富硒酵母姜黃素組合物對(duì)小鼠酒精性肝損傷的研究

欒金玲 朱婭敏 陳智仙 梁秋元 程倩

摘 要：目的：觀察姜黃素、富硒酵母和姜黃素聯(lián)合富硒酵母組對(duì)酒精中毒小鼠的保護(hù)作用。方法：將喂養(yǎng)的小鼠均勻分為空白組、模型組、姜黃素組、富硒酵母組和姜黃素聯(lián)合富硒酵母組，連續(xù)灌胃30 d，觀察小鼠肝損傷情況并檢測(cè)甘油三酯（Triglyceride，TG）、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等指標(biāo)。結(jié)果：與模型組相比，姜黃素組及姜黃素聯(lián)合富硒酵母組小鼠肝臟指數(shù)下降，且差異具有顯著性；各劑量組小鼠肝臟MDA水平明顯下降，急性酒精灌胃后，姜黃素組、富硒酵母組及姜黃素聯(lián)合富硒酵母組小鼠的肝臟TG水平較模型組顯著降低，具有顯著性差異；各樣品組小鼠肝臟病理得分有所下降，脂肪面積占比顯著降低，具有顯著性差異。結(jié)論：姜黃素和富硒酵母對(duì)酒精導(dǎo)致的肝損傷具有協(xié)同作用，補(bǔ)充姜黃素和富硒酵母能通過對(duì)抗氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷，有效地改善酒精導(dǎo)致的肝損傷。

關(guān)鍵詞：富硒酵母；姜黃素；肝損傷；小鼠

Study on the Effect of Selenium Enriched Yeast Curcumin Combination on Alcoholic Liver Injury in Mice

LUAN Jinling1，3， ZHU Yamin2， CHEN Zhixian1， LIANG Qiuyuan2， CHENG Qian1，3*

（1.National Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Yichang 443003， China;

2.Yichang Engineering Technology Research Center of Nutrition and Health Food， Yichang 443003， China;

3.Hubei Provincial Key Laboratory of Yeast Function， Yichang 443003， China）

Abstract： Objective： To observe the protective effects of curcumin， selenium-rich yeast and curcumin combined with selenium-rich yeast compositions on mice with alcoholism. Method： The mice were evenly divided into blank group， model group， curcumin group， selenium-rich yeast group and curcumin combined with selenium-rich yeast group. After 30-day administration， the content of triglycerides （TG）， malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH） and other indexes were determined. Result： Compared with the model group， the liver index of mice in the curcumin group and the curcumin combined with selenium enriched yeast group decreased significantly， and the difference was significant; The MDA levels in the liver of mice in each dose group significantly decreased. After acute alcohol administration， the TG levels in the liver of mice in the curcumin group， selenium enriched yeast group， and curcumin combined with selenium enriched yeast group were significantly reduced compared to the model group， with significant differences; The liver pathological scores of each sample group of mice decreased， and the proportion of fat area significantly decreased， showing significant differences. Conclusion： Curcumin and selenium rich yeast have a synergistic effect on alcohol induced liver damage. Supplementing curcumin and selenium rich yeast can effectively improve alcohol induced liver damage by combating oxidative stress and lipid peroxidation damage.

Keywords： selenium enriched yeast; curcumin; liver damage; mouth

肝臟對(duì)人體外來和自身代謝產(chǎn)生的許多有害因素具有強(qiáng)大的防御解毒功能，是人體消化系統(tǒng)中最大、最重要的消化腺體[1]。長(zhǎng)期大量飲酒可引起肝臟、胃、心臟、腦組織等多個(gè)臟器損害，尤其是對(duì)肝臟的損傷最嚴(yán)重。在非病毒性肝病中，酒精性肝病居首位，重度飲酒者中，80%以上患脂肪肝，10%～35%可發(fā)展成酒精性肝炎，10%～20%將發(fā)展成肝硬化，而酒精性肝硬化預(yù)后差，比非酒精性肝硬化生存時(shí)間明顯縮短。目前，解酒保肝已成為醫(yī)學(xué)界與生物界需要解決的問題，加強(qiáng)對(duì)其的研究十分迫切。已有研究表明，乙醇肝損傷的機(jī)制與肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)密切相關(guān)[2]。在當(dāng)前的治療中，對(duì)于酒精肝損傷患者，戒酒是西方國(guó)家的主要治療方式，更為有效的治療手段還在研究中。因此，國(guó)內(nèi)和國(guó)外出現(xiàn)了很多保護(hù)肝臟的健康食品，用來緩解肝損傷，我國(guó)有很多食品具有很好的加速酒精代謝和保護(hù)肝臟的功能。

