基于非靶向代謝組學(xué)分析谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)外源蛋白代謝差異

黃丹妮,鄒宇,劉秀霞,2,3,楊艷坤,2,3,白仲虎,2,3*

1(江南大學(xué),江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是高GC含量的革蘭氏陽性菌,由于其無內(nèi)毒素,胞外蛋白酶活性低以及有完善的分泌系統(tǒng)可用于分泌生產(chǎn)重組醫(yī)藥蛋白,被認(rèn)為是很有潛力的外源蛋白表達(dá)宿主。目前,為提高外源蛋白表達(dá)產(chǎn)量,主要從表達(dá)元件、宿主細(xì)胞以及發(fā)酵過程等方面開展C.glutamicum蛋白表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化[1],并取得了一定的進(jìn)展。例如,表達(dá)元件方面開發(fā)的雙順反子表達(dá)結(jié)構(gòu)[2]和3A(three assembly)元件庫[3],基于蛋白酶敲除和常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)技術(shù)[4]獲得的高效蛋白分泌菌株以及以O(shè)mlA抗原為模式蛋白開發(fā)的高通量菌株篩選和發(fā)酵流程[5]。

盡管取得了以上成果,但依然存在外源蛋白分泌表達(dá)過高造成宿主細(xì)胞生長代謝負(fù)擔(dān),進(jìn)而影響蛋白產(chǎn)量的問題。已有研究表明,外源蛋白合成和運(yùn)輸?shù)拿恳贿^程都需要能量驅(qū)動[6],比如肽鏈延伸、氨酰-tRNA合成、外源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等。合成人生長激素(human growth hormone, hGH)每單位需要消耗267個單位ATP及420個單位的NADPH[7]。輔因子工程與傳統(tǒng)代謝工程和合成生物學(xué)策略相結(jié)合,通過控制ATP水解降低其總量,提高糖酵解的通量到野生型通量的1.7倍[8],有效增加了目的代謝物產(chǎn)量及微生物細(xì)胞工廠的效率。NAD+激酶基因ppnk和NADH激酶基因pos5的共表達(dá)顯著改善了NADPH的供應(yīng),這種NADPH再生策略簡單有效,不伴有碳損失,可用于生產(chǎn)需要NADPH消耗的其他天然產(chǎn)物[9]從而提高產(chǎn)量。同時,氨基酸是直接參與蛋白質(zhì)翻譯的特殊代謝物,外源蛋白高表達(dá)對菌體內(nèi)氨基酸量提出新的要求。過量生產(chǎn)氨基酸的菌株和外源添加氨基酸都由于能提供足夠的相應(yīng)氨基酸,加速了報(bào)告蛋白的翻譯[10]。氨基酸需求增長導(dǎo)致各類氨基酸合成代謝活躍,氨基酸基礎(chǔ)代謝途徑產(chǎn)物如乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)反作用于生長代謝,從而組成復(fù)雜的蛋白表達(dá)和能量代謝系統(tǒng)。因此從代謝水平解析外源蛋白分泌表達(dá)過程中的關(guān)鍵代謝物及代謝網(wǎng)絡(luò),有助于挖掘宿主細(xì)胞改造的靶點(diǎn)進(jìn)而優(yōu)化宿主細(xì)胞提高目的蛋白產(chǎn)量。

本文以C.glutamicumCGMCC1.15647菌株為研究對象,以來源于駱駝血清的抗體重鏈可變區(qū)(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody, VHH)為模式蛋白[11],通過非靶向代謝組學(xué)檢測培養(yǎng)液上清的代謝產(chǎn)物的差異,并結(jié)合生物信息學(xué)分析,從代謝水平上對C.glutamicumCGMCC1.15647株分泌外源蛋白過程中的關(guān)鍵代謝物及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析,為后續(xù)改造C.glutamicum菌株提高其外源蛋白表達(dá)產(chǎn)量提供重要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

本文使用C.glutamicumBZH001菌株,中國普通微生物菌種保藏管理中心,保藏號為CGMCC 1.15647,在本實(shí)驗(yàn)室保藏。所用培養(yǎng)基種類及配方見表1。

表1 培養(yǎng)基種類及配方Table 1 Type and formula of culture medium

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish UHPLC超高效液相、Q ExactiveTMHF-X高分辨質(zhì)譜,Thermo Fisher(USA)公司。其余儀器與設(shè)備見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034392)。

