鞣花酸調(diào)控Nrf2和NLRP3通路影響TGF-β所致AML-12細胞EMT的作用

鄧旭坤，張?zhí)鹛?，劉靖，雷霄，王綽，舒廣文

（中南民族大學 藥學院 &民族藥學國家級實驗教學示范中心，武漢 430074）

轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是一組多功能的生長因子，是TGF-β 超基因家族中的一員［1］，在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、免疫反應和傷口愈合等方面具有關鍵作用，例如在骨骼疾病、纖維化和癌癥等疾病上［2］.有研究表明TGF-β能引起肝細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）［3］.EMT 指上皮細胞失去正常極性，細胞間緊密連接，細胞間骨架重排，上皮細胞松解、失去極性、變成排列松散的梭形細胞，獲得纖維原細胞或間質(zhì)細胞的過程［5］.近年來，EMT 被認為是肝纖維化的機制之一［4］.因此，尋找能緩解EMT 作用的藥物在肝纖維化的治療方面具有重要意義.

EA（ellagic acid，EA）是一種廣泛存在于石榴、樹莓、葡萄等水果中的天然多酚類化合物［6］.EA 可以通過改善氧化、炎癥等生化指標來治療丙烯酰胺引起的肝毒性［7］.EA 與順鉑聯(lián)合使用可顯著降低結腸癌小鼠肝臟過氧化損傷水平［8］.EA 還能夠通過抗氧化作用減輕鐵過載誘導的小鼠肝毒性［9］.以上研究結果顯示，EA 有很好的抗氧化及抗炎作用.另一方面有研究發(fā)現(xiàn)，EA 對CC14誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用［10］，對CC14誘導的小鼠肝纖維化的治療效果也十分明顯［11］.然而，EA 對小鼠肝細胞內(nèi)EMT 的影響目前還沒有報道.因此，此次研究以AML12 細胞為實驗對象，探究EA 對小鼠肝細胞EMT 作用的影響及其可能的機制，以期為EA 在肝纖維化治療方面的應用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AML-12 細胞（武漢普諾賽）；鞣花酸（純度≥98%）（湖北巨勝）；DMEM/F12 基礎培養(yǎng)基、胎牛血清（武漢普諾賽）；PBS緩沖液（塞維爾生物）；轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）（南京歐凱）；胰蛋白酶（美國賽默飛）；二甲基亞砜（DMSO）（湖北鑫紅利）；活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、Lamin B（核纖層蛋白B）和β-Actin（β-肌動蛋白）抗體（碧云天）；Nrf2、NQO-1、GCLM、HO-1、GCLC抗體（愛博泰克）.

倒置顯微鏡（CX27，上海蔡康）；細胞培養(yǎng)箱（MCO-15AC，日本三洋）；全自動酶標儀（MuLTISKAN，深圳菲特立）.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及給藥

AML-12 細胞由實驗室自傳代儲存.細胞貼壁生長在含有10%的胎牛血清、40 μg/mL 地塞米松、100 U/mL 青毒素、100 U/mL 鏈霉素、10 μg/mL 胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng).

EA 溶解于1%NaHCO3，配制成500 μmol/L 溶液作為母液備用，使用前加熱溶解，并稀釋成特定給藥濃度.

取正處于對數(shù)生長期的AML12細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長至70%時，除空白組外其余孔均加入TGF-β（5 ng/mL），TGF-β刺激24 h后，低劑量給藥組和高劑量給藥組分別加入EA 至終濃度為25 μmol/L和50 μmol/L，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h.

1.2.2 細胞活力檢測

取對數(shù)生長期的AML12細胞接種于96孔板中，每孔細胞密度為1×105個，至37 ℃培養(yǎng)箱24 h，待細胞貼壁完全，分別加入濃度為0、12.5、25、50 μmol/L EA溶液孵育48 h.培養(yǎng)結束后加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h.培養(yǎng)結束棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO后轉(zhuǎn)移至搖床上低速震蕩10 min.震蕩完畢使用酶標儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光度值.

1.2.3 活性氧檢測

培養(yǎng)細胞給藥24 h 后，棄原培養(yǎng)基，加入1 mL 10 μmol/L 的DCFH-DA 探針37 ℃溫育30 min，隨后除去探針，PBS 洗滌3 次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.4 細胞形態(tài)學觀察

細胞給藥培養(yǎng)滿24 h 后，在倒置顯微鏡下觀察AML-12細胞的形態(tài)并拍照記錄.

