洛神花總黃酮提取工藝及抗氧化性研究

韓鹿 黃曉楚 韓遠(yuǎn)鳳 馬海寧 方桂嬌

摘 要：本研究通過超聲波輔助提取法以及水浴加熱法提取洛神花總黃酮，并檢測提取物的抗氧化性。采用單因素及正交試驗(yàn)考察了料液比、乙醇濃度、水浴溫度、超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響，確定最佳提取方案為洛神花粉末與40%乙醇溶液的料液比1∶10（g∶mL）、超聲波提取70 min、80 ℃水浴加熱

30 min，所得總黃酮含量為32.36 mg·g-1，提取物對(duì)DPPH自由基具有較好的清除率。

關(guān)鍵詞：洛神花；黃酮；抗氧化性

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Flavonoids from Hibiscus sabdariffa

HAN Lu， HUANG Xiaochu， HAN Yuanfeng， MA Haining， FANG Guijiao

（Guangzhou College of Technology and Business， Foshan 528138， China）

Abstract： In this study， the total flavonoids of Hibiscus sabdariffa were extracted by ultrasonic-assisted extraction method as well as water bath heating method and the antioxidant properties of the extracts were tested. The effects of material-liquid ratio， ethanol concentration， water bath temperature， and ultrasonic time on the amount of total flavonoids extracted were investigated by using one-way and orthogonal tests， and the optimal extraction scheme was determined to be the material-liquid ratio of Hibiscus sabdariffa powder to 40% ethanol solution

1∶10 （g∶mL）， ultrasonic extraction for 70 min， and water bath heating at 80 ℃ for 30 min， and the obtained content of total flavonoids was 32.36 mg·g-1， and the extract had a good scavenging rate of DPPH radicals.

Keywords： Hibiscus sabdariffa; flavonoids; antioxidant activity

洛神花在我國福建、云南和廣東等地都有種植，其花萼中富含黃酮類化合物、維生素C、氨基酸、花青素等，具有抗癌、抗炎癥、降血糖、降血脂等功效[1]。洛神花所含有的天然色素提取物已作為無毒副作用的食品著色劑廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[2]。常見的黃酮類化合物提取方法包括有機(jī)溶劑提取法、熱水浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超聲波微波協(xié)同萃取和水浴加熱法等[3-4]。有機(jī)溶劑常被用來提取胞內(nèi)水溶性較差的活性成分，提取過程中的高溫在破壁的同時(shí)，可以提高目標(biāo)提取物的溶解度[5]。微波及超聲波輔助提取法利用物理手段加速細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物的釋放及溶劑與目標(biāo)提取物的充分接觸來提高提取效率[5-6]。

本研究采用乙醇溶液進(jìn)行黃酮類物質(zhì)提取，并以超聲波破壁及水浴加熱的方式輔助提高提取效率，并驗(yàn)證提取物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洛神花，大參林藥店；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇，廣東光華科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海易恩化學(xué)試劑有限公司。所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

小型磨粉機(jī)，九陽股份有限公司；TD5臺(tái)式低速離心機(jī)，上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)電子有限公司；KS-600D型超聲波清洗機(jī)，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ES500-1B電子天平，沈陽亮衡天平儀器有限公司；V-1000型可見分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 洛神花提取工藝及黃酮含量的測定

洛神花粉碎過40目篩，取一定量的粉末并加入一定濃度的乙醇水溶液，常溫以600 W超聲一段時(shí)間，然后在一定溫度下浸提一段時(shí)間，在4 000 r·min-1條件下離心10 min，取上層澄清提取液。

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測定黃酮含量，于510 nm波長處測量吸光度?？傸S酮提取含量計(jì)算為

總黃酮提取量（mg·g-1）=C×N×V/M（1）

式中：C為洛神花總黃酮濃度，mg·mL-1；N為稀釋倍數(shù)；V為洛神花提取液體積，mL；M為洛神花粉末質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

固定料液比為1∶10（g∶mL），超聲功率為600 W，超聲時(shí)間為30 min，水浴溫度為60 ℃，水浴時(shí)間為30 min。通過單因素試驗(yàn)分別考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25）、乙醇濃度（10%、20%、40%、60%和80%）、水浴溫度

（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）、超聲時(shí)間

（20 min、40 min、60 min、80 min和100 min）這4個(gè)因素對(duì)黃酮提取量的影響，以黃酮提取量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，篩選出每個(gè)因素的最佳水平。

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取料液比、乙醇濃度、水浴溫度以及超聲時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，以總黃酮提取量為指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