姜黃素是姜科植物（姜黃、莪術(shù)、郁金等）的主要生物活性成分之一。近幾年研究結(jié)果顯示，姜黃素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗血管生成、清除自由基、保護(hù)心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等功效[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)于酒精性肝損傷具有很好的修復(fù)作用[4-7]。硒具有保護(hù)肝臟和防治肝病的功能，是人體內(nèi)所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一[8-11]。硒是構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）的重要組成成分，作為人體必需的微量元素，可以清除體內(nèi)的過氧化物質(zhì)，避免細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到過氧化物的損害，從而降低機(jī)體的氧化損傷[12]。富硒酵母是一種經(jīng)生物工程技術(shù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的富含微量元素硒的有機(jī)生物制劑，其含有的硒能被人和動(dòng)物最大程度地吸收并參與機(jī)體代謝。目前，已經(jīng)獲得衛(wèi)健委的批準(zhǔn)，富硒酵母可以作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和保健食品原料使用。姜黃素和富硒酵母作為食品原料，在營(yíng)養(yǎng)保健食品的使用中具有法規(guī)限量。為了擴(kuò)大姜黃素和富硒酵母在食品中的應(yīng)用范圍，同時(shí)為了提高人們對(duì)于日常護(hù)肝的意識(shí)，本文研究了低劑量的姜黃素和富硒酵母對(duì)于酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

富硒酵母（硒含量2 000 mg·kg-1），安琪酵母股份有限公司；姜黃素，Sami-Sabinsa Group Limited，保存條件為陰涼干燥；甘油三酯測(cè)定試劑盒、丙二醛測(cè)定試劑盒，南京建成生物有限公司；還原型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J、雄性成年小鼠60只，體重18～20 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK<湘>2019-0004，于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院農(nóng)藥毒理研究中心飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施許可證號(hào)：SYXK（鄂）2019-0046]。環(huán)境溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度55%～75%。小鼠飼料由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院農(nóng)藥毒理研究中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平，德國(guó)Sartorious；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；5810R低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠；恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO 公司；KZ-III研磨儀經(jīng)濟(jì)型，天津賽維爾公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

采用《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》中第19項(xiàng)“對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能”方案二（酒精肝損傷模型）方法。將60只成年小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，受試物具體分組如下：①姜黃素劑量組[姜黃素16.67 mg·（kg bw）-1]；②富硒酵母組[富硒酵母7.50 mg·（kg bw）-1]；③姜黃素劑量聯(lián)合富硒酵母組[姜黃素16.67 mg·（kg bw）-1+富硒酵母7.50 mg·（kg bw）-1]；④模型組給予50%分析純乙醇（無水乙醇與蒸餾水為1∶1稀釋）一次性灌胃，灌胃量為12 mg·（kg bw）-1；⑤空白組給予蒸餾水。受試樣品每日經(jīng)口灌胃給予實(shí)驗(yàn)小鼠，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d。小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境，自由飲食飲水。每天觀察小鼠的攝食、飲水、活動(dòng)和一般情況，每周稱重2次，按體重調(diào)整受試樣品劑量。急性酒精性肝損傷造模于實(shí)驗(yàn)第30天進(jìn)行，除空白對(duì)照組外，其余小鼠給予50%分析純乙醇（無水乙醇與蒸餾水為1∶1稀釋）一次性灌胃，灌胃量為 12 mg·（kg bw）-1，空白對(duì)照組給予等量蒸餾水。禁食不禁水16 h后處死動(dòng)物，取材進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)及病理組織學(xué)檢查。

1.4.1 肝組織勻漿制備

取100 mg肝組織，加入900 μL PBS，振動(dòng)研磨。充分研磨后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，通過生化試劑盒測(cè)定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、甘油三酯（Triglyceride，TG）及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量。

