大白菜苗期對Pantoea agglomerans抗性鑒定方法的建立與應(yīng)用

李家璽,顧 冉,劉 焱,張耀偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

軟腐病是大白菜結(jié)球期的主要病害,在我國各大白菜產(chǎn)區(qū)都普遍流行,與病毒病和霜霉病并稱為三大病害。大白菜軟腐病病原通常被認(rèn)為是胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum[1](簡稱Pcc),果膠桿菌屬P.aroidearum[2]、P.carotovorumsubsp.brasiliensis[1]、P.carotovorumsubsp.odoriferumhe[3]和P.polaris[4]等細(xì)菌也被鑒定為大白菜軟腐病病原,此外,一種卵菌Pythiumultimumvar.ultimum[5]也可引起大白菜軟腐病。2015年以來在哈爾濱市發(fā)現(xiàn)了一種新型大白菜軟腐病,與Pcc引起的軟腐病相比,短縮莖部位不易腐爛,葉球腐爛后易生側(cè)芽,中肋腐爛部位呈深褐色,且沒有明顯的臭味,腐爛葉片中肋纖維分解較慢,經(jīng)鑒定病原為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)[6]。成團(tuán)泛菌是革蘭氏陰性菌,可以引起包括楊樹枝干潰瘍病[7]、冬棗葉枯病[8]、桃和李細(xì)菌性穿孔病[9]、火龍果細(xì)菌性腐爛病[10]和核桃細(xì)菌性黑斑病[11]在內(nèi)的多種植物病害,但尚無報(bào)道對這些病害的抗性鑒定方法。

抗病育種是大白菜的重要育種目標(biāo)之一,由Pcc引起的軟腐病抗病育種工作已經(jīng)進(jìn)行了多年,很多抗病品種已經(jīng)得到大規(guī)模推廣和應(yīng)用[12-14],而關(guān)于成團(tuán)泛菌引起大白菜軟腐病的抗性鑒定方法尚未見到報(bào)道,抗成團(tuán)泛菌的大白菜種質(zhì)資源還需鑒定。本試驗(yàn)設(shè)置了接種溫度、濕度、苗齡、方法和菌液濃度共5個(gè)接種因素,以分離自哈爾濱市香坊區(qū)大白菜腐爛植株的成團(tuán)泛菌為接種病原,對大白菜成團(tuán)泛菌軟腐病人工抗性鑒定方法和適宜發(fā)病條件進(jìn)行研究,以期建立可在苗期快速鑒定大白菜種質(zhì)資源對成團(tuán)泛菌軟腐病抗性的方法,為新品種選育提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株成團(tuán)泛菌分離自2018年采自黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)向陽鄉(xiāng)的患軟腐病大白菜植株(圖1-a),由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大白菜遺傳育種研究室保存。用于確定最佳接種溫度、濕度、苗齡和方法的供試大白菜品種為CR黃心(青島明山農(nóng)產(chǎn)種苗有限公司生產(chǎn),田間表現(xiàn)為感病),用于確定最佳接種菌液濃度的供試大白菜品種為黃心冠軍(遼寧裕田種業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),田間表現(xiàn)為感病)、凱豐2號(哈爾濱劉元?jiǎng)P種業(yè)有限公司生產(chǎn),田間表現(xiàn)為中抗)和珍亮(天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司生產(chǎn),田間表現(xiàn)為抗病)。用于抗性評價(jià)的大白菜種質(zhì)共20份,包括CR金山(北京東匯盛種業(yè)科技有限公司生產(chǎn))、CR凱旋(北京春奧種苗科技有限公司生產(chǎn))、京春娃4號(京研益農(nóng)種業(yè)科技有限公司生產(chǎn))、黃娃60(北京絡(luò)芙特科貿(mào)有限公司生產(chǎn))、似錦(福州農(nóng)播王種苗有限公司生產(chǎn))和金獎(jiǎng)(北京思貝奇種子有限公司生產(chǎn))共6份雜交種和14份高代自交系(由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院大白菜遺傳育種研究室提供)。

a,成團(tuán)泛菌引起的大白菜軟腐病的田間發(fā)病癥狀。b～f,苗期病情分級示意圖;b,0級;c,1級;d,3級;e,5級;f,7級。a, Symptom of soft rot caused by P. agglomerans on Chinese cabbage. b-f, Diagram of 0, 1, 3, 5 and 7 grade of disease seeding, respectively.圖1 成團(tuán)泛菌引起的大白菜軟腐病田間發(fā)病癥狀與苗期病情分級示意圖Fig.1 Symptom of soft rot caused by P. agglomerans on Chinese cabbage in filed and diagram of disease grades of seeding

