香蕉皮粉末對黑腹果蠅的引誘活性及揮發(fā)物化學(xué)成分分析

余 帥,黃 俊,應(yīng)俊杰,張 娟,毛雪琴,張治軍,呂要斌,李 ?

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴州 貴陽 550014; 2.省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和浙江省植保生物技術(shù)重點實驗室,浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所,浙江 杭州 310021; 3.仙居縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,浙江 仙居 317300; 4.浙江省園林植物與花卉研究所,浙江 杭州 311122)

香蕉(Musananalour)為芭蕉科多年生草本植物,在我國的產(chǎn)量位于世界前列。香蕉具有豐富的營養(yǎng)和獨特的風(fēng)味,但食用后產(chǎn)生的大量香蕉皮則會造成環(huán)境污染和資源浪費。香蕉皮中含有酚類、油脂類、有機(jī)酸、縮合鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、果膠和糖類等多種化學(xué)成分,具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種生物活性[1-7]。已有研究報道,香蕉果肉對橘小實蠅、黑腹果蠅以及斑翅果蠅成蟲均具有明顯的引誘作用[8-10],其主要活性物質(zhì)為乙酸異戊酯、丁酸異丁酯、丁酸丁酯、2-庚醇-乙酸酯、異戊酸異戊酯、戊酸異戊酯和乙酸辛烯酯[11]。然而,香蕉皮對果蠅類害蟲的引誘效果還知之甚少。

黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)是浙江省楊梅上為害的主要果蠅種類[12],常常將卵產(chǎn)在成熟果肉下,并逐漸孵化而蛀食果肉及汁液,對楊梅果實的產(chǎn)量、品質(zhì)以及保質(zhì)期造成巨大損失,同時還對櫻桃、藍(lán)莓、香蕉、葡萄等其他水果造成嚴(yán)重危害[13-14]。本文以黑腹果蠅作為研究對象,采用固相微萃取技術(shù)(SPME)分別收集存放不同時間的香蕉皮粉末的揮發(fā)物,并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對其揮發(fā)物化學(xué)成分進(jìn)行分析;在此基礎(chǔ)上,通過室內(nèi)行為選擇測試和大田果蠅種群動態(tài)監(jiān)測進(jìn)一步驗證香蕉皮粉末對黑腹果蠅的引誘效果,以期找到一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保及有效的引誘成分,為開發(fā)引誘劑以綠色防控黑腹果蠅提供理論依據(jù),也為開發(fā)香蕉皮的潛在應(yīng)用價值尋求新的解決途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蟲源:黑腹果蠅采自臺州市仙居縣楊梅園,采用人工飼料進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃,相對濕度為(60±5)%,光周期為16 h∶8 h。

飼養(yǎng)條件:溫度23～26℃,相對濕度50%～70%,光周期為14 h∶10 h。本試驗選用腹部隆 起的產(chǎn)卵期雌蟲作為供試蟲源。供試成熟香蕉購自市場,洗凈后用于測試。

1.2 實驗儀器

用到儀器包括手動SPME進(jìn)樣器,100 μm PDMS萃取纖維頭,GC-MS-QP2010Plus型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津)。

1.3 試驗方法

1.3.1 固相微萃取樣品制備

參照前人研究方法,采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS分析香蕉皮粉末中揮發(fā)性化學(xué)成分[15]。在氣相色譜進(jìn)樣口插入固相微萃取纖維頭,在溫度250 ℃下保持10 min。取一定量新鮮香蕉皮,切成小塊狀,放入研缽中研磨成粉狀。然后分別稱取10 g香蕉皮粉末放入15個50 mL的頂空樣品瓶中并密封。每天隨機(jī)選取3組進(jìn)行GC-MS分析,連續(xù)測定5 d。測試時使用100 μm固相萃取纖維頭PDMS進(jìn)行頂空萃取30 min,收集樣品后置于250 ℃解吸3 min進(jìn)樣,并利用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析條件

香蕉皮粉末的GC-MS圖譜經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索,并利用標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫Nist2005和Wiley275確定各揮發(fā)物的化合物結(jié)構(gòu),同時采用峰面積歸一化法確定各成分的相對含量。色譜柱為SH-Rxi-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,初始溫度為45 ℃,保留2 min,以4 ℃·min-1升至180 ℃,再以8 ℃·min-1升至260 ℃,運行60 min。載氣為高純氦氣(99.999%),載氣流量1.74 mL·min-1。質(zhì)譜條件:電子能量70 eV,離子源為EI源,EI源溫度230 ℃,發(fā)射電流34.6 μA,四極桿溫度250 ℃,倍增器電壓1 482V,質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.3.3 室內(nèi)行為測定