附表1 設(shè)備與儀器Table S1 Testing devices and instruments

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

使用引物對VHH_F/VHH_R,以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒擴(kuò)增基因VHH[4],用plasmid_F/plasmid_R引物對使pXMJ19-control質(zhì)粒線性化并在兩端添加20 bp同源序列,使用同源重組連接插入基因片段,得到質(zhì)粒pXMJ19-Ptac-0949-VHH。

將pXMJ19-control和pXMJ19-Ptac-0949-VHH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌BZH001中。平板上隨機(jī)挑選3個菌落PCR驗(yàn)證為陽性的克隆,接種至LBB種子培養(yǎng)基于30 ℃,220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日以初始OD600=0.2轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基LBB中,培養(yǎng)2 h時添加1 mmol/L異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)VHH蛋白分泌表達(dá)。培養(yǎng)5 h后取樣并進(jìn)行檢測。

1.3.2 蛋白表達(dá)及驗(yàn)證

取培養(yǎng)5 h后的BZH001和VHH菌液,12 000 r/min離心1 min,吸取80 μL上清液,加入5×loading buffer,沸水煮10 min。使用翌圣15%預(yù)制膠,10 μL上樣,90 V,15 min;120 V,45 min。加熱5 min使用考馬斯亮藍(lán)對蛋白膠進(jìn)行染色,脫色液加熱15 min,重復(fù)3次,直至底色從藍(lán)色變?yōu)橥该鳌?/p>

1.3.3 樣品制備

胞外代謝物收集要求菌處于對數(shù)生長期,選取培養(yǎng)5 h的菌液快速從培養(yǎng)瓶中取出一定量的培養(yǎng)液,4 ℃條件下離心(1 000×g,10 min)。移取上清液500 μL至新的離心管中,迅速放入液氮中淬滅30 s;淬滅后放入-80 ℃中保存。共取3份樣品以滿足后續(xù)檢測需要及運(yùn)輸損耗。

1.3.4 代謝物提取

取1 mL樣本于凍干機(jī)中凍干,加入100 μL的80%甲醇/水溶液;渦旋振蕩均勻后在冰水混合物中靜置5 min;在低溫高速離心機(jī)中保持4 ℃,15 000×g轉(zhuǎn)速離心15 min;使用LC-MS級別的水稀釋上清液至甲醇含量為53%;以15 000×g轉(zhuǎn)速在離心機(jī)中4 ℃離心15 min,吸取上清液,進(jìn)樣LC-MS進(jìn)行分析。

質(zhì)控(quality control, QC)樣本:從每個實(shí)驗(yàn)樣本中取等體積樣本混勻作為QC樣本,檢測時利用QC樣本進(jìn)行質(zhì)控,本文中所有原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制均基于QC樣本進(jìn)行。

1.3.5 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件:搭載Hypesil Gold column(C18)色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)。正離子電離模式:流動相A:0.1%甲酸;流動相B:甲醇。負(fù)離子電離模式:流動相A:5 mmol/L醋酸銨,pH 9.0,流動相B:甲醇。洗脫條件:0～1.5 min,2% B;1.5～3 min,85% B;3～10 min,100% B;10～10.1 min,2% B;10.1～12.0 min,2% B;流速0.2 mL/min,柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件:掃描范圍選擇m/z為100～1 500;ESI源的設(shè)置如下:噴霧電壓3.5 kV;鞘氣流速35 arb;輔助氣流速10 arb;離子傳輸管溫度320 ℃;離子導(dǎo)入射頻電平(S-lens RF level)60;輔助氣加熱器溫度350 ℃;極性:positive,negative;MS/MS二級掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描(datadependent scans)。

1.3.6 差異代謝物分析

采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)模型對G1和G2組進(jìn)行區(qū)分以展示其組間代謝總體差異特性。其中以變量投影重要性(variable importance projection, VIP)>1,P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對代謝物進(jìn)行篩選并將符合標(biāo)準(zhǔn)的代謝物認(rèn)為是表達(dá)顯著差異的代謝物,可能是潛在的生物標(biāo)志物。將差異代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jpkeggpathway.html/)中的谷氨酸棒桿菌數(shù)據(jù)庫(Select prefix:cgl,cgm)進(jìn)行代謝通路注釋,獲得差異代謝物參與的通路。使用R軟件包ggplot2(Version 4.2.1)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)和可視化,MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫(https://www.metaboanalyst.ca)和Omicshare(https://www.omicshare.com/)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品制備

