杜仲葉總黃酮通過RhoA/ROCK信號(hào)通路參與腦出血大鼠神經(jīng)功能修復(fù)

張秀峰　李小菲　劉明　王慧靜

摘要：目的 從Ras同源基因家族成員A（RhoA）/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）通路探討杜仲葉總黃酮促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的機(jī)制。方法 取SD雄性大鼠，用改良二次注血法建立腦出血模型，并按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、杜仲葉總黃酮組、RhoA抑制劑組、RhoA激動(dòng)劑組、杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組，每組20只。杜仲葉總黃酮組灌胃200 mg/kg杜仲葉總黃酮，RhoA抑制劑組腹腔注射1 mg/kg的RhoA抑制劑Y27632，RhoA激動(dòng)劑組腹腔注射30 μg/kg的RhoA激動(dòng)劑U-46619，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組灌胃200 mg/kg杜仲葉總黃酮的同時(shí)腹腔注射30 μg/kg U-46619，模型組及假手術(shù)組灌胃10 mL/kg生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。給藥結(jié)束后，觀察大鼠行為變化，采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）對(duì)神經(jīng)功能缺損癥狀進(jìn)行評(píng)估；取腦組織后稱質(zhì)量，計(jì)算腦組織含水量，然后制備腦組織切片并計(jì)算腦血腫體積百分比；透射電鏡觀察血腫周圍組織神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)變化；TUNEL染色法觀察血腫周圍組織神經(jīng)元凋亡；鬼筆環(huán)肽染色觀察血腫周圍組織神經(jīng)元骨架變化；蛋白免疫印跡法檢測血腫周圍組織RhoA、ROCK、細(xì)胞骨架蛋白（F-actin）、絲切蛋白（cofilin）、磷酸化cofilin（p-cofilin）、促神經(jīng)元及突觸生長相關(guān)蛋白［神經(jīng)生長因子（NGF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子3（NT3）、突觸后致密蛋白-95（PSD-95）、突觸素（SYP）］的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量、腦血腫體積百分比升高，血腫周圍組織神經(jīng)元凋亡及骨架結(jié)構(gòu)損傷，神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)改變嚴(yán)重，RhoA/ROCK通路激活，促神經(jīng)元及突觸生長相關(guān)蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。杜仲葉總黃酮或RhoA抑制劑干預(yù)治療均可抑制RhoA/ROCK通路激活介導(dǎo)的神經(jīng)元骨架結(jié)構(gòu)改變，提高促神經(jīng)元及突觸生長相關(guān)蛋白表達(dá)，緩解腦出血后血腫周圍組織神經(jīng)元損傷及凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)（P＜0.05）。RhoA激動(dòng)劑可促進(jìn)RhoA/ROCK通路激活，加重腦出血后神經(jīng)功能損傷，并削弱杜仲葉總黃酮的促神經(jīng)功能修復(fù)作用（P＜0.05）。結(jié)論 杜仲葉總黃酮可通過抑制RhoA/ROCK通路活化來改善腦出血大鼠出血癥狀，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)。

關(guān)鍵詞：腦出血；ρA GTP結(jié)合蛋白質(zhì)；rho相關(guān)激酶類；杜仲葉總黃酮；神經(jīng)功能修復(fù)

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221033

Eucommia ulmoides leaves total flavonoids participate in the repair of neural function in rats with cerebral hemorrhage through RhoA/ROCK signaling pathway

ZHANG Xiufeng， LI Xiaofei， LIU Ming△， WANG Huijing

Department of Neurosurgery， the First Hospital Affiliated to Hebei North University， Zhangjiakou 075000， China

