膿毒癥與中性粒細(xì)胞功能

楊雪媛 郝東

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，濱州 256600

膿毒癥被定義為宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，對(duì)膿毒癥的病理生理認(rèn)識(shí)有了顯著增加，但是目前除了抗感染和支持治療，尚無(wú)特效治療方法［1］。由于膿毒癥晚期免疫細(xì)胞大量損傷死亡，導(dǎo)致免疫功能缺損或抑制，最后因器官衰竭和感染死亡。中性粒細(xì)胞占人類所有白細(xì)胞的50%～70%，是最早到達(dá)感染部位的細(xì)胞，是抵御感染的第一道防線的重要組成部分。膿毒癥期間中性粒細(xì)胞的失調(diào)激活會(huì)影響其功能，包括遷移、吞噬、脫顆粒、活性氧和細(xì)胞因子的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）等［2］，所以評(píng)估膿毒癥如何影響中性粒細(xì)胞功能的病理生理有助于發(fā)現(xiàn)治療膿毒癥的新策略。

中性粒細(xì)胞遷移受損

1.骨髓中性細(xì)胞的釋放

生理狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和釋放都受到嚴(yán)格的控制，只有1%～2%被釋放到循環(huán)中［3］，中粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）刺激中性粒細(xì)胞的增殖、分化和活化。中性粒細(xì)胞的釋放受到半胱氨酸-X-半胱氨酸趨化因子（cysteine-X-cysteine chemokine，CXC趨化因子）及其受體的嚴(yán)格控制，其中CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）12與CXC趨化受體（CXC chemokine receptor type，CXCR）4型介導(dǎo)中性粒保留在骨髓中，CXCL1/2與CXCR2介導(dǎo)中性粒細(xì)胞從骨髓中釋放，但是膿毒癥時(shí)骨髓CXCL12的表達(dá)下調(diào)，而CXCL1的表達(dá)增加，促進(jìn)中性粒細(xì)胞從骨髓到外周循環(huán)的動(dòng)員［4］。若膿毒癥持續(xù)存在，循環(huán)中甚至可以出現(xiàn)中性粒細(xì)胞祖細(xì)胞，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞“骨髓衰竭”，患者免疫功能受損，加重組織和器官損傷。

2.變形性和黏附作用的改變

中性粒細(xì)胞變形性是遷移和滾動(dòng)的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮表達(dá)的E-選擇素和P-選擇素與中性粒細(xì)胞表達(dá)的L-選擇素相互作用，L-選擇素在中性粒細(xì)胞表面組成型表達(dá)并介導(dǎo)低親和力黏附作用，中性粒細(xì)胞也表達(dá)出相對(duì)高水平的β整合素，細(xì)菌產(chǎn)物等可以上調(diào)其表達(dá)來(lái)響應(yīng)炎癥［5-6］。膿毒癥時(shí)產(chǎn)生的細(xì)菌產(chǎn)物和促炎因子促進(jìn)L-選擇素的脫落并刺激中性粒細(xì)胞表面β整合素的表達(dá)，β整合素和血管內(nèi)皮上的細(xì)胞間黏附分子-1和血管細(xì)胞黏附分子-1相互作用，介導(dǎo)與內(nèi)皮細(xì)胞的高親和力黏附作用［4，7］。膿毒癥時(shí)促炎介質(zhì)如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α也可以通過(guò)刺激過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ（peroxidase proliferators activate receptor γ，PPAR-γ）介導(dǎo)f肌動(dòng)蛋白（細(xì)胞骨架的主要構(gòu)成成分）累積，降低細(xì)胞的變形性［8］。由于變形性的降低和高親和力的黏附作用，中性粒細(xì)胞被阻隔在毛細(xì)血管床中導(dǎo)致血管閉塞加重，加劇組織缺血和器官功能障礙。