谷氨酸棒桿菌重組菌株構(gòu)建及其外源蛋白表達(dá)驗(yàn)證如下。將pXMJ19-control和pXMJ19-Ptac-0949-VHH質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入C.glutamicum,并命名為G1和G2,對其進(jìn)行生長曲線測定,以探究表達(dá)外源蛋白對C.glutamicum生長的影響。由圖1-a可知,2組均在發(fā)酵4 h進(jìn)入對數(shù)生長期,10 h進(jìn)入穩(wěn)定期;發(fā)酵2 h后添加了IPTG誘導(dǎo)VHH表達(dá),G2組OD600值略低于G1說明表達(dá)外源蛋白對菌株生長有輕微影響,但總體趨勢與對照組一致且穩(wěn)定期菌體密度差異小。培養(yǎng)5、6、7 h的G2組如圖1-b中7～9條帶所示,結(jié)合生長曲線認(rèn)為5 h處于對數(shù)生長期并已有蛋白分泌故選擇5 h 作為合適的取樣時間。選取發(fā)酵5 h的菌液上清作為分析樣品,與對照組G1(圖1-b,條帶1)相比G2組在15 kDa處有明顯條帶(圖1-b,條帶2～6)。

a-G1和G2的4 h生長曲線;b-菌液上清SDS-PAGE驗(yàn)證(M-三色預(yù)染Marker;條帶1-攜帶pXMJ19-control的G1的發(fā)酵5 h的上清液;條帶2～6-攜帶pXMJ19-Ptac-0949-VHH的G2發(fā)酵5 h的上清液;條帶7～8-G2發(fā)酵5 、6 、7 h的取樣上清液)圖1 生長曲線和外源蛋白表達(dá)驗(yàn)證Fig.1 Growth curves and validation of exogenous protein expression

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果分析

2.2.1 差異代謝物分析

采用非靶向代謝組學(xué)手段,鑒定G1和G2兩組發(fā)酵液中代謝物并分析其變化規(guī)律。對代謝組結(jié)果進(jìn)行可視化處理,結(jié)果顯示如圖2-a和圖2-c所示,組間PCA分離明顯,R2X均>0.5(附表2,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034392)判斷組內(nèi)樣本聚集良好。對2組代謝物進(jìn)行了OPLS-DA分析,結(jié)果顯示R2X>0.5,R2Y和Q2值均接近于1(附表2),表明模型愈為穩(wěn)定可信性高。進(jìn)一步采用置換檢驗(yàn)來驗(yàn)證模型的預(yù)測能力和魯棒性,經(jīng)過200次排列,正負(fù)離子電離模式下R2Y和Q2建模值與真實(shí)值組成的回歸線截距分別如圖2-b、圖2-d所示。R2在正負(fù)離子中分別為0.936和0.699,Q2回歸線截距在正負(fù)離子中分別為-0.15和-0.417,表明OPLS-DA模型擬合處于正常狀態(tài),后續(xù)分析的數(shù)據(jù)可靠、結(jié)果可信。

附表2 PCA和OPLS-DA模型參數(shù)Table S2 PCA and OPLS-DA model parameters

a-正離子電離模式下PCA得分散點(diǎn)圖;b-正離子電離模式下OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果;c-負(fù)離子電離模式下PCA得分散點(diǎn)圖;d-負(fù)離子電離模式下OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果圖2 正離子和負(fù)離子電離模式下G1和G2的PCA模型和置換檢驗(yàn)。Fig.2 PCA model and permutation test results of G1 and G2

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 2 Primes used in this study

2.2.2 差異代謝物篩選

在正負(fù)離子電離模式下,共檢測到933個代謝物,其中正離子631個,負(fù)離子302個。根據(jù)t檢驗(yàn)得到的P值、OPLS-DA模型計(jì)算出的VIP值和代謝物濃度倍數(shù)值(fold change, FC),繪制火山圖以展示代謝物豐度差異(圖3)。以VIP>1和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出BZH001菌株中分泌表達(dá)VHH蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生差異濃度的代謝物,共176個代謝物,其中正離子100個,負(fù)離子76個。

a-正離子下代謝物火山圖;b-負(fù)離子下代謝物火山圖圖3 正離子和負(fù)離子電離模式下G1和G2的代謝物篩選火山圖Fig.3 Volcano plots of screening metabolites

