基于轉(zhuǎn)錄組測序與定量PCR技術(shù)挖掘北沙柳株型相關(guān)候選基因

賀 嶸,趙 愷,賀玉嬌,阿拉騰蘇和,王愛君,寧 靜,韓若霜,孫貴榮,張國盛,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019; 2.鄂爾多斯市造林總場,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 014300; 3.內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)研究院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010013; 4.內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原種苗總站,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

生物體的表型性狀是基因和外界環(huán)境共同作用下的外在體現(xiàn),是可以直接觀測的性狀,受到一個(gè)或多個(gè)基因共同調(diào)控。李忠南等[1]報(bào)道玉米(Zeamays)的分蘗率由4對主基因與多對微效基因功能決定的。主基因決定性狀的穩(wěn)定性,多對微效基因決定該性狀的表現(xiàn)。糯玉米種子的活性,是由1對主基因和幾個(gè)基因協(xié)同調(diào)控的,但以主基因遺傳為主[2]。WRKY家族參與調(diào)控植物的生長發(fā)育等生理過程,擬南芥(Arabidopsisthaliana)中WRKY34與WRKY2共同調(diào)控植物花粉的發(fā)育[3]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子也可以通過調(diào)控HY5的表達(dá)來調(diào)控植物下胚軸的生長發(fā)育[4]。在水稻(Oryzasativa)理想型形成過程中克隆得到IPA1基因,其功能獲得性突變體表現(xiàn)為分蘗數(shù)少、抗倒伏、莖稈粗壯[5],IPA1不僅可以結(jié)合DEP1來調(diào)控水稻的株型與產(chǎn)量,還可以增強(qiáng)水稻的抗病性[6]。植物基因的調(diào)控功能是多方位的,多層次的綜合研究分析對挖掘完善基因功能是十分必要的。植物株型是影響其生物量和利用效率的關(guān)鍵性狀之一,開展株型定向培育的重要意義,已經(jīng)在農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)樹種育種中得到了充分的證明。然而植物株型性狀多數(shù)是數(shù)量遺傳性狀,由多個(gè)彼此獨(dú)立或協(xié)同的基因共同決定的,呈現(xiàn)出增效或減效的作用,采用主效基因的評價(jià)方法,難以實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)。

北沙柳(Salixpsammophila)別稱沙柳或西北沙柳,為楊柳科柳屬的速生、多年生灌木,是中國西北地區(qū)沙產(chǎn)業(yè)的重要資源樹種。北沙柳產(chǎn)于毛烏素沙地和庫布齊沙漠,西北、華北等地區(qū)均有引種栽培。北沙柳根系發(fā)達(dá),繁殖和萌蘗力強(qiáng),抗旱耐貧瘠,抗風(fēng)沙,耐鹽堿,是西北地區(qū)特色樹種,也是“三北”地區(qū)土地荒漠化防治的首選樹種[7]。由于北沙柳是木型材、纖維板、刨花板、造紙、柳編、醫(yī)藥、活性炭等產(chǎn)業(yè)的重要原料,目前已經(jīng)形成了以北沙柳為原料的新興沙產(chǎn)業(yè)鏈。北沙柳的株型呈現(xiàn)直立型、開放型、中間型等特征。不同的利用方式對北沙柳株型的要求不同:作為木材產(chǎn)業(yè)化的原料,理想的株型是通直少(或無)側(cè)枝的直立型;而防沙固土的理想株型是多分枝開散生長的開散型。如何能夠通過現(xiàn)代生物技術(shù),結(jié)合北沙柳生物學(xué)特性,開展快速精準(zhǔn)定向化育種,以滿足沙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要是北沙柳資源精細(xì)化利用的主要問題。

本研究利用定量PCR技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)相結(jié)合的方法,分析水培預(yù)測群體和野外訓(xùn)練群體不同株型無性系基因表達(dá)量的變化特征,以及與株型特征值冠高比的相關(guān)性。創(chuàng)建基于冠高比相關(guān)系數(shù)的北沙柳株型后備基因初步篩選方法,為北沙柳株型定向育種親本篩選提供理論基礎(chǔ),具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究試驗(yàn)材料全部來自于鄂爾多斯市造林總場沙柳國家林木種質(zhì)資源庫的基本群體(2008年種植)和無性系測定林(2017年?duì)I造)。采樣部位為莖的尖端(莖尖)和莖尖以下前3個(gè)節(jié)間的嫩莖(腋芽)。