3.跨內(nèi)皮遷移

甲酰甲硫?；?亮?；?苯丙氨酸（formylmethanesulfoyl-leucoyl-phenylalanine，fMLP）、血小板活化因子C5a、白三烯B4、白細(xì)胞介素（IL）8等與中性粒細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體結(jié)合介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的定向遷移或趨化［3，9］。大多數(shù)趨化因子屬于CC和CXC趨化因子亞家族，中性粒細(xì)胞表達(dá)CXCR1和CXCR2并對(duì)CXC趨化因子反應(yīng)［10］。一些研究表明，膿毒癥期間中性粒細(xì)胞遷移受損與循環(huán)中性粒細(xì)胞CXCR2表達(dá)下降有關(guān)，趨化因子長(zhǎng)期或反復(fù)刺激配體激活G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR），將GPCR激酶（G protein-coupled receptor kinase，GRK）募集到細(xì)胞膜上，隨后GPCR C末端的GRK磷酸化導(dǎo)致趨化因子以β-逮捕素和網(wǎng)格蛋白依賴性方式脫敏［11-12］。脂多糖（LPS）、磷壁酸和Toll樣受體（TLR）2、4、9上調(diào)CRK2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)CXCR2的內(nèi)化［3，12］。一氧化氮（NO）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可以導(dǎo)致中性粒細(xì)胞遷移受損。膿毒癥時(shí)NO的增加會(huì)觸發(fā)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的活化、蛋白激酶G磷酸化和環(huán)磷酸鳥苷形成，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞GRK2的表達(dá)，促進(jìn)CXCR2的內(nèi)化［3］。磷酸肌醇3-激酶γ（phosphoinositide 3-kinase gamma，PI3Kγ）信號(hào)通路被認(rèn)為參與iNOS的二聚，Martin等［13］的實(shí)驗(yàn)證明膿毒癥PI3Kγ-/-存活小鼠的CXCR2表達(dá)增加，GRK2表達(dá)降低，體外結(jié)果還證實(shí)，與CXCL2一起孵育的PI3Kγ-/-中性粒細(xì)胞顯示CXCR2的內(nèi)化降低，由此可見(jiàn)PI3K負(fù)調(diào)控CXCR2內(nèi)化。中性粒細(xì)胞可以表達(dá)PPAR-γ，Reddy等［14］的研究證明PPAR-γ在中性粒細(xì)胞遷移中通過(guò)下調(diào)fMLP誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1/2（extracellular signal-regulated kinase-1/2，ERK-1/2）絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活起到負(fù)調(diào)控作用。

細(xì)胞內(nèi)抗菌性

LPS、脂蛋白、脂磷壁酸等均可以通過(guò)病原體相關(guān)分子模式與中性粒細(xì)胞上的TLR相互作用，識(shí)別并吞噬病原體，然后在吞噬溶酶體中將其消滅。中性細(xì)胞的抗菌活性主要有2個(gè)來(lái)源：（1）氧依賴途徑。還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生超氧自由基以及其他次級(jí)衍生的活性氧。中性粒細(xì)胞受到刺激后，在吞噬體膜上組裝完成NADPH，活性氧酶復(fù)合物將電子從NADPH上跨膜輸送到電子受體分子氧，產(chǎn)生超氧離子和活性氧，在吞噬體中代謝為高度殺菌的最終產(chǎn)物，例如羥基自由基、過(guò)氧化氫和次氯酸等［15］?；钚匝蹩梢陨险{(diào)細(xì)胞因子及黏附分子的表達(dá)，該過(guò)程中，中性粒細(xì)胞耗氧量激增，可以達(dá)到正常值2～20倍，稱為呼吸爆發(fā)［16］。（2）非氧依賴途徑。主要是細(xì)胞內(nèi)脫顆粒，中性粒細(xì)胞有4種胞漿顆粒：嗜天青顆粒、特異性顆粒、三級(jí)顆粒和分泌囊泡，顆粒中富含蛋白質(zhì)，中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)顆粒與吞噬體融合以消滅病原體［17］。在膿毒癥時(shí)，炎癥持續(xù)存在過(guò)度激活中性粒細(xì)胞生成大量活性氧，呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的大量自由基損害線粒體功能，導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡，對(duì)全身血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損害。

