黃芪總皂苷對(duì)三氧化二砷誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

楊秀華 ，錢新宇，王玥璇，智慧，艾丹，肖云峰*

（1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，呼和浩特 010110；2 呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，呼倫貝爾 021000；3 包頭市第四醫(yī)院，包頭 014030）

三氧化二砷（ATO）俗稱砒霜，最初被用于治療銀屑病或結(jié)核病的輔助藥物［1-2］.隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其可用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病［3］，治愈率高達(dá)80%以上［4］.隨著對(duì)ATO的逐步研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)肺癌［5］、宮頸癌［6］、肝癌［7-8］等疾病也具有較好的治療作用，應(yīng)用前景良好.但在抗腫瘤時(shí)它對(duì)心、腦、腎等也會(huì)產(chǎn)生一定的毒性［9］.研究表明，ATO 通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)致使細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10-11］，故抑制細(xì)胞凋亡可能是減輕ATO 誘導(dǎo)心臟毒性的合理方法之一.黃芪總皂苷（ASTs）是中藥黃芪的成分之一，本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASTs可以激活PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮抗氧化作用［12］，但是它能否最終抑制細(xì)胞凋亡，是本文的研究重點(diǎn).現(xiàn)有研究顯示：ASTs 通過明顯降低Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2 表達(dá)來發(fā)揮對(duì)過氧化物誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用［13-14］.因此，本文擬通過觀察ASTs 對(duì)ATO 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞形態(tài)、凋亡率及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，探討ASTs對(duì)ATO所產(chǎn)生的心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，為ASTs進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與細(xì)胞

H9c2心肌細(xì)胞（上海富恒細(xì)胞庫(kù)）；黃芪總皂苷（南京狄爾格醫(yī)藥科技）；Bax 抗體、Bcl-2 抗體、Caspase-9抗體、β-actin抗體（英國(guó)abcam）；Caspase-3抗體（美國(guó)CST）；合成引物（上海生工）.

1.1.2 主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（3K15，美國(guó)Gene Company Limited）；熒光倒置生物顯微鏡（DM3000，德國(guó)Leica）；CO2培養(yǎng)箱（MCO-15AC，美國(guó)Thermo Fisher）；立式高壓蒸汽滅菌鍋（ES-315，日本TOMY）；電泳儀（Mini Trans-Blot，美國(guó)Bio-Rad）；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（ODYSSEY CLX，美國(guó)LI-COP）.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將H9c2 細(xì)胞接種于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約80%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2 檢測(cè)ATO對(duì)細(xì)胞活力的影響

將細(xì)胞密度調(diào)為1×104個(gè)/孔，接種于96 孔板，孵育36 h.空白組用無血清培基液處理，ATO 組分別用含有終濃度為1、2、4、6、8、10 μg·mL-1ATO 無血清培養(yǎng)12 h.取10 μL 的CCK-8 液添加至每孔中，孵育1 h，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率.

1.2.3 檢測(cè)ASTs對(duì)細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞分組前操作同1.2.2.空白組用無血清培養(yǎng)液處理，ASTs 預(yù)孵育組將含有終濃度為25、50、100 μg·mL-1ASTs 的無血清培養(yǎng)液作用12 h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，計(jì)算存活率.

1.2.4 檢測(cè)ASTs對(duì)ATO致H9c2細(xì)胞的損傷的影響

細(xì)胞分組前操作同1.2.2.空白組無血清孵育12 h 后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；模型組用培養(yǎng)基孵育12 h 后換用6 μg·mL-1ATO 的培養(yǎng)基孵育12 h；ASTs（低、中、高）濃度組分別加入25、50、100 μg·mL-1含ASTs的培養(yǎng)基孵育12 h后換用6 μg·mL-1ATO 的培養(yǎng)基孵育12 h.監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率.

1.2.5 Hoechst 33342染色觀察H9c2細(xì)胞凋亡形態(tài)

將細(xì)胞密度調(diào)為1×105個(gè)/孔，接種于24 孔板，孵育36 h.分組及培養(yǎng)時(shí)間同1.2.4.后續(xù)實(shí)驗(yàn)按說明書進(jìn)行，觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并進(jìn)行拍照.