1.4.2 肝臟組織病理學(xué)觀察

小鼠肝臟脂肪沉積采用油紅O染色法，肝臟組織在最佳切削溫度條件下用包埋機(jī)進(jìn)行包埋，獲得冰凍組織切片，用油紅O進(jìn)行染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察脂滴在肝臟組織中的分布范圍與面積。若脂滴在肝細(xì)胞內(nèi)散在分布和稀少則計(jì)0分；若脂滴不超過肝臟組織面積的1/4則計(jì)1分；若脂滴不超過肝臟組織面積的1/2則計(jì)2分；若脂滴不超過肝臟組織面積的3/4則計(jì)3分；若脂滴填充了整個(gè)肝臟組織則計(jì)4分。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Minitab 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 結(jié)果判定

以下任何一個(gè)結(jié)果陽性，即判定該受試樣品對(duì)酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)作用。①肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果呈陽性。②肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項(xiàng)指標(biāo)中任兩項(xiàng)指標(biāo)陽性和病理組織學(xué)檢查結(jié)果陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟指數(shù)的變化

由表1可知，各組小鼠的初始體重及最終體重均無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，相比空白組，模型組（即只喂食酒精）的小鼠肝臟指數(shù)顯著增加；與模型組相比，姜黃素組及姜黃素聯(lián)合富硒酵母組小鼠肝臟指數(shù)下降，且差異具有顯著性，表明姜黃素及姜黃素聯(lián)合富硒酵母能夠保護(hù)小鼠因急性酒精灌胃導(dǎo)致的肝臟受損腫大。

2.2 肝臟組織TG、MDA、GSH的水平

與空白組相比，模型組小鼠肝臟TG、MDA水平顯著增加（P＜0.05）。急性酒精灌胃后，姜黃素組、富硒酵母組及姜黃素聯(lián)合富硒酵母組小鼠的肝臟TG水平較模型組顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，各劑量組小鼠肝臟MDA水平明顯下降，且差異具有顯著性。然而，相比于空白組，模型組小鼠肝臟GSH水平有所上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與急性酒精灌胃后GSH水平應(yīng)激性升高相關(guān)。各樣品組小鼠肝臟GSH水平較模型組均明顯升高，且差異具有顯著性（見表2），可見姜黃素單方、富硒酵母單方、姜黃素聯(lián)合富硒酵母均可以降低急性酒精性肝臟損傷小鼠肝臟組織TG、MDA水平。另外，從數(shù)據(jù)也可以看出，姜黃素聯(lián)合富硒酵母的效果優(yōu)于兩種物質(zhì)單方的結(jié)果，說明姜黃素與富硒酵母具有協(xié)同的作用。

2.3 肝臟組織脂質(zhì)沉積情況

油紅O染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，少量、小體積、分布均勻的橘紅色小脂滴分散在空白組小鼠肝臟細(xì)胞中。大量彌漫性、大小不一的橘紅色脂滴在模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)聚集，與空白組相比體積增大。而相較于模型組，姜黃素、富硒酵母、姜黃素聯(lián)合富硒酵母小鼠肝細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴數(shù)量減少、體積減小，且差異明顯（見圖1）。各組小鼠肝臟組織脂肪肝沉積評(píng)分結(jié)果如表3所示，相對(duì)于空白組，模型組小鼠肝臟病理得分增加，脂肪面積占比顯著升高，且差異具有顯著性（P＜0.05）。與模型組相比，各樣品組小鼠肝臟病理得分有所下降，脂肪面積占比顯著降低（P＜0.05），表明姜黃素單方、富硒酵母單方、姜黃素聯(lián)合富硒酵母復(fù)方均能夠緩解急性酒精性肝臟脂質(zhì)沉積。從脂肪面積比的結(jié)果看，姜黃素聯(lián)合富硒酵母復(fù)方具有協(xié)同的作用。