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大白菜育苗

土壤經(jīng)121 ℃、0.1 MPa滅菌后裝于8 cm× 8 cm的營養(yǎng)缽中,每缽播種供試大白菜品種種子3粒,并置于溫室中,晝/夜溫度為25～28 ℃/15～18 ℃。十字期每缽留1株壯苗,待幼苗生長至相應(yīng)苗齡時(shí)進(jìn)行接種試驗(yàn)。

1.2.2 接種菌液的制備

取保存于-80 ℃冰箱的菌液,涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上活化,12 h后用無菌涂布棒刮取數(shù)個(gè)單菌落于無菌水中用于接種,接種前使用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整菌液濃度至1×108、1×1010、1×1012CFU·mL-1。

1.2.3 最佳接種溫度的確定

由于該病害多在每年6月下旬至8月中旬流行,故本試驗(yàn)設(shè)計(jì)接種溫度為15～20 ℃、20～25 ℃和25～30 ℃,共3個(gè)水平。每株均選取第2片真葉,在中肋基部接種,每處理接種20株,每處理3次重復(fù),對照組同處理組。除溫度外,其他條件設(shè)置情況為:空氣相對濕度90%,苗齡7～8葉期,接種方式為用刀片輕劃“品”字形小傷口,并滴30 μL 1×1010CFU·mL-1的菌液,對照組滴等量的無菌水。接種后放置于光照培養(yǎng)箱中,接種后第7天調(diào)查發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)發(fā)病等級。

1.2.4 最佳接種苗齡、濕度和方法的確定

確定發(fā)病適宜溫度后,分析濕度、苗齡和接種方法對苗期接種發(fā)病的影響,試驗(yàn)各因素和水平見表1,具體實(shí)施方案見表2。試驗(yàn)接種溫度為25～30 ℃,菌液濃度為1×1010CFU·mL-1,每株接種30 μL菌液。接種后放于光照培養(yǎng)箱中,接種后第7天調(diào)查發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)發(fā)病等級。

1.2.5 最佳接種菌液濃度的確定

為確定合理的接種濃度,配置濃度為1×108、1×1010、1×1012CFU·mL-1的菌液,在上述最佳接種溫度、濕度、苗齡和方法條件下,將菌液接種于3個(gè)田間不同抗性的大白菜品種黃心冠軍、凱豐2號和珍亮上,接種方法同1.2.3節(jié),接種后第5、7和9天分別調(diào)查病情指數(shù)。

1.2.6 病情分級與發(fā)病情況調(diào)查

以腐爛部位延葉柄延伸長度進(jìn)行等級劃分,單株發(fā)病情況分為0級、1級、3級、5級、7級(圖1 b-f)。具體分級為:0級,接種部位不腐爛;1級,出現(xiàn)腐爛且長度<1 cm;3級,1 cm≤腐爛長度<2 cm;5級,2 cm≤腐爛長度<3 cm;7級,腐爛長度≥3 cm。

H=∑(v×n)×100/(N×vmax)。

(1)

式(1)中:H代表病情指數(shù);v代表發(fā)病級代表值;n代表各級病株數(shù);N代表調(diào)查總株數(shù);vmax代表最高級發(fā)病值。

群體分級標(biāo)準(zhǔn):免疫(I),H=0;高抗(HR),0

R=n1/N。

(2)

式(2)中:R代表發(fā)病率;n1代表發(fā)病植株;N代表總株數(shù)。

1.2.7 種質(zhì)抗性評價(jià)