2021年5月種質(zhì)資源庫的基本群體中篩選9個(gè)北沙柳無性系(即直立型、中間型、開散型各3個(gè))分別采集枝條,在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室(平均溫度27 ℃、平均濕度45%)中進(jìn)行水培構(gòu)成預(yù)測群體,水培2個(gè)月采集莖尖和腋芽。

2021年7月按照生長旺盛、病蟲害少且株型特征有明顯變化的標(biāo)準(zhǔn)從種質(zhì)資源庫的無性系測定林中篩選100個(gè)左右的無性系,標(biāo)記后組成北沙柳訓(xùn)練群體,并采集莖尖和腋芽(液氮低溫保存待用)。

1.2 研究方法

1.2.1 株型特征的調(diào)查

2020年9月和2021年9月分別對無性系測定林中200個(gè)無性系的株高、冠幅(東西向和南北向)、地徑、萌生枝條數(shù)量、葉片特征等指標(biāo)進(jìn)行了調(diào)查,計(jì)算株型特征值冠高比(平均冠幅與高度之比)。兩年計(jì)算獲得的冠高比呈現(xiàn)相同的趨勢,既能體現(xiàn)無性系間的差異,又具有穩(wěn)定性,且具有正態(tài)分布趨勢,是體現(xiàn)株型性狀較理想的特征值(圖1)。

A,2020年;B,2021年。A is the training group in 2020; B is the training group in 2021.圖1 無性系群體冠高比變化趨勢Fig.1 Trends in the ratio of crown and height of training groups

1.2.2 北沙柳株型組的劃分

依據(jù)無性系間冠高比變化特征,按照“冠高比平均值±0.5倍標(biāo)準(zhǔn)差”將從無性系測定林中篩選的97個(gè)北沙柳無性系劃分為6個(gè)株型組(表1)。

表1 北沙柳無性系株型組

1.2.3 RNA的提取及cDNA的合成

采用TIANGEN RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)提取北沙柳腋芽與莖尖的RNA,利用TIANGEN FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,在-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序及預(yù)測值計(jì)算

將水培測試群體(9個(gè)北沙柳無性系)腋芽及莖尖RNA送到基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,獲得40 049條序列,其中與榿柳(Salixpurpurea)對應(yīng)的序列有37 865條,未知序列有2 184條。利用Excel中CORREL的平方計(jì)算所有基因序列的FPKM值與冠高比的預(yù)測值(相關(guān)系數(shù)),相關(guān)系數(shù)0.8～1.0為極強(qiáng)相關(guān),0.6～<0.8為強(qiáng)相關(guān),0.4～<0.6為中相關(guān),0.2～<0.4為弱相關(guān),0～<0.2為極弱相關(guān)(表2)。

表2 部分基因序列的相關(guān)性系數(shù)

1.2.5 目標(biāo)基因的選擇

為了驗(yàn)證目標(biāo)基因在訓(xùn)練群體中的表達(dá)特征,探討預(yù)測值與北沙柳的株型是否相關(guān),本研究的目標(biāo)基因包括已報(bào)道的與北沙柳分枝相關(guān)的基因SpsLAZY1b[8]、SpsTAC2[9],其他植物中與株型相關(guān)的基因ZFP4[10]、TB1[11]、SPA2[12]、ABF2[13]和PYL1[14],以及本研究轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中預(yù)測值較高的ATX1[15]、FHY1[16]和RFK1[17]共10個(gè)基因組成。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)

將從轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選的目標(biāo)基因登錄號在數(shù)據(jù)庫Phytozome 13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中進(jìn)行比對,獲得對應(yīng)的榿柳編碼區(qū)序列,根據(jù)編碼區(qū)序列用Primer3Plus(https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)設(shè)計(jì)引物(表3),引物由擎科公司(北京)合成。

表3 引物序列

1.2.7 定量PCR

將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋3倍作為模板,將UBQ作為內(nèi)參基因,目的基因和內(nèi)參基因均設(shè)置3個(gè)重復(fù),用Roche LightCycler 480 Ⅱ儀器進(jìn)行定量PCR測定。反應(yīng)體系為20 μL,其中TB酶10 μL,cDNA模板1 μL,上下游引物各1 μL,RNase-Free ddH2O 7 μL。程序設(shè)置為95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,45個(gè)循環(huán);95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min;40 ℃ 10 s;4 ℃保存。