3 結(jié)論

根據(jù)前期學(xué)者的研究[9-11，13-15]，本次研究中富硒酵母（硒含量2 000 mg·kg-1）、姜黃素的成人攝入量分別為45 mg·d-1[0.75 mg·（kg bw）-1]、100 mg·d-1[1.67 mg·（kg bw）-1]，其中硒的含量為90 μg·d-1，實(shí)驗(yàn)選用成年雄性C57BL/6J小鼠，樣品分別按人體推薦量的10倍經(jīng)口灌胃給予受試物，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和模型對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，姜黃素及姜黃素聯(lián)合富硒酵母組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低；姜黃素、富硒酵母及姜黃素聯(lián)合富硒酵母組小鼠肝臟組織TG水平顯著下降；各樣品組小鼠肝臟組織MDA水平顯著下降；肝臟組織GSH水平顯著增加。油紅O染色結(jié)果顯示，相較于模型組，喂食了姜黃素、富硒酵母和姜黃素富硒酵母組合物的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴面積和體積均明顯減少，脂肪面積占比降低，且差異具有顯著性。

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中判定結(jié)果，滿足以下任一條件，可判定受試樣品具有對(duì)酒精性肝損傷有輔助保護(hù)作用。①肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果陽性。②肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項(xiàng)指標(biāo)中任兩項(xiàng)指標(biāo)陽性和病理組織學(xué)檢查結(jié)果陽性。本實(shí)驗(yàn)肝臟MDA、還原型GSH和TG 3項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)以及病理組織學(xué)檢查結(jié)果均為陽性，判定姜黃素單方、姜黃素聯(lián)合富硒酵母復(fù)方對(duì)化學(xué)性肝損傷具有輔助保護(hù)功能。

參考文獻(xiàn)

[1]張敏.對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助性保護(hù)作用的保健食品研究進(jìn)展[J].四川食品與發(fā)酵，2005，41（1）：40-43.

[2]石同幸，周穎，麥惠霞，等.硒對(duì)酒精引起肝損傷的拮抗作用研究[J].中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué)，2002，29（1）：35-36.

[3]ELBANHAWEY M A，ASHRY M A，ELANSARY A K，et al.Effect of Curcuma longa or praziquantel on Schistosoma mansoni infected mice liver： histological and histochemical study[J].Indian Journal of Experimental Biology， 2007，45（10）：877-889.

[4]曾瑜，黃真真，潘興昌，等.姜黃素對(duì)急性酒精中毒小鼠抗氧化功能的影響[C]//中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)兩專委會(huì)、五省市學(xué)術(shù)聯(lián)合學(xué)術(shù)會(huì)議暨環(huán)境·輻射與健康防護(hù)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集.太原：山西省環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)，2013：185-188.

[5]徐容容，王華，舒志成，等.姜黃素對(duì)小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用[J].飲料工業(yè)，2018，21（5）：10-12.

[6]RONG S，ZHAO Y，BAO W，et al.Curcumin prevents chronic alcohol-induced liver disease involving decreasing ROS generation and enhancing antioxidative capacity[J].

Phytomedicine，2012，19（6）：545-550.

[7]尹蓉，王沁，富翠芹.姜黃素對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響[J].世界華人消化雜志，2008，16（13）：1383-1387.

[8]姚桂樹，黃志偉，蔣再靜.硒酵母片治療慢性乙型肝炎的臨床研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6（9）：55-56.

[9]李海，唐克誠(chéng)，李謙，等.西維爾補(bǔ)硒治療慢性肝病患者的臨床療效[J].微量元素與健康研究，2005，22（2）：

11-12.

[10]張國(guó)蓉，王燕，劉安軍.富硒酵母對(duì)CCl4肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究[J].食品科技，2009，34（3）：118-121.

[11]張素云，許秀舉.硒對(duì)酒精性肝損害小鼠保護(hù)作用的研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（4）：365-366.

[12]LEE H I，MCGREGOR R A，CHOI M S，et al.Low doses of curcumin protect alcohol-induced liver damage by modulation of the alcohol metabolic pathway， CYP2E1 and AMPK[J].Life

Sciences，2013，93（18/19）：693-699.

[13]李萬立，張守華，查龍應(yīng)，等.富硒酵母對(duì)銅負(fù)荷導(dǎo)致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009，31（5）：

486-489.

[14]王子愷，毛泳彬，孔力，等.姜黃素及其類似物抑制CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2020，17（8）：13-16.

[15]李紅山，應(yīng)豪，胡愛榮，等.蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A在高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中的變化及姜黃素的干預(yù)作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（11）：2777-2780.