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測（Western blot）

細胞給藥24 h 后，棄原培養(yǎng)基，按說明書提取細胞總蛋白和核蛋白，并用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定所提取蛋白的蛋白濃度.以每泳道上樣20μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳.電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，并用5%脫脂奶粉室溫孵育1 h 進行封閉.封閉完全后孵育抗體，首先4 ℃孵育一抗過夜.次日回收一抗，TBST 洗滌三次后孵育二抗，二抗室溫孵育1 h 后TBST 洗滌三次，顯影.Image J 軟件統(tǒng)計蛋白條帶灰度值，以β-Actin作為內(nèi)參對照計算各目的蛋白的相對表達水平.

1.2.6 免疫熒光檢測

細胞給藥24 h 后，棄原培養(yǎng)基，加入免疫染色固定液固定20 min，按照說明書進行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.7 統(tǒng)計學分析

結果采用均值±標準差（Mean±SD）表示.統(tǒng)計學分析用SPSS19.0 作t檢驗分析，*P＜0.05 指示擁有顯著性差異，**P＜0.01指示擁有極顯著性差異.

2 結果與分析

2.1 EA對AML-12細胞活力的影響

MTT 法檢測結果表明（圖1），隨著EA 給藥濃度的增加，AML-12細胞活力基本不變.

圖1 EA對AML-12細胞活力的影響Fig.1 The effect of EA on the viability of AML-12 cells

2.2 EA對TGF-β誘導的AML-12細胞形態(tài)的影響

如圖2所示，空白組細胞呈大小均一、邊緣清晰的規(guī)則多角形，模型組細胞呈梭型和不規(guī)則三角形，EA 給藥濃度為25 μmol/L 時，AML-12 細胞部分恢復正常形態(tài)，成纖維化程度降低，EA 給藥濃度為50 μmol/L 時，AML-12 細胞絕大多數(shù)恢復正常形態(tài).當給予目前已知的緩解肝纖維化的藥物水飛薊素時［12］，細胞可恢復至與空白組細胞無異，而給予1%NaHCO3溶液時，細胞與模型組細胞相近，呈梭型 和不規(guī)則三角形.

圖2 EA、水飛薊素以及1%NaHCO3對TGF-β誘導AML-12細胞形態(tài)的影響（200×）Fig.2 Effect of EA on TGF-β-induced AML-12 cell morphology（200×）

2.3 EA 對TGF-β 誘導的AML-12 細胞EMT 標志蛋白的影響

E-cadherin 和Vimentin 為EMT 標志蛋白，能反映細胞纖維化程度.結果如圖3 所示，模型組和1%NaHCO3溶液給藥組E-cadherin 表達顯著減弱（P＜0.01），而EA 給藥組和水飛薊素給藥組有上升趨勢（P＜0.01）；模型組和1%NaHCO3溶液給藥組Vimentin 表達顯著增強（P＜0.01），而EA 給藥組和水飛薊素給藥組則有所減弱（P＜0.01）.

圖3 AML-12細胞內(nèi)EMT標志蛋白的表達水平Fig.3 The expression levels of EMT marker proteins in AML-12 cells

2.4 EA 對TGF-β 誘導的AML-12 細胞抗氧化能力的影響

EA 對TGF-β 誘導的AML-12 細胞產(chǎn)生ROS 的影響結果如圖4 所示，TGF-β 會使細胞內(nèi)ROS 增加，EA給藥會減少細胞內(nèi)ROS水平.

圖4 活性氧熒光染色圖（200×）Fig.4 Reactive oxygen fluorescence chart of reactive oxygen（200×）

2.5 EA 對TGF-β 誘導的AML-12 細胞抗氧化信號通路的影響

抗氧化信號通路與肝纖維化密切相關.Nrf2 及其下游抗氧化元件的表達結果如圖5 所示.結果表明，與空白組相比模型組的Nrf2 表達量明顯降低（P＜0.01），同時Nrf2 下游的HO-1、NQO-1、GCLM、GCLC 抗氧化因子的表達也降低（P＜0.01），EA 給藥后Nrf2以及其相關蛋白的表達上升（P＜0.01）.

圖5 AML-12細胞內(nèi)抗氧化通路主要蛋白表達水平Fig.5 Analysis of the expression levels of major proteins of the antioxidant pathway in AML-12 cells

2.6 EA 對TGF-β 誘導的AML-12 細胞NLRP3 信號通路的影響

炎癥信號通路與肝纖維化密切相關.NLRP3 炎癥通路相關蛋白的表達水平結果如圖6 所示，模型組NLRP3炎性小體組分和其下游IL-1β 蛋白的表達明顯高于空白組（P＜0.01），與模型組相比，EA 給藥組（P＜0.01）NLRP3、ASC、Caspase-1 和IL-1β 蛋白的表達水平顯著下調(diào).