△Corresponding Author E-mail： lmltx2009@126.com

Abstract： Objective To explore the possible mechanism of eucommia ulmoides leaves total flavonoids promoting neurological repair in rats with cerebral hemorrhage from the Ras homolog gene family member A （RhoA）/Rho-associated coiled-coil protein kinase （ROCK） pathway. Methods SD male rats were used to establish cerebral hemorrhage model by the modified double injection method， and they were randomly divided into the sham operation group， the model group， the eucommia ulmoides leaves total flavonoids group， the RhoA inhibitor group， the RhoA agonist group， and the eucommia ulmoides leaves total flavonoids + RhoA agonist group， with 20 rats in each group. The eucommia ulmoides leaves total flavonoids group was intragaically treated with 200 mg/kg eucommia ulmoides leaves total flavonoids. The RhoA inhibitor group was intraperitoneally injected with 1 mg/kg RhoA inhibitor Y27632. The RhoA agonist group was intraperitoneally injected with 30 ?g/kg RhoA agonist U-46619， and the eucommia ulmoides leaves total flavonoids + RhoA agonist group was intraperitoneally injected with 200 mg/kg eucommia ulmoides leaves total flavonoids and 30 ?g/kg RhoA agonist U-46619. The model group and sham operation group were given 10 mL/kg normal saline once a day for 7 consecutive days. After the administration， the behavioral changes of rats were observed with the naked eye and the neurological deficit symptoms were assessed by the modified neurological severity score （mNSS）. Brain tissue was taken and weighed， and the water content of the brain tissue was calculated according to the formula to evaluate the cerebral edema， then the brain tissue slices were prepared and the volume percentage of the cerebral hematoma was calculated according to the formula. Changes in the structure of nerve synapses in perihematoma tissue were observed by transmission electron microscope. Changes of neuronal apoptosis of perihematoma tissue were observed by TUNEL staining method. Changes in neuron skeleton of perihematoma tissue were detected by phalloidin staining. The expression levels of RhoA， ROCK， cytoskeleton protein （F-actin）， filament protein （cofilin）， phosphorylated cofilin （p-cofilin）， neuron and synapse growth promoting proteins [nerve growth factor （NGF）， neurotrophic factor 3 （NT3）， postsynaptic dense protein-95 （PSD-95）， synaptophysin （SYP）] in perihematoma tissue were detected by Western blot assay. Results Compared with the sham operation group， the neurological deficit scores， water content of brain tissue and the percentage of cerebral hematoma volume were increased in the model group， the neuronal apoptosis， skeleton structure damage， and changes in the structure of nerve synapses in the surrounding tissue of the hematoma were severer， the activation of RhoA/ROCK pathway increased， and the expression of neuron and synapse growth promoting proteins decreased （P＜0.05）. Eucommia ulmoides leaves total flavonoids or RhoA inhibitor intervention treatment could inhibit changes in neuron skeleton structure mediated by RhoA/ROCK pathway activation， increase the expression of neuron and synapse growth promoting proteins， alleviate neuronal damage and apoptosis in surrounding tissues of the hematoma after cerebral hemorrhage， and promote nerve function repair （P＜0.05）. RhoA agonist could promote the activation of RhoA/ROCK pathway， aggravate the neurological damage after cerebral hemorrhage， and weaken the nerve function repairing effect of eucommia ulmoides leaves total flavonoids （P＜0.05）. Conclusion Eucommia ulmoides leaves total flavonoids can improve the symptoms of cerebral hemorrhage in rats and promote the nerve function repair by inhibiting the activation of RhoA/ROCK pathway.

Key words： cerebral hemorrhage; rhoA GTP-binding protein; rho-associated kinases; eucommia ulmoides leaves total flavonoids; nerve function repair

腦出血是由非外傷性腦血管破裂引起的出血，常導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)繼發(fā)性損傷，具有較高的致死率及致殘率［1］。促進(jìn)腦出血后神經(jīng)元再生及修復(fù)，對(duì)促進(jìn)腦出血患者神經(jīng)功能恢復(fù)、降低致殘發(fā)生率具有重要意義。Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）及其效應(yīng)分子，如Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK）活化后可影響細(xì)胞骨架重排，導(dǎo)致神經(jīng)生長錐塌陷進(jìn)而阻斷神經(jīng)再生及重塑［2］。已有研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后RhoA/ROCK信號(hào)通路處于活化狀態(tài)［3］，提示干預(yù)RhoA/ROCK信號(hào)通路活化可能是緩解腦出血后神經(jīng)元損傷、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的潛在治療機(jī)制。杜仲葉總黃酮是從杜仲中提取的一種生物活性成分。有研究顯示杜仲雄花能通過抑制氧化應(yīng)激減輕小鼠腦損傷［4］。但目前鮮有杜仲葉總黃酮在腦出血方面作用的研究。本研究擬通過建立腦出血大鼠模型，探討杜仲葉總黃酮通過RhoA/Rock通路促進(jìn)腦出血神經(jīng)功能修復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 125只SD雄性大鼠購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2019-0023］，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，分籠飼養(yǎng)，溫度23～25.5 ℃，濕度55%～60%，光照條件設(shè)定為明暗各12 h循環(huán)交替，保持通風(fēng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：LSD2021第041號(hào)）。