參考前人研究植物精油對黑腹果蠅的驅(qū)避和引誘活性的測定方法[16]。本研究采用籠罩法測定在樣品瓶中發(fā)酵1、3、5 d的香蕉皮粉末對黑腹果蠅的行為選擇反應(yīng),以人工飼料作為對照,同時比較發(fā)酵1 d和3 d之間的樣品。每個處理放入香蕉皮粉末或人工飼料的量為5 g,每次放入單獨一只黑腹果蠅成蟲,并觀察5 min,進(jìn)入某一側(cè)的成蟲視為對該側(cè)氣味源具有行為選擇性。再以市售3-甲基丁酸丁酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn),純度>98.0%)作為處理進(jìn)行引誘測試,使用正己烷將3-甲基丁酸丁酯配置成質(zhì)量濃度分別為1、10、100、1 000 μg·mL-1的工作液,分別測定不同質(zhì)量濃度3-甲基丁酸丁酯對黑腹果蠅的引誘活性。每組測定20只黑腹果蠅成蟲,區(qū)分雌、雄蟲,每組4次重復(fù)。

1.3.4 大田動態(tài)監(jiān)測

參照前人研究方法對楊梅果蠅種群發(fā)生動態(tài)進(jìn)行監(jiān)測[17],監(jiān)測時段為4月初至5月中旬,監(jiān)測地點為浙江省臺州市仙居縣浮石園村和西爐村。將香蕉皮研磨成粉末,取10 g置于自制引誘瓶(550 mL蒸餾水瓶并在中上部開孔)中,并選擇掛于楊梅樹不同方位的枝條上。根據(jù)前期室內(nèi)對香蕉皮粉末揮發(fā)物的測定結(jié)果,引誘瓶內(nèi)的樣品每3 d換一次,每個監(jiān)測點設(shè)6個重復(fù),連續(xù)監(jiān)測40 d,并每天觀察和記錄誘瓶內(nèi)黑腹果蠅的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23、Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,行為選擇實驗數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(P<0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果

從處理第1天的香蕉皮粉末中鑒定出19種揮發(fā)性物質(zhì),占總成分的87.56%(圖1-A);從第2天的香蕉皮粉末中鑒定出14種成分,占總成分的89.90%(圖1-B);從處理第3、4、5天的香蕉皮粉末中均鑒定出5種成分,占總揮發(fā)物比例分別為64.86%、69.33%及68.21%(圖1-C、D、E)。隨著處理時間的延長,香蕉皮粉末中的揮發(fā)性物質(zhì)以及含量逐漸發(fā)生變化(表1)。

由表1可以看出,處理第1天的主要成分為3-甲基丁酸丁酯(56.79%)、丁酸(6.30%)、丁酸丁酯(5.36%)、1-甲基丁酸己酯(3.97%)、1-甲基丁酸丁酯(3.24%)、丁酸己酯(2.75%)、3-甲基丁酸丙酯(2.26%)、1-甲基乙酸丁酯(1.69%)以及乙酸異戊酯(0.91%)。第2天的主要成分為3-甲基丁酸丁酯(40.25%)、2-甲基乙酸丙酯(8.62%)、2-甲基丁酸丙酯(7.45%)、1-丁醇-3-乙酸甲酯(7.29%)、1-甲基丁酸丁酯(6.44%)、1-甲基丁酸己酯(6.31%)、3-甲基丁酸丙酯(4.97%)、乙酸仲辛酯(2.37%)、己酸異戊酯(2.10%)、丁酸丁酯(2.04%)、丁酸己酯(1.21%)。第3天的主要成分為正十六烷酸(39.37%)、3-甲基丁酸丁酯(9.62%)、油酸(9.60%)、硬脂酸(3.91%)、十五烷酸(2.36%)。第4天的主要成分有膽固醇(27.11%)、十六烷(25.32%)、壬二烷(12.88%)、癸醛(2.66%)、3-甲基丁酸丁酯(1.36%)。第5天的主要成分為正十六烷酸(20.35%)、癸醛(11.31%)、3-甲基丁酸丁酯(4.32%)、1-甲基十二胺(3.04%)。通過連續(xù)5 d的GC-MS分析結(jié)果表明,香蕉皮粉末揮發(fā)物中的芳香物以酯類居多,并以3-甲基丁酸丁酯為共同成分,處理第1天含量達(dá)到56.79%,第2天降為40.25%,處理第3、4、5天的3-甲基丁酸丁酯的含量分別降至9.62%、1.36%、4.32%。由此可見,隨著處理時間的延長,3-甲基丁酸丁酯的含量發(fā)生顯著性變化。