NETs

中性粒細(xì)胞也可以釋放NETs來(lái)消滅病原體的DNA和抗菌蛋白網(wǎng)［18］。NET由中性粒細(xì)胞主動(dòng)排出DNA、染色質(zhì)和顆粒蛋白形成的原纖維組成，含有來(lái)自嗜氮顆粒的蛋白酶，例如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶和組織蛋白酶G；來(lái)自二級(jí)顆粒和三級(jí)顆粒的蛋白質(zhì)，例如乳鐵蛋白和明膠酶以及核蛋白［19］。NETosis是一種導(dǎo)致中性粒細(xì)胞NETs主動(dòng)釋放的細(xì)胞死亡方式，這種形式的細(xì)胞死亡依賴于NADPH氧化酶復(fù)合物，可通過(guò)蛋白激酶C方式誘發(fā)［20］。但Yipp等［21］研究數(shù)據(jù)表明，NETosis形成不一定導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡。目前認(rèn)為，NETosis有2種形式：（1）自殺性NETosis（suicidal NETosis）。細(xì)胞被裂解，脫縮的染色質(zhì)參與構(gòu)成的NETs被釋放。（2）存活的NETosis（vital NETosis）。含有核DNA的囊泡通過(guò)出芽的方式釋放NETs，細(xì)胞仍保持著完整性并具有正常的功能［20］。NETs能捕獲微生物、限制微生物生長(zhǎng)和抑制其散播，但膿毒癥期間過(guò)度的NETosis誘導(dǎo)組織損傷及血栓形成［22］。NETs成分都被發(fā)現(xiàn)有促凝血的活性，如游離DNA可以激活內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，組蛋白可以通過(guò)血小板TLR2和TLR4相互作用直接誘導(dǎo)血小板聚集、誘導(dǎo)凝血酶的產(chǎn)生以及抑制抗凝血途徑［23-24］。NETs黏附在血管內(nèi)皮，以組蛋白和髓過(guò)氧化物酶依賴性的方式導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和器官損害，此外，組蛋白可以與損傷相關(guān)分子模式相互作用，通過(guò)髓系分化初級(jí)反應(yīng)基因88信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)促炎因子的產(chǎn)生［3］。在膿毒癥時(shí)，體內(nèi)各部位的中性粒細(xì)胞都可以產(chǎn)生NET，組蛋白的釋放導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞空泡化，導(dǎo)致肺泡內(nèi)出血和其他組織損傷。

中性粒細(xì)胞死亡失調(diào)

1.凋亡

凋亡細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬以限制炎性反應(yīng)，目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡有2條途徑：（1）外在途徑。由TNF家族的細(xì)胞外死亡配體信號(hào)與特定細(xì)胞表面的TNF受體相互作用介導(dǎo)的；（2）內(nèi)在途徑。細(xì)胞受到刺激，線粒體內(nèi)部細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活半胱天冬酶形成凋亡體切割DNA和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白［25］。中性粒細(xì)胞表達(dá)的髓系細(xì)胞白血病-1因子（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）、B細(xì)胞淋巴瘤因子（B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xL），膜聯(lián)蛋白A1，Bak均是Bcl-2家族抗凋亡因子，從膿毒癥患者分離的中性粒細(xì)胞檢測(cè)到MCL-1水平升高，MCL-1的累積可防止線粒體內(nèi)膜釋放細(xì)胞色素c以及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子。因此，MCL-1是通過(guò)保護(hù)線粒體跨膜點(diǎn)位來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)在凋亡途徑的［25-26］。在膿毒癥期間，外周循環(huán)中LPS和補(bǔ)體C5a等促炎介質(zhì)可以誘導(dǎo)ERK-1/2和磷酸肌醇-3激酶活化，進(jìn)一步誘導(dǎo)AKT磷酸化和隨后的Bad磷酸化，抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c，從而抑制凋亡體形成；LPS還可以使髓系核分化抗原的重新定位和切割受損，并防止MCL-1的蛋白酶體降解，從而致使中性粒細(xì)胞凋亡延遲［3］。Li等［27］的研究表明，膿毒癥中由糖酵解酶丙酮酸激酶M2介導(dǎo)中性粒細(xì)胞程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）上調(diào)來(lái)拮抗中性粒細(xì)胞凋亡，此外半胱天冬酶3、9的抑制以及CD24的下調(diào)均參與了細(xì)胞凋亡的抑制。中性粒細(xì)胞的累積有利于病原體的清除，但大量中性粒細(xì)胞長(zhǎng)期浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的組織損傷。