1.1.2 主要試劑與儀器 杜仲葉總黃酮（原料藥，純度98%，貨號(hào)ZLS309-24-3）購自湖南天下康生物科技有限公司；RhoA抑制劑Y27632（貨號(hào)B6693）購自北京康瑞納生物科技有限公司；RhoA激動(dòng)劑U-46619（貨號(hào)ajci10652）購自武漢安捷凱生物醫(yī)藥科技有限公司。TUNEL染色試劑盒（貨號(hào)CA2915）、鬼筆環(huán)肽染色液（貨號(hào)CA1317）、DAB顯色液（貨號(hào)CA6307）均購自上海吉至生化科技有限公司；兔源微管相關(guān)蛋白2（MAP2，貨號(hào)ab254264）、RhoA（貨號(hào)ab187027）、ROCK（貨號(hào)ab125025）、細(xì)胞骨架蛋白（F-actin，貨號(hào)ab15135）、絲切蛋白（cofilin，貨號(hào)ab50127）、磷酸化cofilin（p-cofilin，貨號(hào)ab50129）、突觸素（SYP，貨號(hào)ab41125）、突觸后致密蛋白-95（PSD-95，貨號(hào)ab49503）、神經(jīng)營養(yǎng)因子3（NT3，貨號(hào)ab13274）、神經(jīng)生長因子（NGF，貨號(hào)ab80273）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，貨號(hào)ab106497）一抗、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（貨號(hào)ab112548）均購自英國Abcam公司。電子顯微鏡（型號(hào)SIGMA 500）、光學(xué)顯微鏡（型號(hào)SIGMA 1700）均購自昆山友碩新材料有限公司；化學(xué)發(fā)光儀（型號(hào)BHP9504）購自先鋒科技（香港）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥 取105只SD大鼠，參照文獻(xiàn)［5］的方法制備腦出血大鼠模型。腹腔注射2 mL/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，暴露顱骨前囟及冠狀縫，用改良二次注血法，于右側(cè)尾狀核部位注入自體靜脈血50 μL（鼠尾靜脈取血50 μL）：將注射器固定于腦立體定位儀上，進(jìn)針至尾狀核，先在2 min內(nèi)注入20 μL血，留針7 min，繼續(xù)緩慢注入30 μL血（4 min內(nèi)完成），留針10 min，然后緩慢退出注射器?？p合切口后2 h，用Zea-longa評(píng)分法［6］對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分為1～3分，視為造模成功（共成功100只，有3只開顱后死亡，有2只麻醉時(shí)死亡）。按隨機(jī)數(shù)字表法分為：模型組、杜仲葉總黃酮組、RhoA抑制劑組、RhoA激動(dòng)劑組、杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組，每組20只。另取20只大鼠，于右側(cè)尾狀核部位注入等量生理鹽水，設(shè)為假手術(shù)組。