2.2 室內(nèi)行為選擇測定

2.2.1 香蕉皮粉末對黑腹果蠅雌、雄成蟲的行為選擇

在香蕉皮粉末測試劑量為5 g時,黑腹果蠅雌、雄成蟲的行為選擇結(jié)果如圖2所示。處理第1天的香蕉皮粉末對雌蟲的引誘率為62.50%,而僅有37.50%的選擇對照,二者之間差異顯著(P<0.05);對雄蟲的引誘率為60.00%,而對照為40.00%,二者之間差異顯著(P<0.05)。第3天的行為反應(yīng)結(jié)果顯示,雌、雄蟲選擇香蕉皮粉末的分別為47.50%和50.00%,與之對應(yīng)雌、雄蟲對照組的選擇性分別為52.50%和50.00%,兩兩之間均無顯著差異(P>0.05)。第5天,香蕉皮粉末對雌、雄蟲的引誘活性均顯著低于對照,分別為40.00%和37.50%,有60.00%和62.50%的選擇對照(P<0.05)。進(jìn)一步對處理第1天和第3 天的香蕉皮粉末進(jìn)行行為選擇測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn),處理第1天對雌、雄蟲的引誘率為61.35%和57.50%,而第3天對雌、雄蟲的引誘率為38.80%和42.50%,兩兩之間具有顯著性差異(P<0.05)。

*表示兩者之間差異顯著(P<0.05)。* Indicates significant difference between treatments (P<0.05).圖2 黑腹果蠅雌、雄蟲對香蕉皮粉末的行為選擇Fig.2 Behavioral selection responses of Drosophila melanogaster females and males to banana peel powder

2.2.2 化合物3-甲基丁酸丁酯對黑腹果蠅雌、雄成蟲的行為選擇

由圖3可以看出,3-甲基丁酸丁酯對黑腹果蠅雌、雄成蟲均產(chǎn)生較強(qiáng)的引誘活性,并且隨著質(zhì)量濃度的增大引誘活性增強(qiáng),其中對雌性成蟲的引誘活性高于雄性成蟲;當(dāng)質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1時,3-甲基丁酸丁酯對雌、雄成蟲的引誘率分別達(dá)到71.25%和66.25%。

*、**和***分別表示兩者之間P<0.05、P<0.01和P<0.001。*, ** and *** indicate P<0.05, P<0.01 and P<0.001 between treatments, respectively.圖3 黑腹果蠅雌(A)、雄蟲(B)對不同質(zhì)量濃度3-甲基丁酸丁酯的行為選擇Fig.3 Behavioral selection responses of Drosophila melanogaster females (A) and males (B) to different mass concentrations of butyl isovalerate

2.3 香蕉皮粉末監(jiān)測果蠅動態(tài)

由圖4可以看出,香蕉皮粉末在室外對黑腹果蠅具有較好的引誘活性,兩個監(jiān)測點整個監(jiān)測時期平均每瓶誘到的黑腹果蠅數(shù)量分別為48.83頭和57.33頭,在4月底或5月初達(dá)到高峰期,平均每瓶誘到的黑腹果蠅數(shù)量分別為97.30頭和159.80頭。從圖4中還能看出,這兩個楊梅園的黑腹果蠅發(fā)生動態(tài),即前期數(shù)量呈現(xiàn)較為平穩(wěn)趨勢,而在后期達(dá)到高峰值,其后數(shù)量逐漸降低。

圖4 香蕉皮粉末對黑腹果蠅的大田監(jiān)測效果Fig.4 Field monitoring effects of banana peel powder on Drosophila melanogaster

3 討論

楊梅是我國的一種特有水果,深受人們喜愛,也是受黑腹果蠅為害最嚴(yán)重的水果之一,發(fā)生為害蟲果率高達(dá)60%。當(dāng)前不乏有一些生產(chǎn)者違規(guī)使用農(nóng)藥防治楊梅果蠅,給食品安全帶來了嚴(yán)重隱患。因此,如何綠色防控楊梅果蠅已成為楊梅安全生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急,而通過研發(fā)引誘劑以高效監(jiān)測與誘殺果蠅是實現(xiàn)其綠色防控的有效手段。目前有很多學(xué)者研究香蕉中的活性成分并對其中一些活性物質(zhì)的提取方式不斷優(yōu)化,最終應(yīng)用于害蟲的防控[18-21]。已有研究表明,香蕉不同部位或是組織對昆蟲具有不同程度的引誘性。例如,香蕉花的揮發(fā)性成分對果蠅和家蠅等具有吸引作用[22];香蕉果肉可對橘小實蠅成蟲以及切割潛蠅繭蜂雌、雄成蟲產(chǎn)生明顯引誘活性,而且果實成熟度越高則引誘性越強(qiáng),同時發(fā)現(xiàn)香蕉葉片對這些昆蟲也有一定引誘活性[23-25];剝皮香蕉可對紅棕象甲產(chǎn)生一定的引誘作用,成熟香蕉可對劍麻象甲具有顯著的引誘活性[26-27]。

