REGγ通過Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細胞增殖、遷移和侵襲

羅剛 謝敏慧 楊娟 危群華

(1萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院消化科,江西 萍鄉(xiāng) 337000;2萍鄉(xiāng)市蘆溪縣第二人民醫(yī)院內(nèi)二科;3萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院檢驗科)

胃癌是一種發(fā)生在胃部黏膜的常見的惡性腫瘤,是僅次于肺癌的全球第二大癌癥死亡原因,嚴重危害人類健康〔1〕。全球每年胃癌新發(fā)病例約100萬人,其中男性發(fā)病率約是女性的2倍〔2〕。近年來,隨著飲食習(xí)慣的改善和醫(yī)療水平的提高,胃癌發(fā)病率和死亡率有所下降,但其平均5年存活率仍在10%以下〔3〕。由于胃癌發(fā)生機制十分復(fù)雜,臨床手術(shù)和放化療等傳統(tǒng)療法對胃癌的治療具有局限性,尤其是對于早期預(yù)測和晚期預(yù)后等方面〔4〕。分子靶向治療的出現(xiàn)為治愈胃癌提供了新的可能性,找到用于早期診斷和治療的靶點尤為重要。蛋白酶體激活因子(REG)γ(也稱之為PA28γ、PSME3和 Ki抗原)是11S蛋白酶體調(diào)節(jié)顆粒的家族成員,可以通過非腺苷三磷酸(ATP)依賴和非泛素化依賴的方式促進多種蛋白質(zhì)的降解〔5〕。研究發(fā)現(xiàn),REGγ在多種惡性腫瘤中過度表達,包括乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌和肝癌,表明REGγ在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用〔6～8〕。在皮膚癌、黑色素瘤和肺癌等癌癥類型中,REGγ被證明是通過Wnt/β-catenin信號通路影響癌癥發(fā)生〔5〕。Wnt/β-catenin是高度保守的信號通路,參與調(diào)控和介導(dǎo)胃癌的增殖、侵襲和遷移等多個過程〔9〕。本研究探討胃癌細胞中REGγ通過Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細胞系MGC-803,人正常胃黏膜細胞系GES-1,Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑XAV939(美國Selleckchem公司),REGγ siRNA及陰性對照siRNA、Lipofectamine3000試劑、兔抗人REGγ單克隆抗體、兔抗人N-鈣黏蛋白(cadherin)單克隆抗體、兔抗人E-cadherin單克隆抗體、兔抗人Snail單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人C-myc單克隆抗體、兔抗人細胞周期蛋白(Cyclin)D1單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Invitrogen公司)。DMEM培養(yǎng)基、CCK8試劑(美國Sigma公司),實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒、Transwell小室(美國TaKaRa公司)。

1.2Western印跡檢測MGC-803細胞和GES-1細胞中REGγ蛋白水平 取對數(shù)生長期的MGC-803細胞和GES-1細胞,加入RIPA裂解液冰上裂解細胞40 min,21 000 r/min離心15 min,提取細胞蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)法定量測定蛋白濃度。分別取10 μg蛋白上樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,再濕法轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下,用5%的脫脂牛奶對膜進行封閉2 h后,加入REGγ單克隆抗體(1∶3 000)4 ℃孵育過夜。一抗孵育完成后,用TBST清洗膜3次,5 min/次,加入二抗(1∶3 000),室溫孵育1 h,再次用TBST清洗3次,5 min/次。經(jīng)顯影、曝光和掃描圖像后,得到最終的Western印跡結(jié)果。

1.3qRT-PCR檢測MGC-803 細胞和GES-1細胞中REGγ mRNA水平 取對數(shù)生長期的MGC-803細胞和GES-1細胞,加入Trizol試劑,提取細胞總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,qRT-PCR法測定MGC-803細胞和GES-1細胞中REGγ mRNA水平。REGγ引物序列正向：5′-TCCTCACCAATAGCCACG-3′;反向：5′-CTCGATCAGCAGCCGAAT-3′〔10〕。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,總計40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參實時比較PCR擴增程度。

1.4細胞分組和轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的MGC-803細胞分為空白對照(BC)組、陰性對照(NC)組、XAV939組、siR-REGγ組和siR-REGγ+XAV939 組,接種于6孔板,待細胞密度達到80%時,按Lipofectamine3000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。BC組不做任何處理,NC組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA,siR-REGγ組轉(zhuǎn)染REGγ siRNA,XAV939組不轉(zhuǎn)染,只加入抑制劑XAV939(5 μmol/L),siR-REGγ+XAV939 組轉(zhuǎn)染REGγ siRNA并加入XAV939。轉(zhuǎn)染后8 h換液培養(yǎng),48 h后用Western印跡和qRT-PCR測定細胞REGγ蛋白和mRNA表達。

1.5CCK8測定細胞增殖能力 轉(zhuǎn)染48 h后,取同等數(shù)量各組細胞接種于96孔板(4×103個/孔)中,分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h后,每孔加入20 μl CCK8,培養(yǎng)2 h后用酶標儀于450 nm波長下測定每組吸光度值,繪制細胞增殖曲線。

1.6Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲能力 轉(zhuǎn)染48 h后,用無血清DMEM重懸細胞,分別取同等數(shù)量各組細胞(2×104個/孔)接種于Transwell小室上室,下室加入15% DMEM培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后將小室取出,用多聚甲醛固定30 min,后用0.2%結(jié)晶紫溶液染色30 min,200倍顯微鏡下拍照計算遷移細胞數(shù)。侵襲實驗需在實驗前以1∶5比例混合無血清DMEM與基質(zhì)膠包被Transwell小室上室,其余步驟均與遷移實驗相同。