杜仲葉總黃酮組參照文獻(xiàn)［7］按200 mg/kg杜仲葉總黃酮灌胃給藥（生理鹽水稀釋成20 g/L，10 mL/kg給藥）；RhoA抑制劑組參照文獻(xiàn)［8］經(jīng)腹腔注射1 mg/kg RhoA抑制劑Y27632；RhoA激動(dòng)劑組參照文獻(xiàn)［9］經(jīng)腹腔注射30 μg/kg RhoA激動(dòng)劑U-46619；杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組灌胃給予200 mg/kg的杜仲葉總黃酮同時(shí)，經(jīng)腹腔注射30 μg/kg U-46619；模型組及假手術(shù)組灌胃給予10 mL/kg生理鹽水。各組連續(xù)給藥7 d，1次/d。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 末次給藥結(jié)束后，觀察大鼠運(yùn)動(dòng)及精神狀況，并參照文獻(xiàn)［10］采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀進(jìn)行評(píng)估。評(píng)分項(xiàng)目包括提尾試驗(yàn)0～3分，行走試驗(yàn)0～3分、感覺試驗(yàn)0～2分、平衡木試驗(yàn)0～6分、反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng)0～4分，總分以18分計(jì)，評(píng)分越高預(yù)示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.3 腦組織含水量、腦血腫體積百分比檢測 各組隨機(jī)取6只大鼠，麻醉處死后取腦組織，濾紙吸干腦組織表面液體后精密稱質(zhì)量（濕質(zhì)量），100 ℃烘干至恒重（干質(zhì)量）。根據(jù)公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%，以此評(píng)價(jià)腦水腫嚴(yán)重程度。

另外隨機(jī)取6只大鼠，麻醉處死，取完整腦組織，測量完整腦組織體積，之后切成厚度為10 μm的連續(xù)冠狀切片，用Image Pro Plus軟件計(jì)算每張切片的腦血腫面積，根據(jù)公式：腦血腫體積=每張切片腦血腫面積×切片厚度（10 μm）×切片數(shù)，測得腦血腫體積，并計(jì)算腦血腫體積百分比。腦血腫體積百分比=腦血腫體積/完整腦組織體積×100%。

1.2.4 透射電鏡觀察血腫周圍組織神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)變化 麻醉處死各組剩余8只大鼠后，剝離完整腦組織，剪取血腫周圍約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，送入電鏡室處理后，于5 000倍電鏡下觀察神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 TUNEL染色法觀察血腫周圍組織神經(jīng)元凋亡 取血腫周圍約2 mm×2 mm×2 mm組織塊2塊，其中一塊放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另一塊切成厚度20 μm的冰凍切片，取部分切片，進(jìn)行TUNEL染色后，于光鏡下觀察神經(jīng)元損傷及染色變化，每張切片隨機(jī)讀取5個(gè)視野，用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算染色為棕黃色的凋亡細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算神經(jīng)元凋亡率。神經(jīng)元凋亡率=凋亡神經(jīng)元/總神經(jīng)元×100%。

1.2.6 鬼筆環(huán)肽染色觀察血腫周圍組織神經(jīng)元骨架變化 取相同部位血腫周圍組織冰凍切片，復(fù)溫、抗原修復(fù)、0.1%曲拉通透化后，滴加IgG標(biāo)記的MAP2（1︰100）及羊抗兔IgG二抗溶液（1︰200）孵育來標(biāo)記神經(jīng)元，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽溶液標(biāo)記F-actin。室溫避光孵育后，激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin陽性染色情況。用Image Pro Plus 6.0計(jì)算每視野下單位面積內(nèi)F-actin陽性染色的平均光密度值。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測血腫周圍組織RhoA/ROCK通路相關(guān)蛋白和促神經(jīng)元及突觸生長相關(guān)蛋白表達(dá) 取冰凍血腫周圍組織，4 ℃解凍后，機(jī)械粉碎及勻漿處理后提取勻漿液中蛋白。BCA法測濃度后，取40 μg蛋白行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，4 ℃滴加兔源RhoA（1︰200）、ROCK（1︰200）、F-actin（1︰200）、p-cofilin（1︰200）、cofilin（1︰200）、SYP（1︰400）、PSD-95（1︰400）、NT3（1︰400）、NGF（1︰400）及β-actin（1︰800）一抗孵育過夜，滴加羊抗兔IgG二抗（1︰1 300）孵育1.5 h。添加化學(xué)發(fā)光劑顯色，化學(xué)發(fā)光儀拍照。Image J軟件分析蛋白條帶的相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差[（[x] ±s）