基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。首先將性狀明顯、冠高比最小的無性系設(shè)為實(shí)驗(yàn)對照組,ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組ΔCT-對照組ΔCT。

轉(zhuǎn)錄組測序的FPKM值與2-ΔΔCT計(jì)算結(jié)果均表示基因的表達(dá)量,但二者只是表達(dá)量變化的趨勢相同,二者之間沒有關(guān)系[18]。

1.2.8 秩和分析及多元回歸分析

1.2.9 高相關(guān)目標(biāo)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING(https://cn.string-db.org/)對相關(guān)系數(shù)高的目標(biāo)基因分別進(jìn)行蛋白互作分析。通過分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)圖中蛋白結(jié)構(gòu)信息、蛋白與蛋白之間的相互作用以及蛋白與蛋白間的連接程度,來預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 初選目標(biāo)基因預(yù)測值(R2)特征

10個(gè)初選目標(biāo)基因的預(yù)測值在測定群體和訓(xùn)練群體的莖尖中雖然存在差異,但基因表達(dá)量的變化趨勢是相同的。預(yù)測值在測定群體中最高為0.924 4,最低為0.001 0。訓(xùn)練群體中最高為0.185 8,最低為0.000 2,訓(xùn)練群體的預(yù)測值明顯低于測定群體。10個(gè)初選目標(biāo)基因中RFK1、ABF2、TB1的預(yù)測值較低,FHY1、TAC2與冠高比呈正相關(guān)趨勢,其余均為負(fù)相關(guān)(圖2)。

A,水培預(yù)測群體;B,野外訓(xùn)練群體。A, The hydroponic prediction population; B, The field training population.圖2 莖尖中目標(biāo)基因表達(dá)量趨勢Fig.2 Expression trends of target genes in the shoot tips in the hydroponic and training populations

在腋芽中,測定群體的預(yù)測值高于訓(xùn)練群體,基因表達(dá)量具有相同的變化趨勢。預(yù)測值在測定群體中變化范圍為0.034 8～0.858 9,訓(xùn)練群體中為0.051 7～0.595 1。ATX1的預(yù)測值在兩個(gè)群體中均相對較高,TAC2相對較低。FHY1和TAC2的表達(dá)量與冠高比呈正相關(guān),其余都呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(圖3)。

2.2 秩和分析與多元回歸分析

按照6個(gè)株型組對每個(gè)初選目標(biāo)基因表達(dá)量的秩和分析。結(jié)果表明,ATX1在莖尖與腋芽,TAC2、ZFP4、SPA2在莖尖,TB1、ABF2、FHY1、RFK1、PYL1在腋芽均有顯著差異(P≤0.05)(表4)。

表4 目標(biāo)基因秩和分析

六基因組合中,與冠高比相關(guān)系數(shù)為0.769,預(yù)測模型為y=1.176+0.000×ABF2+0.001×PYL1-0.037×RFK1+0.074×FHY-0.089×TB1-0.460×ATX1。在六基因組合中ABF2、PYL1與冠高比的相關(guān)性最小。

所有組合對比發(fā)現(xiàn)ATX1對株型形成貢獻(xiàn)最大,其次為TB1、RFK1、FHY1、ABF2、PYL1。基因組合中雙基因組合(ATX1+FHY1)的相關(guān)性較高(0.740)。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將與冠高比相關(guān)性較高的ATX1、FHY1、RFK1基因進(jìn)行蛋白互作分析,預(yù)測其功能,置信度為0.7(高等),結(jié)果如圖4所示。

A, ATX1; B, FHY1; C, RFK1.圖4 高相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein interaction network of high correlation genes

在ATX1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中,與ATX1直接相關(guān)的基因有HMA5、RAN1、COPT5和HMA6。COPT1-6為銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,ATX1、CCH、CCS為銅伴侶蛋白。銅蛋白CCS可以提供銅離子,ATX1和CCH可將銅離子傳遞給HMA5、RAN1,RAN1再將銅離子整合到乙烯受體里,產(chǎn)生乙烯信號,通過調(diào)控乙烯的合成來影響植物的生長。