20份大白菜種質(zhì)育苗方法同1.2.1節(jié),按確定的最佳接種溫度、苗齡、濕度、方法和菌液濃度進(jìn)行接種,病情分級和發(fā)病情況調(diào)查方法同1.2.6節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理的病情指數(shù)為3次重復(fù)的平均值,病情指數(shù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換后,使用SAS軟件(v9.4)進(jìn)行差異顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種溫度對大白菜軟腐病發(fā)病的影響

不同接種溫度下大白菜軟腐病苗期病情指數(shù)分析結(jié)果表明,3個(gè)接種溫度下病情指數(shù)差異極顯著,接種溫度為25～30 ℃時(shí)病情指數(shù)最大,為51.87,表明25～30 ℃利于大白菜軟腐病發(fā)病。

2.2 接種苗齡、濕度和接種方法對大白菜軟腐病發(fā)病的影響

由表2可知,9個(gè)處理組合間發(fā)病程度差異較大,發(fā)病率變化幅度為9.33%～91.00%,病情指數(shù)變化幅度為8.56～50.67。其中接種苗齡7～8葉期、濕度90%～100%和用刀片輕劃“品”字形小傷口的組合大白菜發(fā)病率和病情指數(shù)均最高。

病情指數(shù)極差分析結(jié)果(表3)表明,接種苗齡的病情指數(shù)極差最大,其次為接種方法,接種濕度的病情指數(shù)極差最小,表明接種苗齡對大白菜軟腐病苗期發(fā)病情況影響最大,接種方法次之,接種濕度的影響最小。

表3 極差分析結(jié)果

病情指數(shù)方差分析結(jié)果如表4所示,A和C因素的F值均大于F0.01,均達(dá)到極顯著水平;B因素的F值小于F0.01但大于F0.05,達(dá)到顯著水平;說明正交試驗(yàn)中苗齡和接種方法對大白菜成團(tuán)泛菌軟腐病苗期發(fā)病情況影響都較大,濕度對發(fā)病情況影響相對較小,但也是影響發(fā)病的重要因素。方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果基本一致。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)病情指數(shù)方差分析結(jié)果

2.3 接種菌液濃度對軟腐病發(fā)病的影響

由表5可知,用1×1012CFU·mL-1菌液接種后的第7天和第9天,3個(gè)大白菜品種分別表現(xiàn)為感病、中抗和抗病,可以體現(xiàn)出不同品種的抗感差異;用1×108、1×1010CFU·mL-1菌液接種后第5天、第7天和第9天,均不能體現(xiàn)3個(gè)品種間的群體抗感差異。所以1×1012CFU·mL-1為最適宜的菌液接種濃度。第9天時(shí)不同抗性品種間病情指數(shù)差異較大,故選擇接種后第9天調(diào)查最佳。

表5 最佳接種濃度的確定

2.4 種質(zhì)抗性評價(jià)

根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算公式和抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),對20份大白菜種質(zhì)進(jìn)行抗性評價(jià),結(jié)果表明,免疫和高感種質(zhì)數(shù)量為0;高抗種質(zhì)2份,占比10%,分別為似錦、A52-1;抗病種質(zhì)4份,占比20%,分別為CR金山、A94-1、A239-1-1、C62-1-1;中抗種質(zhì)8份,占比40%,分別為CR凱旋、金獎(jiǎng)、A245、C20-121-211、C25-111-121、C70-1-1-1、C80-1、C80-2;感病種質(zhì)6份,占比30%,分別為黃娃60、京春娃4號、A129、C30、C71-1、C79-2。

3 結(jié)論與討論

在蔬菜抗病育種工作中,明確流行病害的病原后,應(yīng)及時(shí)建立抗性鑒定方法,以便明確現(xiàn)有種質(zhì)資源的抗感程度。成團(tuán)泛菌導(dǎo)致的軟腐病發(fā)現(xiàn)較晚,但近些年逐漸呈現(xiàn)流行趨勢,給農(nóng)戶帶來較大損失,在2019年被鑒定為大白菜軟腐病的新病原后,應(yīng)盡快開展抗病育種工作。前人在對綠豆[15]、大白菜[16]和甘藍(lán)[17]等作物的抗性鑒定方法研究中發(fā)現(xiàn),溫度是影響這些作物接種發(fā)病情況的最主要因素。成團(tuán)泛菌的最適生長溫度為30 ℃[6],田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)病季節(jié)溫度約為20～30 ℃。本試驗(yàn)結(jié)果表明,成團(tuán)泛菌最佳接種溫度為25～30 ℃,與該病害大規(guī)模發(fā)生和流行時(shí)的溫度相符合[6]。