取代謝物豐度log轉(zhuǎn)化值并繪制差異代謝物聚類熱圖,可以直觀地看出各差異代謝物相對濃度的變化。如圖4所示,差異代謝物2組樣本中可明顯區(qū)分,說明分泌表達(dá)外源蛋白導(dǎo)致菌株代謝發(fā)生了顯著變化。分泌表達(dá)外源蛋白VHH導(dǎo)致其中79個代謝物在VHH組中顯著增加,其中正離子電離模式72個,負(fù)離子電離模式7個;97個代謝物顯著降低,其中正離子電離模式28個,負(fù)離子電離模式69個。

a-正離子電離模式;b-負(fù)離子電離模式圖4 正、負(fù)離子電離模式下G1和G2的差異代謝物聚類熱圖Fig.4 Heat map visualization of differential metabolites

|log2(FC)|值越大,說明谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)液上清中的代謝物濃度變化越大。因此選取|log2(FC)|排序前25的差異代謝物構(gòu)建代謝物差異倍數(shù)條形圖(附圖1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034392),其中17個代謝物顯著下降,僅8個代謝物上升,D-mannose 6-phosphate和5′-S-methyl-5′-thioadenosine分別為濃度下降和上升中最顯著的代謝物。

附圖1 代謝物差異倍數(shù)條形圖Fig.S1 Differential metabolites fold change bar chart

2.2.3 差異代謝物KEGG通路富集分析

以篩選得出的176種差異性代謝物為對象通過MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析,匹配KEGG的數(shù)據(jù)庫獲得代謝物參與的通路信息(圖5-a)。97個下調(diào)代謝物中,34個富集到了KEGG代謝途徑,上調(diào)共79個代謝物有18個富集到了KEGG代謝途徑。KEGG通路富集表明分泌表達(dá)外源蛋白引發(fā)了代謝紊亂,特別是新陳代謝途徑(metabolic pathways)和氨基酸代謝途徑(amino acid metabolism pathways)受到影響最大,分別有39個和21個代謝物發(fā)生了顯著性變化,這些代謝通路可能在谷氨酸棒桿菌表達(dá)外源蛋白的研究中有重要意義。

a-差異代謝物KEGG富集通路圖;b-顯著差異代謝物代謝通路分析圖5 差異代謝物通路分析Fig.5 Differential metabolite pathway analysis

對|log2(FC)|數(shù)值最大的5個顯著差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析,除了對新陳代謝途徑產(chǎn)生的影響,其余主要涉及代謝通路均在表3中顯示,5個顯著差異代謝物共涉及11個代謝途徑包括碳水化合物代謝、聚糖的生物合成和代謝、核苷酸代謝及跨膜運(yùn)輸?shù)取?/p>

表3 部分顯著差異代謝物Table 3 Top5 differentially expressed metabolites in BZH001and VHH

獲得不同途徑代謝物通路的匹配信息后,根據(jù)相應(yīng)的通路數(shù)據(jù)庫對系統(tǒng)進(jìn)行檢索分析和代謝產(chǎn)物通路的富集分析(圖5-b),富集因子(rich factor)和對應(yīng)途徑的富集程度呈正相關(guān)。P值越小,富集因子越大,表明對該通路的影響越強(qiáng)。通路富集分析的前5名分別是色氨酸代謝、甲烷代謝、雙組分系統(tǒng)、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成及酪氨酸代謝(附表3,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034392),說明分泌表達(dá)外源蛋白導(dǎo)致芳香族氨基酸代謝在菌株中發(fā)生顯著變化。

3 討論

本研究采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對分泌表達(dá)外源蛋白VHH的C.glutamicumBZH001(CGMCC1.15647)中代謝物進(jìn)行比對和篩選,獲得關(guān)鍵差異代謝物,研究分泌表達(dá)外源蛋白對BZH001菌株自身代謝的影響,為優(yōu)化其作為優(yōu)良的外源蛋白表達(dá)宿主提供理論依據(jù)。

依據(jù)VIP>1和P<0.05標(biāo)準(zhǔn),本次分析共篩選到176個差異代謝物,其中下調(diào)97個代謝物,上調(diào)79個代謝物。下調(diào)代謝物34個富集到了KEGG代謝途徑,上調(diào)代謝物中有18個富集到了KEGG代謝途徑。通過代謝通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的代謝物主要與氨基酸代謝、核苷酸代謝及碳代謝相關(guān)(附圖2,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034392)。