本研究發(fā)現(xiàn),香蕉皮粉末中主要的揮發(fā)性物質(zhì)為丁酸酯類化合物,其中3-甲基丁酸丁酯含量達(dá)到56.79%。Maia等[28]從菠蘿蜜的香氣揮發(fā)物中鑒定出3-甲基丁酸丁酯,且含量達(dá)到25.6%,保留時間為10.47 min,與本研究結(jié)果存在一定差異,可能是由于升溫條件略有不同所導(dǎo)致。而且隨著處理時間的延長,其含量總體呈遞減的趨勢,第5天的含量降至4.32%,而隨之產(chǎn)生的是癸醛、正十六烷酸等脂肪族類物質(zhì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),處理第1天的香蕉皮粉末對黑腹果蠅雌、雄成蟲均具有顯著引誘性,且雌蟲的選擇反應(yīng)略高于雄蟲,而到第3天和第5天則無引誘活性。而且商品化的3-甲基丁酸丁酯對黑腹果蠅雌、雄成蟲均產(chǎn)生較強(qiáng)的引誘活性,并且隨著質(zhì)量濃度的增大引誘活性增強(qiáng)。因此,我們認(rèn)為香蕉皮粉末在處理短期內(nèi)所釋放的大量3-甲基丁酸丁酯(56.79%)是吸引黑腹果蠅的主要活性物質(zhì)。張璇[29]研究表明,香蕉和草莓中揮發(fā)性成分對黑腹果蠅和斑翅果蠅以及寄生蜂具有引誘活性,乙酸異戊酯、異戊酸乙酯、丁酸異戊酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯均被證明為引誘活性物質(zhì)。此外,香蕉皮原料中揮發(fā)性的丁酸丁酯、丙烯酸丁酯和丙酸丁酯等丁酸酯類化合物對綠盲蝽、黑盲蝽、苜蓿盲蝽和三點盲蝽等蝽屬害蟲均具有引誘活性,而且丁酸丁酯對綠盲蝽產(chǎn)生的引誘活性最強(qiáng)[30-32]。而丁酸丁酯、乙酸丁酯或乙酸異戊酯等活性物質(zhì)對Oplostomusharoldi和黃地老虎雌性成蟲具有吸引作用[33-34],由2-甲基丁酸丁酯、乙酸己酯、己酸丙酯、丙酸己酯、己酸丁酯和丁酸己酯組成的混合物可對蘋果實蠅產(chǎn)生較好的引誘活性[35-36]。

進(jìn)一步通過香蕉皮粉末的野外監(jiān)測試驗發(fā)現(xiàn)其對黑腹果蠅具有較好的引誘效果,該監(jiān)測點黑腹果蠅數(shù)量動態(tài)趨勢表明,4月初期楊梅處于青果時期,黑腹果蠅數(shù)量較少,發(fā)生數(shù)量平穩(wěn),而后期隨著楊梅逐漸成熟,黑腹果蠅逐漸增多,直到后期,其數(shù)量又逐漸下降。來源于自然界的揮發(fā)性成分在害蟲行為調(diào)控和“推-拉”策略防治害蟲中發(fā)揮著重要作用,已有嘗試將香蕉皮和香蕉果肉作為害蟲的引誘劑原料,并與毒餌組合使用,達(dá)到對大蠟螟和德國小蠊等害蟲更佳的誘殺效果[37]。在今后的研究中,可進(jìn)一步以香蕉皮粉末中揮發(fā)物組分作為味源,繼續(xù)深入研究具體化合物對黑腹果蠅的行為以及相關(guān)調(diào)控機(jī)制,更進(jìn)一步發(fā)明出合適的引誘劑和驅(qū)避劑,為開發(fā)植物源潛在引誘劑或與性信息素結(jié)合進(jìn)行種群監(jiān)測和誘殺提供科學(xué)依據(jù)。