15個冰箱樣品中共分離獲得63個屬155種459株細菌。其中,5個城市共有細菌為芽胞桿菌屬(Bacillus),7臺冰箱可接觸表面的共有細菌為芽胞桿菌屬(Bacillus),9臺冰箱中空氣的共有細菌為微球菌屬(Micrococcus)。重點關注普遍存在且具有潛在條件致病性、致腐特性和產異味特性菌株,確定芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、索絲菌屬(Brochothrix)、莫拉氏菌屬(Moraxella)和微球菌屬(Micrococcus)為中國家用冰箱中的關鍵細菌,在后續(xù)針對冰箱抗菌除菌技術的優(yōu)化升級中,應重點關注針對這些關鍵細菌的科學控制,以期推動實現(xiàn)家庭環(huán)境微生態(tài)健康。