高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物的含量

黃昌興

摘 要：建立了高效液相色譜-熒光法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取、硼氫化鉀還原、離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及中性氧化鋁柱凈化后，經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)液相色譜柱分離，熒光檢測器檢測，外標法定量。結(jié)果表明，孔雀石綠和隱色孔雀石綠在1.0～20.0 μg·mL-1均具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥0.999 8，檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1，加標回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠；水產(chǎn)品；液相色譜；熒光法

Determination of Malachite Green and Its Metabolites in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Changxing

（Shantou Inspection and Testing Center， Shantou 515041， China）

Abstract： A method for the determination of malachite green and leucomalachite green in aquatic products by high performance liquid chromatography with fluorescence detection was established. After ultrasonic extraction with acetonitrile， reduction with potassium borohydride， centrifugation， rotary evaporation， purification with neutral aluminum oxide column， the sample is filtered by microporous membrane， and the filtrate is separated by liquid chromatography column， detected by fluorescence detector， and quantified by external standard method. The results showed that malachite green and leucomalachite green showed good linearity in the range of 1.0～20.0 μg·mL-1 with the correlation coefficients ≥0.999 8， the limits of detection of 0.5 μg·kg-1 and the limits of quantification of

1.5 μg·kg-1， and the recoveries of spiked standards ranged from 88.1% to 96.6% with the RSD of 0.9%～3.8%.

Keywords： malachite green; aquatic products; liquid chromatography; fluorimetry

孔雀石綠（Malachite Green，MG），別名孔雀綠、孔雀綠草酸鹽、堿性綠、草酸孔雀石綠等，是人工合成的一種三苯甲烷類化學物，可殺真菌、細菌、寄生蟲，因其對養(yǎng)殖水域中的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病和寄生蟲病等具有良好的療效，被作為殺菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用[1-2]。孔雀石綠在魚體內(nèi)代謝為隱色孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG），其毒性強于母體孔雀石綠，有強烈的致畸胎、致突變、致癌作用。2002年原農(nóng)業(yè)部頒布的《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》已明文規(guī)定孔雀石綠禁止用于所有食品動物。

水產(chǎn)品是汕頭當?shù)鼐用窠?jīng)常食用的食品，水產(chǎn)品養(yǎng)殖更是當?shù)氐膫鹘y(tǒng)海洋產(chǎn)業(yè)之一。因此強化水產(chǎn)品質(zhì)量安全對于保障消費者生命健康、促進水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)繁榮發(fā)展均具有重要意義。目前，MG及其代謝物LMG的檢測方法主要包括分光光度法、酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometer，LC-MS）等[3-5]，其中HPLC因檢測成本低、儀器普及率高而被基層檢測機構(gòu)廣泛采用。本文建立了高效液相色譜-熒光法檢測水產(chǎn)品中MG及其代謝物LMG的方法，以期簡化樣品前處理過程，提高基層檢測機構(gòu)的檢測效率和準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1200型液相色譜-熒光檢測器：美國Agilent安捷倫公司；HX-4型均質(zhì)器：山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司；TG16G型離心機：常州市億能實驗儀器廠；VOKTEX型渦旋混勻器：海門市貝爾儀器制造有限公司；SN-RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；固相萃取裝置：德國CNW公司；PRS固相萃取柱：500 mg/3 mL；中性氧化鋁固相萃取柱：1 g/3 mL。

孔雀石綠和隱色孔雀石綠，純度≥98%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈：均為色譜純；鹽酸羥胺、乙酸、對甲苯磺酸、二甘醇和硼氫化鉀，均為分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量的MG或LMG標準品，用適量甲醇溶解并定容，配制成濃度為100 mg·L-1的標準溶液，4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

水產(chǎn)品去鱗、去骨、去皮，沿著背脊取可食用部分，粉碎；準確稱取樣品5.0 g（精度0.1 mg）于

50 mL離心管內(nèi)，依次加入0.1 mol·L-1乙酸銨緩沖液

5.0 mL、20%鹽酸羥胺1.5 mL、1.0 mol·L-1對甲苯磺酸2.5 mL，用勻質(zhì)機以10 000 r·min-1的速度均質(zhì)30 s，加入10 mL乙腈渦旋振蕩60 s；加入酸性氧化鋁10 g，渦旋振蕩30 s，6 000 r·min-1離心5 min；上清液中加入二甘醇10 mL、乙腈10 mL，渦旋振蕩30 s，6 000 r·min-1離心5 min；上清液加入1 mL硼氫化鉀、15 mL二氯甲烷，渦旋振蕩30 s，6 000 r·min-1離心5 min，收集下層二氯甲烷溶液；殘渣中加入10 mL二氯甲烷重復提取一次，合并二氯甲烷溶液；45 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，用5 mL乙腈充分溶解殘渣，待凈化。