在FHY1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中,與FHY1直接相關(guān)的是PHYA基因。COP1、PHYA、CRY1基因可以通過調(diào)控光形態(tài)建成來影響植物的生長。AUX1為生長素受體,FHL和FHY1互為同源蛋白。PIFs是一種光敏色素互作蛋白,可以與赤霉素信號通路中的DELLA蛋白相互作用來調(diào)控植物的生長發(fā)育。

RFK1是與植物育性恢復(fù)有關(guān)的基因,其與調(diào)控植物生長發(fā)育方面的基因互作較少,數(shù)據(jù)支撐較少,但仍具有一定的參考價(jià)值,可能在調(diào)控北沙柳生長發(fā)育方面有著重要作用。

3 討論

3.1 采樣部位的影響

植物的上表型由產(chǎn)生新細(xì)胞和器官的分生組織所形成。莖尖分生組織(SAM)促進(jìn)垂直生長;腋生分生組織(AM)出現(xiàn)在葉腋中,可以產(chǎn)生側(cè)生枝或次生枝。SAM決定了植物葉序,并影響AM的形成[6]。SAM的維持與分化涉及生長素、細(xì)胞分裂素和多肽的復(fù)雜互作,它們協(xié)同調(diào)控植物的株型。張磊等[8]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SpsLAZY1a、SpsLAZY1b沉默時(shí),會(huì)引起側(cè)枝的水平生長,且基因主要在莖和葉腋處表達(dá)。袁夢如等[9]研究發(fā)現(xiàn),TAC2基因與植物的分枝發(fā)育有關(guān),且在莖中表達(dá)最豐富,其次是葉腋。

莖尖與腋芽都是最活躍的生長點(diǎn),但莖尖分生組織的分化能力較強(qiáng),莖尖細(xì)胞會(huì)通過不斷地分裂生長和分化促進(jìn)莖的伸長來影響植物的高生長;腋芽的分化程度較為穩(wěn)定,主要影響植物的分枝。本實(shí)驗(yàn)采樣部位選擇了與株型有關(guān)的莖尖及腋芽。在大群體中通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明,北沙柳莖尖和腋芽均與株型均有一定相關(guān)性,但腋芽與冠高比的相關(guān)系數(shù)更接近預(yù)測值。這可能是因?yàn)榍o尖細(xì)胞較為活躍,會(huì)不斷地進(jìn)行分裂分化和生長,導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的分配主要促進(jìn)植物莖的伸長生長而非分枝的生長。

3.2 SpsLAZY1b、SpsTAC2與株型的關(guān)系

SpsLAZY1b、SpsTAC2已被證明與北沙柳的分枝有關(guān),但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,基因表達(dá)量與北沙柳的冠高比相關(guān)性較小(腋芽中SpsLAZY1b相關(guān)系數(shù)為0.1、SpsTAC2為0.051 7)。LAZY1除了可以調(diào)控分蘗角度外還可以結(jié)合下游基因調(diào)控其他性狀[19]。在玉米中,ZmLAZY1還可以調(diào)節(jié)花序的發(fā)育[20]。LAZY1可能通過調(diào)控一類分子和基因從而調(diào)控大量下游基因的表達(dá)。在LAZY1下游候選基因中,CKX2、TAW1被報(bào)道與水稻的穗粒數(shù)有關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn),在楊樹中LAZY1a基因過表達(dá)會(huì)影響其他基因的表達(dá)量,如TAC2、PIN1、MAX1等基因的表達(dá)量會(huì)高于野生型。TAC的表達(dá)量也受內(nèi)源激素影響,在桃樹中,TAC的表達(dá)量隨著生長素含量的升高而減少[22]。在預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,SpsLAZY1b、SpsTAC2與北沙柳株型相關(guān)性較小,為極弱相關(guān)。這可能是因?yàn)镾psLAZY1b、SpsTAC2在北沙柳株型中為非主效基因,是通過調(diào)節(jié)其他基因間接來影響株型。