圖6 AML-12細胞內(nèi)炎癥通路主要蛋白表達水平Fig.6 Analysis of the expression levels of major proteins of inflammatory pathways

3 討論

肝病是一類常見危害人類健康的疾?。?3］.近年來，由于生活方式的轉(zhuǎn)變，我國各類肝臟疾病的發(fā)病率逐年上升.肝纖維化是多種慢性肝病的病理過程，是多種慢性肝損傷疾病發(fā)展中的關鍵環(huán)節(jié)，早期有效的干預可發(fā)生逆轉(zhuǎn)，否則后期可發(fā)展為肝硬化、肝癌等［14］.因此，預防或者緩解肝纖維化在保肝護肝方面顯得尤為重要.

EA 是一種天然多酚二內(nèi)酯，為鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物，具有明顯的抗肝損傷、抗氧化、清除自由基、抑制細胞凋亡和抗腫瘤等作用［15］.為探討EA在體外對肝纖維化是否產(chǎn)生抑制作用，用EA 對TGF-β 誘導的AML-12 細胞產(chǎn)生的EMT 的影響來評估EA 在體外對小鼠肝纖維化的保護作用.結果顯示，在0～50μmol/L 的劑量濃度范圍內(nèi)，EA 自身對細胞的存活率基本沒有影響，表明在0～50 μmol/L 的劑量濃度范圍內(nèi)，EA 對AML-12 細胞沒有明顯的細胞毒性.在用TGF-β 對AML-12 細胞進行刺激后，細胞發(fā)生纖維化，形態(tài)由原本緊密排列的近圓形轉(zhuǎn)變成邊界模糊的不規(guī)則梭形，表明成功建立了AML-12 細胞的EMT 模型；EA 給藥可使TGF-β 刺激的AML-12 纖維樣細胞正?；?，表明EA 可以緩解AML-12 細胞的纖維化.通過蛋白免疫印跡法和免疫熒光檢測法發(fā)現(xiàn)，EA 給藥后TGF-β 所致的AML-12 細胞中EMT 相關標志蛋白E-cadherin 的表達水平顯著上調(diào)，Vimentin 表達顯著下調(diào)，這進一步表明EA可以抑制AML-12 細胞內(nèi)的EMT.TGF-β 會使細胞內(nèi)ROS 增加，EA 則能降低細胞內(nèi)ROS 水平.在關于通路的研究中，TGF-β 能使Nrf2 及下游抗氧化因子HO-1、NQO-1、GCLM、GCLC 的表達降低，同時使NLRP3 炎性小體組分和其下游IL-1β 的表達增強，而EA 給藥能上調(diào)Nrf2 以及其相關蛋白的表達同時下調(diào)NLRP3及其下游相關因子的表達.

TGF-β刺激小鼠肝細胞會造成細胞內(nèi)ROS的積累，而細胞內(nèi)ROS 過多則會促進EMT 的發(fā)生［16］.肝細胞中可以表達NLRP3 炎癥小體相關的蛋白［17］，而NLRP3 通路激活時則會促進肝臟發(fā)生纖維化，當肝臟出現(xiàn)炎癥時會增加促纖維化細胞因子和生長因子（TNF-α、TGF-β、CTGF）的表達，而IL-1β則能直接促進肝臟纖維化［18］.當細胞受到刺激，比如細胞內(nèi)ROS 積累過量時，NLRP3 相關通路可被激活，促進白細胞介素（IL-1β）的成熟，從而導致炎癥反應的發(fā)生［19-20］.激活Nrf2 信號通路，其下游轉(zhuǎn)錄因子可以通過一系列的基因表達來啟動細胞的抗氧化能力［21］，消除細胞內(nèi)ROS，從而抑制炎癥的發(fā)生，從而起到抑制肝臟纖維化的目的.有研究表明激活Nrf2 信號通路確實可以緩解肝臟纖維化［22-23］.

綜上所述，EA 能抑制TGF-β 誘導的AML-12 細胞內(nèi)EMT.進一步研究結果顯示，EA 能降低細胞內(nèi)ROS 水平，上調(diào)Nrf2 信號通路水平，抑制NLRP3 炎癥小體各組分的表達，降低細胞內(nèi)IL-1β 水平.實驗結果表明，EA 能抑制TGF-β 誘導的AML-12 細胞內(nèi)EMT，其機制可能與調(diào)控抗氧化及炎癥相關信號通路有關.