]表示，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 假手術(shù)組、模型組、杜仲葉總黃酮組、RhoA抑制劑組、RhoA激動(dòng)劑組、杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為0分、（10.17±1.03）分、（4.98±0.45）分、（5.04±0.51）分、（14.79±1.37）分、（10.09±0.97）分，除假手術(shù)組外的5組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=20，F(xiàn)=391.139，P＜0.01）。假手術(shù)組大鼠活動(dòng)靈敏，飲食及精神狀態(tài)正常；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠精神萎靡，行動(dòng)遲緩及跛行嚴(yán)重，神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠行動(dòng)遲緩、跛行緩解，神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低（P＜0.05），RhoA激動(dòng)劑組大鼠部分出現(xiàn)癱瘓現(xiàn)象，神經(jīng)功能缺損評(píng)分進(jìn)一步升高（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高（P＜0.05）；與RhoA激動(dòng)劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比升高（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比降低（P＜0.05），RhoA激動(dòng)劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比進(jìn)一步升高（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比升高（P＜0.05）；與RhoA激動(dòng)劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比降低（P＜0.05），見表1。

2.3 各組大鼠血腫周圍組織神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)損傷比較 假手術(shù)組大鼠突觸結(jié)構(gòu)清晰，突觸小泡大小均勻，囊泡致密；模型組大鼠突觸結(jié)構(gòu)輪廓不清，突觸小泡變形、破裂或融合明顯；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠可見部分完整突觸小泡，且小泡變形、破裂或融合等結(jié)構(gòu)損傷較輕，RhoA激動(dòng)劑組大鼠突觸結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步加重；杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠突觸結(jié)構(gòu)損傷較杜仲葉總黃酮組加重，見圖1。

2.4 各組大鼠血腫周圍組織神經(jīng)元凋亡及骨架損傷比較 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元染色均勻，僅有少量染成棕黃色的凋亡細(xì)胞，F(xiàn)-actin分布在整個(gè)神經(jīng)元中；與假手術(shù)組相比，模型組可見黃棕色凋亡細(xì)胞染色加深，F(xiàn)-actin在神經(jīng)元中分布減少，細(xì)胞形態(tài)及大小也發(fā)生變化，神經(jīng)元凋亡率升高，F(xiàn)-actin陽性表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠神經(jīng)元凋亡率降低，F(xiàn)-actin陽性表達(dá)升高，RhoA激動(dòng)劑組大鼠神經(jīng)元凋亡率升高，F(xiàn)-actin陽性表達(dá)降低（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠神經(jīng)元凋亡率升高，F(xiàn)-actin陽性表達(dá)降低（P＜0.05）；與RhoA激動(dòng)劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠神經(jīng)元凋亡率降低，F(xiàn)-actin陽性表達(dá)升高（P＜0.05），見表2、圖2。

2.5 各組大鼠血腫周圍組織RhoA/ROCK通路蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達(dá)升高，RhoA激動(dòng)劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與RhoA激動(dòng)劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖3、表3。

2.6 各組大鼠血腫周圍組織促神經(jīng)元及突觸生長相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達(dá)升高，RhoA激動(dòng)劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與RhoA激動(dòng)劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動(dòng)劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖4、表4。

3 討論

3.1 腦出血模型大鼠構(gòu)建成功 腦出血后，血液中的細(xì)胞毒性成分可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及凋亡，另外腦出血后形成的血腫壓迫周圍組織血管，也會(huì)導(dǎo)致腦水腫及神經(jīng)系統(tǒng)損傷［11］。本研究用改良的二次注血法建立腦出血模型，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、運(yùn)動(dòng)困難等神經(jīng)功能缺損癥狀，且神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量、腦血腫體積百分比均顯著升高，血腫周圍組織神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)突觸變形、破裂及融合等損傷嚴(yán)重，提示造模成功。