D-甘露糖-6-磷酸是變化最顯著的代謝物,為對照組的0.235倍,共參與谷氨酸棒桿菌中的5條代謝通路(表3)。在氨基糖和核苷酸糖代謝、O-抗原核苷酸糖生物合成途徑中,D-甘露糖-6-磷酸在磷酸甘露糖異構(gòu)酶催化的可逆作用下轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸,進(jìn)入糖酵解后為表達(dá)外源蛋白提供能量[12]。在果糖和甘露糖代謝中,Cgl0687、Cgl0746基因編碼的磷酸甘露糖變位酶(phosphomannomutase, PMM)催化變位反應(yīng),合成鳥苷二磷酸甘露糖的前提。鳥苷二磷酸甘露糖用于多萜醇磷酸甘露糖的合成,之后參與N-糖基化[13]。在革蘭氏陰性菌空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)已證明N-糖基化途徑影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)和抗菌素耐藥性等。分泌表達(dá)外源蛋白可能需要促進(jìn)N-糖基化從而穩(wěn)定胞內(nèi)蛋白質(zhì)同時構(gòu)建適合轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

葉酸作為顯著差異排名前五的代謝物,其含量下降超70%,主要參與葉酸一碳庫(one carbon pool by folate)和葉酸合成(folate biosynthesis)途徑。進(jìn)入機(jī)體的葉酸在經(jīng)Cgl0848基因編碼的二氫葉酸還原酶(EC:1.5.1.3)作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槎淙~酸,再經(jīng)該酶轉(zhuǎn)化為5,6,7,8-四氫葉酸(5,6,7,8-tetrahydrofolate, THF)。THF是活躍的可以傳遞一碳基團(tuán)的必需輔酶,參與例如甲烷代謝、氨酰tRNA生物合成等生物體內(nèi)的各種反應(yīng)。通過map00679分析,在C.glutamicum中THF可多路徑間接或直接轉(zhuǎn)化為5,10-亞甲基四氫葉酸,并多數(shù)為可逆反應(yīng)以保障體內(nèi)葉酸庫的穩(wěn)定。

附圖2 差異代謝物代謝網(wǎng)絡(luò)分析Fig.S2 metabolic network analysis of differential metabolites

肌苷和GDP均參與嘌呤代謝途徑。肌苷減少為對照組的0.32,首先在產(chǎn)生路徑中次黃嘌呤核苷酸(inosinemonphosphate, IMP)減少向肌苷轉(zhuǎn)化并且轉(zhuǎn)向AMP,更易轉(zhuǎn)為ATP為菌株提供能量。其次,肌苷增加向次黃嘌呤的消耗,經(jīng)Cgl2697基因所編碼的酶被催化為IMP,最終促進(jìn)腺苷的生成。GDP涌向dGTP方向,用于DNA合成,同時轉(zhuǎn)化為GMP釋放高能磷酸基團(tuán)和能量,供菌株使用。

5′-S-甲基-5′-硫代腺苷在G2組中上升至3.6倍。在由Cgl1603編碼的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化下,甲硫氨酸獲得來自ATP的能量形成擁有高能甲硫鍵的S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM),再經(jīng)亞精胺合成酶(Cgl2702)轉(zhuǎn)化為5′-S-甲基-5′-硫代腺苷。分析認(rèn)為甲硫氨酸合成酶催化同型半胱氨酸(L-homocysteine, Hcy),在5-甲基四氫葉酸提供甲基條件下,可形成甲硫氨酸用于菌株代謝和滿足蛋白表達(dá)需要。結(jié)合葉酸含量顯著降低,大量甲硫氨酸合成,由于總量上升導(dǎo)致甲硫氨酸降解途徑加劇從而積累5′-S-甲基-5′-硫代腺苷[14]。

富集顯著性分析中多條氨基酸相關(guān)路徑得分靠前,說明外源表達(dá)分泌蛋白不僅影響C.glutamicumBZH001能量代謝還與氨基酸合成、利用緊密相關(guān)。其中最主要的是芳香族氨基酸的代謝[15],包括色氨酸代謝、酪氨酸代謝及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成[16]。

在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑中,分支酸處流向色氨酸途徑或被催化生成預(yù)苯酸,后者作為前體參與L-苯丙氨酸及L-酪氨酸的合成。有研究表明表達(dá)異源蛋白可以使生物體內(nèi)產(chǎn)生D型氨基酸[17],G1和G2組中均有異源質(zhì)粒的導(dǎo)入,故可檢測到D-苯丙氨酸的存在。D-苯丙氨酸經(jīng)D-氨基酸脫氫酶氧化為苯丙酮酸,D-3-苯乳酸可逆轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸,苯丙酮酸作為前體經(jīng)組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)為L-苯丙氨酸。L-苯丙氨酸量增加60%有助于氨基酸累積[18-19],形成疏水區(qū)保護(hù)胞內(nèi)蛋白質(zhì)[20]從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境以抵抗表達(dá)外源蛋白造成的脅迫。