在接種苗齡方面,史國立等[18]建立大白菜對Pcc引起的軟腐病抗性鑒定方法時(shí),確定7～8葉期為最佳接種苗齡;田宇等[19]建立生菜細(xì)菌性軟腐病抗性鑒定方法時(shí)也認(rèn)為7～8葉期為最佳接種苗齡。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示,7～8葉期發(fā)病較快,能準(zhǔn)確反映品種的真實(shí)抗病性,與前人研究結(jié)果基本一致。在苗齡相對較小的植株上不易發(fā)病,可能是因?yàn)槠淙~片中肋的細(xì)胞壁纖維素含量較高[20]。

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn),該病在高濕度環(huán)境下易發(fā)生,一般在大雨過后出現(xiàn)流行趨勢。本試驗(yàn)利用光照培養(yǎng)箱控制濕度,結(jié)果表明,相對濕度90%～100%最適宜發(fā)病,可能是因?yàn)闈穸却髸r(shí)傷口不易形成愈傷組織且木栓化慢,利于細(xì)菌侵染。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)接種方法借鑒了Pcc引起的大白菜軟腐病的接種方法。史國立等[18]研究發(fā)現(xiàn),與常規(guī)滴接等方法相比,輕微刺傷后接種發(fā)病效果較好,但用針刺時(shí)傷口較小,不利于細(xì)菌的侵染。成團(tuán)泛菌引起的軟腐病發(fā)病部位主要在葉片中肋,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用刀片輕劃“品”字形傷口發(fā)病情況最好,與史國立等[18]的結(jié)果一致。刺傷時(shí)注意刀尖剛刺入表皮即可,此時(shí)傷口大小適中,利于細(xì)菌侵染且不易木栓化,然后將菌液滴在傷口處形成懸滴,完成接種。另外,本試驗(yàn)選擇第2片真葉中肋接種,可以有效避免在濕度大時(shí)外葉脫落而影響試驗(yàn)結(jié)果,同時(shí)可以更明顯地觀察發(fā)病情況。

接種菌液濃度是抗性鑒定方法中的重要因素。馬燕勤等[21]研究表明,用6.4×108CFU·mL-1的Pcc菌液對甘藍(lán)進(jìn)行離體接種時(shí)發(fā)病最快。本試驗(yàn)采用活體接種,發(fā)現(xiàn)1×1012CFU·mL-1成團(tuán)泛菌懸浮液最適宜接種。濃度低時(shí)發(fā)病情況不佳,可能是因?yàn)榛铙w植株代謝旺盛,很難在短時(shí)間內(nèi)侵染并使植株發(fā)病,適當(dāng)提高濃度可以使植株快速呈現(xiàn)明顯病癥。如果濃度過高全部植株均表現(xiàn)出嚴(yán)重病癥,無法區(qū)分種質(zhì)資源抗病性。

依照本研究建立的抗性鑒定方法對現(xiàn)有種質(zhì)進(jìn)行抗性評價(jià),既可以驗(yàn)證鑒定方法的合理性,也可以明確現(xiàn)有種質(zhì)的抗病情況?？剐栽u價(jià)結(jié)果顯示,6份雜交種和14份高代自交系種質(zhì)的抗性等級和抗性表現(xiàn)與田間觀察結(jié)果基本一致。自交系中鑒定出的1份高抗種質(zhì)和3份抗病種質(zhì)有較大的潛力可作為親本用于選育抗病品種。本試驗(yàn)對大白菜成團(tuán)泛菌軟腐病抗性鑒定方法進(jìn)行初次探討,希望能為我國大白菜抗成團(tuán)泛菌軟腐病種質(zhì)資源篩選和抗病育種提供借鑒。