1.3.2 凈化

將中性氧化鋁固相萃取柱與PRS固相萃取柱連接，PRS固相萃取柱安裝在固相萃取裝置上，用

5 mL乙腈活化萃取柱后，將待凈化樣品溶液轉(zhuǎn)移至中性氧化鋁SPE小柱中凈化，棄去流出液；依次加入2 mL初始流動相、1 mL鹽酸羥胺甲醇溶液洗脫PRS柱，洗脫液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供HPLC測定。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Silversil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨溶液（82∶18）；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；激發(fā)波長：265 nm；發(fā)射波長：360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件優(yōu)化

2.1.1 提取與凈化

結(jié)合MG和LMG的理化性質(zhì)，比較了乙酸鈉緩沖溶液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機溶劑對水產(chǎn)品中MG和LMG的萃取效率；比較了酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁對水產(chǎn)品中MG和LMG的凈化效果。結(jié)果表明，乙腈對MG和LMG具有良好的萃取效率，加標回收率在93.4%～97.8%；堿性和酸性氧化鋁會吸附目標化合物而降低萃取率，而中性氧化鋁固相萃取柱凈化，可有效去除提取液中酸性雜質(zhì)，消除水產(chǎn)品中油脂和基體的干擾，凈化效果好，基質(zhì)干擾小，可有效保護色譜柱和檢測器。

2.1.2 流動相的選擇

比較了甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨溶液、四丁基溴化鈉-乙腈或甲醇等不同流動相種類或比例對MG及其代謝物LMG的色譜分離效果。結(jié)果顯示，以乙腈-乙酸銨水溶液作為流動相時，MG和LMG可獲得更好的分離效果，且響應信號強，這可能是由于MG及LMG易于在乙腈中溶解，且乙酸銨作為緩沖溶液可提供合適的pH，從而促進其生成正離子；當乙酸銨濃度為5 mmol·L-1時，MG及其代謝物LMG可有效分離，峰形尖銳且對稱，出峰時間適中且相對穩(wěn)定，基線穩(wěn)定且基質(zhì)干擾少，色譜圖見圖1。

2.2 線性關(guān)系及檢出限

配制MG和LMG質(zhì)量濃度為0 μg·mL-1、

1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1的混合標準溶液，按本文建立的HPLC法進行測定，以MG和LMG響應值為縱坐標，以MG和LMG質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果顯示，在1.0～20.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，GM的線性關(guān)系方程為y=0.315 7x+0.032 25，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8；LGM的線性關(guān)系方程為y=

0.421 3x+0.024 86，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，這表明MG和LMG均具有很好的線性關(guān)系。

在空白水產(chǎn)品樣品中添加濃度為0.1 μg·kg-1、

0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、1.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1的系列標準溶液進行測定，以3倍信噪比（S/N）作為方法檢出限，10倍信噪比為方法定量限。結(jié)果顯示，該方法MG和LMG的檢出限為

0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1。

2.3 方法回收率和精密度

分別對秋刀魚、對蝦和螃蟹空白樣品進行MG和LMG低、中、高3個水平的加標回收實驗，按本文建立的檢測方法進行測定，回收率和精密度（RSD）見表1。結(jié)果顯示，MG和LMG在3個加標水平下的平均回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%，表明本方法具有較好的準確度和精密度。

2.4 實際樣品檢測

采用本方法對市售的對蝦、螃蟹、鯽魚等10份水產(chǎn)品逐個進行MG和LMG含量檢測，均未檢出MG和LMG殘留，說明所檢10份水產(chǎn)品在養(yǎng)殖過程中均未使用孔雀石綠藥物。

3 結(jié)論

本文建立了水產(chǎn)品中MG和LMG的高效液相色譜-熒光法測定方法。水產(chǎn)品經(jīng)乙腈超聲提取及中性氧化鋁柱凈化后，用液相色譜-熒光檢測器檢測。結(jié)果表明，MG和LMG在1.0～20.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，均具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥0.999 8；檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.5 μg·kg-1；加標回收率為88.1%～96.6%，RSD為0.9%～3.8%。該方法具有較好的準確度和精密度，可滿足水產(chǎn)品中MG和LMG含量測定。

參考文獻

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