將1 mL不同黃酮濃度（0.5 μg·mL-1、0.7 μg·mL-1、0.9 μg·mL-1、1.3 μg·mL-1和2.6 μg·mL-1）的洛神花黃酮提取液與6.0 mL濃度為0.1 mg·mL-1的DPPH乙醇混勻，避光反應(yīng)30 min。于517 nm波長處測量吸光度，以無水乙醇作為參比溶液，進(jìn)行背景組和對(duì)照組的測定。DPPH自由基清除率計(jì)算為

DPPH自由基清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100% ? ? ? （2）

式中：A0為1.0 mL無水乙醇+6.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值（對(duì)照組）；A1為1.0 mL黃酮提取液+6.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值（試驗(yàn)組）；A2為1.0 mL黃酮提取液+6.0 mL無水乙醇的吸光值（背景組）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液得到510 nm處黃酮濃度C（mg·L-1）與吸光度A之間的回歸曲線公式為A=12.089C-0.013 4，R2=0.999 3，將測得的洛神花提取液吸光度代入此公式即可計(jì)算出洛神花中總黃酮濃度。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)洛神花總黃酮提取量的影響

由圖1可知，洛神花提取液的料液比為1∶10（g∶mL）時(shí)提取出的總黃酮含量最高。在料液比較低的情況下，溶劑量太少使洛神花粉末與溶劑接觸不充分，過高的料液比會(huì)使黃酮受到胞內(nèi)其他化合物競爭性溶出的影響，降低總黃酮提取量。因此，該條件下最優(yōu)料液比為1∶10（g∶mL），選擇1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)洛神花總黃酮提取量的影響

由圖2可知，在乙醇濃度為40%時(shí)，洛神花提取液中總黃酮含量最高，黃酮與乙醇的極性相近，在40%乙醇中的分配比最大。因此，選擇濃度為30%、40%、50%的乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 水浴溫度對(duì)洛神花總黃酮提取量的影響

由圖3可知，在水浴溫度為70 ℃時(shí)，洛神花提取液中總黃酮含量達(dá)到最高值。在溫度較高的條件下，總黃酮極易發(fā)生氧化分解，從而影響總黃酮的提取量。因此，選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)洛神花總黃酮提取量的影響

由圖4可知，在超聲波處理時(shí)間為80 min時(shí)，洛神花提取液中總黃酮含量達(dá)到最高值，隨后逐漸降低。超聲波的機(jī)械振動(dòng)和空化效應(yīng)，可以破壞植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而讓溶劑更快地滲入細(xì)胞中，由此提高了細(xì)胞中物質(zhì)的溶解速率，增加了黃酮得率。超聲波作用的時(shí)間較短時(shí)，破壁效果不充分總黃酮尚未全部溶出；隨著超聲波作用時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)的類黃酮成分與乙醇溶液完全作用，使得更多的類黃酮成分溶解出來，從而提高了提取率；但超聲過程過久也會(huì)使其他非黃酮成分溶解，使總黃酮含量下降。因此，選擇超聲時(shí)間為70 min、80 min、90 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2中R值可以得出，洛神花總黃酮提取量的影響因素主次順序是A＞C＞D＞B，即料液比＞水浴溫度＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度。正交試驗(yàn)中的最優(yōu)工藝與由K值得到最佳工藝一致，最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B2C3D1，即料液比1∶10（g∶mL）、乙醇濃度40%、水浴溫度80 ℃、超聲時(shí)間70 min。此工藝下，洛神花總黃酮提取量為32.36 mg·g-1。

2.4 DPPH自由基清除率分析

由圖5可知，黃酮濃度為0.5 μg·mL-1時(shí)，洛神花提取液的DPPH自由基清除率為41.77%。黃酮濃度為2.6 μg·mL-1時(shí)，洛神花提取液的DPPH自由基清除率達(dá)到99.85%，洛神花提取液對(duì)DPPH自由基的清除作用十分明顯。

3 結(jié)論

本研究以洛神花總黃酮提取量為考察對(duì)象，對(duì)不同料液比、乙醇濃度和水浴溫度以及超聲波作用時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，并通過正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝。結(jié)果表明，影響洛神花總黃酮提取量的因素主次順序?yàn)榱弦罕龋舅囟龋境晻r(shí)間＞乙醇濃度，最佳提取工藝為洛神花粉末與40%乙醇溶液的料液比1∶10（g∶mL）、超聲波提取70 min、80 ℃水浴加熱30 min，使用此提取方法得到的總黃酮含量為32.36 mg·g-1。本研究將超聲波輔助提取法、乙醇溶液提取法與水浴加熱法3種方法結(jié)合起來提取洛神花總黃酮，工藝條件安全、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，能夠有效提高總黃酮的提取量，為洛神花的提取工藝研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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