1.7Western印跡檢測細胞N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表達 轉(zhuǎn)染48 h后,分別提取各組細胞的總蛋白,測定N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表達。方法同1.2。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1胃癌細胞MGC-803中REGγ表達 胃癌細胞MGC-803中mRNA和蛋白表達(0.51±0.03、0.70±0.01)均顯著高于正常胃黏膜細胞GES-1(0.29±0.02、0.57±0.01;t=10.425、14.740,均P<0.01),證明胃癌細胞中REGγ的表達顯著上調(diào)。見圖1。

圖1 Western印跡測定GES-1細胞和MGC-803細胞中REGγ蛋白表達

2.2REGγ基因沉默能夠有效抑制胃癌細胞MGC-803增殖 24 h時,各組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。48～72 h時,與BC和NC組相比,siR-REGγ組和XAV939組細胞增殖能力明顯降低(P<0.01)。與siR-REGγ組相比,siR-REGγ+XAV939組細胞增殖能力明顯降低(P<0.01)。BC組和NC組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組MGC-803細胞中REGγ mRNA和蛋白表達及細胞增殖、遷移、侵襲能力比較

2.3REGγ基因沉默能夠有效抑制胃癌細胞MGC-803遷移和侵襲 與BC和NC組相比,siR-REGγ組和XAV939組細胞遷移和侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.01)。與siR-REGγ組相比,siR-REGγ+XAV939組細胞遷移侵襲數(shù)明顯減少(P<0.01)。BC組和NC組細胞遷移和侵襲數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組MGC-803細胞遷移和侵襲能力(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4REGγ siRNA能夠有效沉默胃癌細胞MGC-803中REGγ的表達 與BC和NC組相比,siR-REGγ組和XAV939組細胞表達REGγ mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.01)。與siR-REGγ組相比,siR-REGγ+XAV939組細胞REGγ mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。BC組和NC組細胞REGγ mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖3。

1～5：BC組、NC組、XAV939組、siR-REGγ組、siR-REGγ+XAV939組圖3 Western印跡測定各組MGC-803細胞中REGγ、N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表達

2.5各組細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化情況比較 與BC和NC組相比,siR-REGγ組和XAV939組細胞N-cadherin和Snail蛋白表達顯著降低,E-cadherin表達顯著增加(P<0.01)。與siR-REGγ組相比,siR-REGγ+XAV939組細胞N-cadherin和Snail蛋白表達顯著降低,E-cadherin表達顯著增加(P<0.01)。BC組和NC組細胞蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表2。

表2 各組MGC-803細胞中N-cadherin、E-cadherin、Snail、β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表達

2.6REGγ 基因沉默影響胃癌細胞MGC-803增殖、遷移和侵襲的機制 與BC組和NC組相比,siR-REGγ組和XAV939組細胞β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表達均顯著降低(P<0.01)。與siR-REGγ組相比,siR-REGγ+XAV939組細胞β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白表達明顯降低(P<0.01)。BC組和NC組細胞蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表2。

3 討 論

REGγ最早在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中發(fā)現(xiàn)〔11〕,可以刺激 20S 核心蛋白酶體的蛋白水解活性〔12〕。REGγ能夠促進多個調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵因子的降解,包括細胞周期素依賴性激酶抑制因子p21〔13,14〕和抑癌基因p53〔15,16〕。通常情況下,蛋白酶體的活性在癌細胞中會增強,以加速癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移〔17〕。REGγ也被證明REGγ在乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌和肝癌等多種癌細胞中過度表達〔5～7〕,但在胃癌中REGγ的表達和作用尚未明確。本研究提示,人胃癌MGC-803細胞中REGγ的mRNA和蛋白水平顯著高于人正常胃黏膜細胞,且沉默REGγ可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲,表明REGγ在胃癌的發(fā)生和發(fā)展具有潛在作用。

上皮質(zhì)間轉(zhuǎn)化是指上皮到間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化,與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),從癌細胞起始、生長、侵襲、遷移到定植及對治療的抵抗過程中,上皮質(zhì)間轉(zhuǎn)化都起著關(guān)鍵作用〔18〕。N-cadherin、E-cadherin是上皮質(zhì)間轉(zhuǎn)化的標志蛋白,上皮質(zhì)間轉(zhuǎn)化過程中通常伴隨著N-cadherin表達水平的上升和E-cadherin表達水平的下降〔19〕;而Snail蛋白作為上皮質(zhì)間轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控因子,可以抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄與表達〔20〕,進而調(diào)控轉(zhuǎn)化過程。在本研究結(jié)果表明,沉默REGγ可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制胃癌細胞MGC-803的遷移和侵襲。

Wnt/β-catenin信號通路是上皮質(zhì)間轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性通路,其在癌細胞中通常上調(diào),增加β-catenin的表達;β-catenin上調(diào)進一步激活多基因表達,包括C-myc和CyclinD1,兩者均為影響細胞周期的關(guān)鍵蛋白,其中C-myc調(diào)控細胞周期S期,而CyclinD1調(diào)控細胞周期G1期〔21〕。本研究結(jié)果表明,REGγ 基因沉默可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細胞MGC-803的增殖、遷移和侵襲。