3.3 ZFP4、TB1、SPA2、PYL1和ABF2與株型的關(guān)系

ZFP4、TB1、SPA2在其他物種中已被證明是與植物的生長發(fā)育有關(guān)的基因。影響TB1基因表達(dá)的因素有很多,如光照、植物激素等,紅光受體phyB會(huì)抑制TB1的表達(dá),在麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)中赤霉素與細(xì)胞分裂素共同作用對TB1起著負(fù)調(diào)控的作用,促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)[23];在擬南芥中SPA被認(rèn)定為紅光和遠(yuǎn)紅光受體光敏色素信號傳導(dǎo)過程中的下游負(fù)調(diào)控因子,光照強(qiáng)度或紅光、遠(yuǎn)紅光降低時(shí),植物的分枝會(huì)受到抑制[24];秦琳琳等[25]發(fā)現(xiàn),白樺(Betulaplatyphylla)中ZFP4基因含有多個(gè)脫落酸響應(yīng)順式作用元件,通過調(diào)控脫落酸信號途徑來調(diào)控植物的生長;在脫落酸信號通路中,PYL1和ABF2基因起負(fù)調(diào)節(jié)作用,具體來說,它們可以抑制脫落酸受體和脫落酸應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子的活性,從而影響脫落酸信號通路的整個(gè)過程[26]。這一機(jī)制使得PYL1和ABF2基因能夠影響植物的開散程度和直立度。在北沙柳中,水培群體預(yù)測值與訓(xùn)練群體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的趨勢一致,有一定的線性關(guān)系,初步預(yù)測這些基因在北沙柳中同樣可以調(diào)控植物的生長發(fā)育。

3.4 FHY1、ATX1、RFK1與株型的關(guān)系

FHY1、ATX1、RFK1是與北沙柳株型相關(guān)性高的基因。在訓(xùn)練群體實(shí)驗(yàn)結(jié)果中ATX1相關(guān)性最高(0.595 1),RFK1相關(guān)性最低(0.229 3),相關(guān)系數(shù)在0.2～0.6為中等程度的相關(guān)。FHY轉(zhuǎn)錄因子現(xiàn)已證明是遠(yuǎn)紅光信號通路的重要組成部分,在擬南芥中,FHY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)開花時(shí)間、枝條分生組織的發(fā)育等重要生命過程中都具有非常重要的功能[27]。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析可知,FHY1可能通過與光敏色素的相互作用來影響北沙柳的株型,也可能在生長素或赤霉素的影響下調(diào)節(jié)北沙柳的株型;銅是植物生長發(fā)育所需的微量元素,ATX1為銅伴侶蛋白,其作用就是供應(yīng)植物生長所需的金屬離子,將過量的金屬離子排出從而達(dá)到解除重金屬毒害的作用[15]。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析可知,ATX1可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子調(diào)節(jié)銅的濃度來影響北沙柳的生長發(fā)育,也可能通過調(diào)節(jié)乙烯信號來影響北沙柳的生長發(fā)育;RFK1目前在北沙柳上未見報(bào)道,在本研究中腋芽部分的RFK1基因與北沙柳的株型相關(guān)性較高,顯著高于莖尖,這說明RFK1基因作為北沙柳株型的后備基因作用是不可忽視的。

4 結(jié)論

按照“基因個(gè)數(shù)最少,相關(guān)系數(shù)最高”的原則,選擇雙基因組合ATX1+FHY1作為鑒別北沙柳株型的基因,該基因組合與冠高比的相關(guān)性較高,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.740?；蚪M合法是通過基因與北沙柳株型的相關(guān)性構(gòu)建起來的,存在誤差,因此不能完全依靠基因組合的相關(guān)系數(shù)作為北沙柳株型的預(yù)測指標(biāo)。如果想更準(zhǔn)確地預(yù)測北沙柳的株型可適當(dāng)?shù)卦黾踊驍?shù)量,提高基因組合與冠高比的相關(guān)性。

以不同株型北沙柳作為研究材料,從預(yù)測值與訓(xùn)練群體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性來看,利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可以初步篩選北沙柳株型的后備基因。推測相關(guān)性越高,功能基因與目標(biāo)性狀的關(guān)系越密切。通過同一性狀不同表現(xiàn)形式的個(gè)體與功能基因表達(dá)量的關(guān)系,可利用少數(shù)水培個(gè)體的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選目標(biāo)性狀的后備基因。這種方法不但去掉了復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因技術(shù),加快了林木育種效率,同時(shí)還可以提高后備基因的選擇精度。