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡率

將細(xì)胞密度調(diào)為2×106個(gè)/孔，接種于6 孔板，孵育36 h.分組及培養(yǎng)時(shí)間同1.2.4，0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心收集，后續(xù)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率.

1.2.7 RT-qPCR測(cè)定相關(guān)mRNA表達(dá)水平

將細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6 孔板中，孵育36 h.分組及培養(yǎng)時(shí)間同1.2.4，后續(xù)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)相關(guān)凋亡因子mRNA的表達(dá).引物序列見表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

將心肌細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6 孔孵育板中，孵育36 h.分組及培養(yǎng)時(shí)間同1.2.4，收集細(xì)胞，提蛋白，測(cè)定蛋白濃度.后續(xù)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，使用紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)相關(guān)凋亡因子蛋白表達(dá)水平.

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ATO對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響

用CCK-8 法檢測(cè)并計(jì)算不同濃度ATO 對(duì)H9c2細(xì)胞的存活率，結(jié)果見圖1.由圖1可知：與空白組比較，ATO 1～10 μg·mL-1組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）.

圖1 ATO對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響（n=6）Fig.1 Effect of ATO on the survival rate of cardiomyocytes（n=6）

2.2 ASTs對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響

用CCK-8 法檢測(cè)并計(jì)算不同濃度ASTs 對(duì)H9c2細(xì)胞的存活率，結(jié)果見圖2.由圖2 可知：與空白組比較，ASTs 各濃度組對(duì)H9c2 細(xì)胞存活率無明顯影響（P＞0.05），不會(huì)干擾對(duì)ATO 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

圖2 不同濃度ASTs對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響（n=6）Fig.2 Effects of different concentrations of ASTs on the survival rate of H9c2 cells（n=6）

2.3 ASTs 預(yù)孵育對(duì)ATO 致H9c2 細(xì)胞活力下降的影響

CCK-8 法檢測(cè)并計(jì)算各組別細(xì)胞的活力，結(jié)果見圖3.由圖3可知：與空白組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）.與模型組比較，ASTs 25、50、100μg·mL-1預(yù)孵育12 h可顯著提高細(xì)胞活力（P＜0.01），以高濃度組保護(hù)作用最佳.

圖3 ASTs對(duì)ATO誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)作用（n=6）Fig.3 Protective effect of ASTs on ATO-induced myocardial injury（n=6）

2.4 ASTs 預(yù)孵育對(duì)ATO 致H9c2 細(xì)胞損傷形態(tài)學(xué)影響

各組細(xì)胞處理后，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果見圖4.由圖4 可知：空白組H9c2 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好、數(shù)量多、均呈長(zhǎng)梭形；模型組細(xì)胞收縮成圓形，伴有大量細(xì)胞死亡；ASTs 各濃度組大部分細(xì)胞仍保持長(zhǎng)梭形形態(tài)，以高濃度組細(xì)胞形態(tài)最佳.

圖4 ASTs對(duì)ATO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)影響Fig.4 Morphological effects of ASTs on ATO-induced injury in H9c2 cells

2.5 ASTs對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

細(xì)胞處理后，觀察H9c2 細(xì)胞凋亡形態(tài)，結(jié)果見圖5.由圖5可知：空白組細(xì)胞熒光染色均勻，呈低藍(lán)色，形態(tài)大小均一，很少見凋亡細(xì)胞［圖5（a）］；模型組呈亮藍(lán)色，可見核固縮，凋亡細(xì)胞增多［圖5（b）］；與ATO模型組比較，ASTs低、中、高濃度組凋亡細(xì)胞比例顯著減少，正常細(xì)胞數(shù)目增多［圖5（c）-圖5（e）］.

圖5 ASTs對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響（10×10）Fig.5 Effects of ASTs on the apoptosis morphology of H9c2 cells（10×10）

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡率

將各組細(xì)胞處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，結(jié)果見圖6.由圖6可知；與空白組相比，模型組細(xì)胞凋亡細(xì)胞顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，ASTs 各組凋亡細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）.