在色氨酸代謝中,L-色氨酸、2-氧代己二酸、5-羥色胺、5-羥基吲哚-3-乙酸4個代謝物下降,吲哚、L-5-羥基色氨酸和3-甲基吲哚3個代謝物顯著上升,說明色氨酸代謝途徑在分泌外源蛋白過程中發(fā)揮重要作用。其中L-色氨酸下降[21]影響細(xì)胞膜的通透性,從而加快物質(zhì)吸收及蛋白分泌。2-氧代己二酸(2-ketoadipic acid)與未表達(dá)外源蛋白菌株相比下調(diào)57%,從代謝通路map00380分析,此步驟所消耗的2-氧代己二酸明顯增多,經(jīng)過5步反應(yīng)生成乙酰輔酶A參與糖酵解進(jìn)而參與能量代謝。同時,三羧酸循環(huán)途徑中L-蘋果酸下調(diào),說明三羧酸循環(huán)活躍,為菌株提供更多能量。分泌表達(dá)外源蛋白導(dǎo)致BZH001菌株能量消耗大量增加,需要上調(diào)中心代謝以滿足菌株生長和生產(chǎn)的需要。

與核苷酸代謝相關(guān)的7個差異代謝物中,在嘧啶代謝相關(guān)3個差異代謝物中,L-二氫乳清酸(L-dihydroorotic acid)和甲基丙二酸(methylmalonate)均顯著下降。在嘧啶生物合成過程中有多種嘧啶環(huán)中間產(chǎn)物生成,L-二氫乳清酸作為最先生成的物質(zhì)在脫氫后轉(zhuǎn)化為乳清酸。通過路徑分析(map00240)其與精氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺代謝以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝相關(guān)[22],菌株大量表達(dá)外源蛋白時大量氨基酸流向蛋白合成路徑導(dǎo)致相關(guān)水解產(chǎn)物下降。在嘌呤代謝中,脫氧尿苷(2-deoxyuridine)兩倍上升,dUMP在5′-核苷酸酶和2′,3′-環(huán)腺苷酸-3′-磷酸二酯酶等酶簇催化下釋放磷酸基團(tuán)和能量,同時尿苷轉(zhuǎn)化為脫氧尿苷。在N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase, GlmU)作用下尿苷被催化成為尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine, UDP-GlcNAc),此物質(zhì)在革蘭氏陽性菌中有重要作用,主要涉及肽聚糖生物合成[23],肽聚糖是谷氨酸棒桿菌細(xì)胞壁的主要成分之一,推測蛋白分泌影響細(xì)胞壁的生物合成,改變肽聚糖層交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的孔隙進(jìn)而造成細(xì)胞壁通透性的變化。

綜上分析,分泌表達(dá)外源蛋白影響C.glutamicumBZH001的代謝,特別是能量的代謝通路和氨基酸的代謝通路。糖酵解和三羧酸循環(huán)加劇以提供能量滿足BZH001表達(dá)外源蛋白的需求以及脅迫下的自身生長。氨基酸代謝的改變在滿足提供外源蛋白合成原料之外還影響胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性和細(xì)胞壁合成,有利于外源蛋白的分泌。

4 結(jié)論

本研究代謝組分析結(jié)果表示,當(dāng)C.glutamicumBZH001分泌表達(dá)外源蛋白VHH時需要大量的能量同時吸引氨基酸前往合成路徑,具體表現(xiàn)為中心代謝加劇以滿足生產(chǎn)和生長的雙向要求,氨基酸大量流向蛋白合成方向?qū)е锣奏ごx中與氨基酸相關(guān)的代謝物顯著下調(diào)。C.glutamicumBZH001菌株通過調(diào)節(jié)體內(nèi)三羧酸循環(huán)、核苷酸代謝和氨基酸代謝等提高能量供給以應(yīng)對外源蛋白合成及分泌造成的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),利用其他組學(xué)聯(lián)合分析,理清關(guān)鍵性差異代謝物并進(jìn)行驗(yàn)證性研究,為后續(xù)改造BZH001菌株成為更好的外源蛋白表達(dá)宿主提供理論支持。