3.2 杜仲葉總黃酮促進(jìn)腦出血大鼠的神經(jīng)功能修復(fù) 近年來研究發(fā)現(xiàn)，天然總黃酮類成分對(duì)各種腦損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)有促進(jìn)作用［12-13］。杜仲葉中總黃酮為天然黃酮類成分，具有降壓、降脂及抗氧化等多種藥理作用［14］。已有研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)鉛中毒所致的神經(jīng)損傷有改善作用［15］。另有文獻(xiàn)顯示杜仲提取物可通過抑制炎性因子分泌改善大鼠腦缺血再灌注損傷［16］，說明其對(duì)腦部疾病有一定的治療作用。而且，包含杜仲在內(nèi)的益氣復(fù)健湯對(duì)腦出血患者有明顯的治療效果［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉總黃酮干預(yù)治療腦出血大鼠后，大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，血腫周圍組織神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)突觸變性、破裂及融合等結(jié)構(gòu)損傷現(xiàn)象明顯緩解，表明杜仲葉總黃酮對(duì)腦出血后神經(jīng)功能修復(fù)有一定的促進(jìn)作用。本研究對(duì)其促神經(jīng)功能修復(fù)的具體機(jī)制繼續(xù)進(jìn)行探究。

3.3 RhoA/ROCK通路介導(dǎo)杜仲葉總黃酮的促腦出血后神經(jīng)功能修復(fù)作用 RhoA/ROCK通路是參與神經(jīng)元再生、神經(jīng)突觸重塑，介導(dǎo)神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵通路之一［18-19］。Li等［20］研究證實(shí)，阻斷RhoA/ROCK通路活化，可減輕神經(jīng)樹突、軸突的生長抑制作用，促進(jìn)神經(jīng)再生及軸突發(fā)芽，促進(jìn)神經(jīng)的內(nèi)在修復(fù)，改善腦卒中模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能的缺損。本研究發(fā)現(xiàn)腦出血模型大鼠RhoA/ROCK通路處于活化狀態(tài)，其表現(xiàn)為血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)升高，與張昆侖等［21］的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，阻斷腦出血大鼠RhoA/ROCK通路活化，可促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)，改善出血癥狀，反之可加重腦出血癥狀，不利于神經(jīng)元功能恢復(fù)。而杜仲葉總黃酮干預(yù)后，大鼠血腫周圍組織中RhoA/ROCK通路處于抑制狀態(tài)，其腦出血癥狀及神經(jīng)功能損傷得以改善，而在杜仲葉總黃酮干預(yù)的基礎(chǔ)上激活RhoA/ROCK通路后，其改善腦出血癥狀、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)作用被顯著削弱，提示杜仲葉總黃酮可能通過抑制RhoA/ROCK通路活化來改善腦出血模型大鼠的腦出血癥狀、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

大量研究證實(shí)，RhoA在神經(jīng)元發(fā)育、遷移及可塑性中發(fā)揮重要作用，RhoA不僅可激活效應(yīng)分子ROCK，引起細(xì)胞骨架解聚成分cofilin活化并切割F-actin，導(dǎo)致細(xì)胞骨架解聚破壞及重排、肌絲收縮，造成神經(jīng)元及突觸結(jié)構(gòu)改變、生長錐塌陷、軸突再生困難，還能夠影響神經(jīng)元及突觸生長、發(fā)育相關(guān)的因子，如NGF、NT3、PSD-95及SYP等表達(dá)來抑制神經(jīng)元及突觸的再生修復(fù)［22-23］。本研究顯示，杜仲葉總黃酮可顯著提高腦出血大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95及SYP蛋白表達(dá)，激活RhoA/ROCK通路可使杜仲葉總黃酮對(duì)NGF、NT3、PSD-95及SYP蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用得以緩解，提示杜仲葉總黃酮可能通過抑制RhoA/ROCK通路增加促神經(jīng)元及突觸生長相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕腦出血癥狀，加速神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，杜仲葉總黃酮可抑制RhoA/ROCK通路活化，從而改善腦出血大鼠的出血癥狀，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)。這為杜仲葉總黃酮在腦損傷領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供了一定參考，但信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)功能修復(fù)的調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，可能需要機(jī)體內(nèi)多條細(xì)胞信號(hào)通路來協(xié)同調(diào)節(jié)，杜仲葉總黃酮促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的其他機(jī)制還有待深入探究。

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（2022-07-12收稿 2022-09-25修回）

（本文編輯 李鵬）