2.焦亡

焦亡是半胱天冬酶依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，目前認(rèn)為焦亡主要有2種途徑：（1）半胱天冬酶-1依賴性經(jīng)典途徑。細(xì)胞內(nèi)Nod樣受體家族識(shí)別病原體和其他的信號(hào)，例如炎性小體，通過(guò)銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）與半胱天冬酶-1原結(jié)合激活酪蛋白酶-1，被激活的半胱天冬酶-1切割促炎因子gasdermin D（GSDMD），GSDMD的N端和細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇結(jié)合形成“gasdermin通道”釋放內(nèi)容物誘導(dǎo)炎癥，活化的半胱天冬酶-1也可以切割前IL-1β和原IL-18轉(zhuǎn)換為IL-1β和IL-18誘導(dǎo)炎癥。（2）半胱天冬酶-4/5/11依賴性非經(jīng)典途徑。LPS的脂質(zhì)A可以直接與半胱天冬酶活化的N端結(jié)合，并結(jié)合半胱天冬酶4/5/11的募集結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)其寡聚化，被激活的半胱天冬酶4/5/11裂解GSDMD并誘導(dǎo)其焦亡，同時(shí)誘導(dǎo)半胱天冬酶-1裂解IL-1β和原IL-8轉(zhuǎn)換為IL-1β和IL-8［28-29］。中性粒細(xì)胞焦亡后，大部分受損的細(xì)胞器與細(xì)胞骨架和細(xì)胞殘?bào)w聯(lián)系在一起形成孔誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)陷阱，將細(xì)菌留在細(xì)胞殘?bào)w內(nèi)進(jìn)行二次吞噬殺傷或者募集中性粒細(xì)胞釋放活性氧進(jìn)行殺傷［30-31］。但是Chen等［32］的研究表明，中性粒細(xì)胞和經(jīng)典炎癥小體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白ASC中的半胱天冬酶-1低表達(dá)，GSDMD不能被有效切割，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞不依賴經(jīng)典途經(jīng)的局灶性死亡，但是該過(guò)程釋放IL-1β，會(huì)招募更多中性粒細(xì)胞。當(dāng)宿主被病原體感染時(shí)就會(huì)有焦亡發(fā)生，細(xì)胞膜破裂以及促炎因子的釋放阻斷病原體的復(fù)制并招募免疫細(xì)胞消滅病原體，但是過(guò)度的焦亡會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的促炎因子，引起失控的炎性反應(yīng)，加速膿毒癥的進(jìn)程。

3.自噬

自噬是由自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein，ATG）調(diào)控的自我降解的過(guò)程。自噬對(duì)中性粒細(xì)胞起雙向調(diào)節(jié)作用，其一，中性粒細(xì)胞自噬體形成后與溶酶體融合分解清除胞內(nèi)壞死物質(zhì)，維持中性粒細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下的生存；其二，自噬體也可以激活凋亡蛋白加速細(xì)胞死亡［33］。膿毒癥時(shí)可以有多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)誘導(dǎo)自噬，例如LPS與TLR4結(jié)合通過(guò)MAPK/p38信號(hào)軸激活自噬；LPS也可以通過(guò)影響核因子κB來(lái)激活自噬；而磷脂壁酸與TLR2結(jié)合通過(guò)MAPK1/ERK-2-MAPK3/ERK-1途徑誘導(dǎo)自噬［28，34］。由研究發(fā)現(xiàn)自噬和NET誘導(dǎo)與PI3K-AKT-mTOR軸相連，阻斷自噬體形成的PI3K Ⅲ型信號(hào)通路可以抑制NETs形成，敲除ATG5的基因會(huì)導(dǎo)致自噬缺陷，但不會(huì)導(dǎo)致NETs形成缺損，由此推斷自噬不是NETs形成的必要條件［25］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，LPS干預(yù)的自噬缺陷中性粒細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致其遷移抑制因子分泌增加并加重炎癥［35］。自噬是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的一部分，可以通過(guò)減少細(xì)胞因子的釋放控制炎癥，但是自噬紊亂會(huì)導(dǎo)致炎癥失控。

總結(jié)與展望

膿毒癥早期，中性粒細(xì)胞動(dòng)員增加并凋亡受損，導(dǎo)致其在循環(huán)中大量累積，到膿毒癥晚期，大量幼稚中性粒細(xì)胞釋放到循環(huán)中導(dǎo)致骨髓耗竭，且幼稚的細(xì)胞無(wú)法有效清除病原體，加之中性粒細(xì)胞遷移受損，致使無(wú)法有效控制感染。此外，中性粒細(xì)胞死亡失衡導(dǎo)致組織損傷和器官衰竭進(jìn)一步加重。在多種機(jī)制的共同作用下，膿毒癥患者免疫系統(tǒng)受到抑制，血栓形成增加甚至出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血。因此，探索中性粒細(xì)胞在膿毒癥中的功能的病理生理有助于找到治療的新靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥中髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCS）上調(diào)以及幼稚中性粒細(xì)胞增多會(huì)導(dǎo)致免疫抑制［36］。Wang等［37］研究表明，中性粒細(xì)胞上程序性死亡配體-1（PD-L1）表達(dá)增加加速細(xì)胞凋亡，以驅(qū)動(dòng)肺損傷并增加臨床和實(shí)驗(yàn)中敗血癥的病死率，所以抑制MDSCS的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞成熟及釋放以及抗PD-1/PD-L1抗體治療可以改善膿毒癥者預(yù)后。此外GM-CSF、G-CSF也開展了臨床試驗(yàn)，這些治療手段都已經(jīng)取得了不錯(cuò)的效果。

作者貢獻(xiàn)聲明楊雪媛：起草文章；郝東：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)