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡率（n=3）Fig.6 H9c2 cell apoptosis rate detected by flow cytometry（n=3）

2.7 ASTs預(yù)孵育對(duì)相關(guān)mRNA表達(dá)水平的影響

將各組細(xì)胞處理后，用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)水平，結(jié)果見圖7.由圖7可知：與空白組比較，ATO 降低了Bcl-2mRNA 水平（P＜0.01），升高了Bax、Caspase-3、Caspase-9mRNA 水平（P＜0.01）；與模型組比較，ASTs升高了Bcl-2mRNA水平（P＜0.01），降低了BaxmRNA 水平（P＜0.05），ASTs中、高濃度組降低了Caspase-3、Caspase-9mRNA水平（P＜0.05）.

圖7 ASTs對(duì)心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響（n=3）Fig.7 Effect of ASTs on the expression of Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9 mRNA in cardiomyocytes（n=3）

2.8 ASTs預(yù)孵育對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將各組細(xì)胞處理后，用紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞的相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖8.由圖8 可知：與空白組比較，ATO降低Bcl-2/Bax水平（P＜0.01），升高Caspase-3、Caspase-9 水平（P＜0.01）；與模型組比較，ASTs中、高濃度升高Bcl-2/Bax水平（P＜0.01），降低Caspase-3、Caspase-9水平（P＜0.05）.

圖8 ASTs對(duì)H9c2細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響（n=3）Fig.8 Effects of ASTs on the expression of Bax，Bcl-2，Caspase-3 and Caspase-9 proteins in cardiomyocytes（n=3）

3 討論

ATO 發(fā)揮抗惡性腫瘤作用的主要機(jī)制是其能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但同時(shí)也是產(chǎn)生毒性反應(yīng)的主要原因之一［15］.本文發(fā)現(xiàn)：ATO 導(dǎo)致H9c2 心肌細(xì)胞活力下降，心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，這是藥物產(chǎn)生心臟毒性的重要病理機(jī)制之一，因此抑制心肌細(xì)胞凋亡是考察心臟保護(hù)藥物藥效的指標(biāo)之一.ASTs 預(yù)孵育能提高心肌細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡的比例，從而降低 ATO 產(chǎn)生的心臟毒性，發(fā)揮心臟保護(hù)作用.

細(xì)胞凋亡是維持各器官、組織及細(xì)胞等所處內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式［16］，是一種復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，由Bcl-2 家族和Caspase 家族兩大家族進(jìn)行調(diào)控.Bcl-2 家族是主要的細(xì)胞調(diào)控基因之一，作用于線粒體，使膜通道開放以及促凋亡物質(zhì)流動(dòng)［17］，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程的一類蛋白質(zhì)，由抗凋亡因子和凋亡因子組成.其中Bcl-2 是抗凋亡因子，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，Bax 是促凋亡因子，促使細(xì)胞凋亡，二者共同決定細(xì)胞的存亡［18-19］，Bcl-2與Bax是一對(duì)最主要的拮抗基因，Bcl-2與Bax可形成異二聚體，其比值參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控［6］.李珊珊等［20］研究發(fā)現(xiàn)：華蟾素通過上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2基因而誘導(dǎo)人胃癌 MKN-45 細(xì)胞凋亡.本文研究發(fā)現(xiàn)：ASTs 使Bcl-2/Bax 明顯升高，顯示其抗凋亡作用，抑制ATO 引起的心肌細(xì)胞凋亡.Caspase家族相關(guān)因子在細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，主要是誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］.其中 Caspase-9、Caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子.Caspase-9 是內(nèi)源性凋亡通路的關(guān)鍵酶，Caspase-3是死亡因子，可激活凋亡信號(hào)的傳遞，是最為關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，其過表達(dá)可加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程［22］.當(dāng)Caspase-9 被啟動(dòng)后，Caspase-3 表達(dá)增加，可通過裂解蛋白激酶及細(xì)胞骨架而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.程婷婷等［23］研究發(fā)現(xiàn)地參多糖通過下調(diào)Caspase-3、Caspase-9基因表達(dá)而發(fā)揮對(duì)非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞的凋亡作用.本文研究發(fā)現(xiàn)：ASTs 使Caspase-3、Caspase-9水平顯著下降，減少細(xì)胞凋亡.

綜上所述，本文結(jié)果提示：ASTs 對(duì)ATO 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，可能與調(diào)控Bcl-2/Bax、Caspase-3、Caspase-9 凋亡相關(guān)因子有關(guān)，但其抑制凋亡的更多機(jī)制有待于進(jìn)一步研究.