基于MAGIC群體瓠瓜白粉病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

鐘麗萍,王 尖,吳曉花,汪 穎,吳新義,汪寶根,魯忠富,王華森,*,李國景,*

(1.浙江農(nóng)林大學 園藝科學學院,浙江 杭州 311300; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021)

瓠瓜[Lagenariasiceraria(Molina) Standl.](2n=2x=22)別名葫蘆、夜開花、瓠子、地蒲,最早起源于非洲。瓠瓜在我國常年種植面積超過13萬hm2,產(chǎn)值200多億元,經(jīng)濟效益十分顯著,是我國南方夏季特色蔬菜之一,主要栽培地區(qū)為浙江、福建、湖北、安徽、廣東等南方省區(qū)[1]。

白粉病(powdery mildew, PM)是瓠瓜生產(chǎn)上最主要的病害之一,也是葫蘆科其他瓜類作物中共有的病害,其分布廣泛,流行性強,嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,選育和推廣抗病品種是目前防治白粉病最經(jīng)濟、有效的方法,而挖掘定位抗白粉病基因/QTL、利用白粉病抗性分子標記是加快瓜類抗白粉病品種選育的前提和基礎(chǔ)[2]。當前,其他葫蘆科作物在白粉病抗病基因定位方面都有不同程度的研究。Zhang等[3]將BSA與SLAF-seq方法相結(jié)合,在黃瓜1號和6號染色體上定位到兩個主要的區(qū)間,挖掘到5個黃瓜抗白粉病的候選基因;郝俊杰等[4]構(gòu)建分離群體進行BSA-seq和精細定位,將黃瓜白粉病抗性基因精細定位在5號染色體上位于兩個SSR標記間約238 kb的候選區(qū)段內(nèi),推測區(qū)段內(nèi)TIR-NBS-LRR類基因是重點候選基因;Zhang等[5]利用QTL-seq技術(shù)在韓國黃瓜品種中定位到兩個主效QTL(pm5.2和pm6.1),并找到抗白粉病的候選基因CsGy5G015660,該基因涉及編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RPK2。Cao等[6]在甜瓜第12號染色體上鑒定到新的抗白粉病QTL(qCmPMR-12),RNA-Seq分析表明,MELO3C002434基因是最有可能與抗白粉病相關(guān)的候選基因。另外,研究發(fā)現(xiàn)MLO類基因也是白粉病抗病中的一個大類 。在擬南芥、月季、大麥等植物中已證明某個或多個特定MLO基因突變體能夠引起對白粉病的廣譜抗性[7-9]。而葫蘆科植物中有關(guān)MLO基因的報道較少,目前在甜瓜、黃瓜、南瓜、西瓜中利用生物信息學方法對其MLO基因家族進行了鑒定與分析[10-11],甜瓜中的CmMLO2被發(fā)現(xiàn)可能在白粉病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。但目前僅有少量關(guān)于瓠瓜白粉病抗性的研究報道,除王玲平等[12]開發(fā)了一個白粉病連鎖的SCAR標記,吳曉花等[13]鑒定到2個SNPs與白粉病抗性相關(guān)外,沒有抗病基因被精細定位與克隆。本課題組利用長讀長測序技術(shù)(PacBio、BioNano)構(gòu)建了瓠瓜高質(zhì)量基因組,其contig N50(11.2 Mb)較之前的參考基因組提高了390倍[14]。這為挖掘和定位瓠瓜抗白粉病基因奠定了良好的遺傳基礎(chǔ)。

MAGIC(multi-parent advanced generation inter-cross)群體,是一種較常規(guī)F2、重組自交系等更為復雜的作圖群體。MAGIC群體親本數(shù)目較多、無群體結(jié)構(gòu)干擾、重組豐富,多代雜交能有效打破較長范圍內(nèi)的連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD),可極大提高目標QTL定位精度。Islam等[15]利用GWAS分析11個棉花親本構(gòu)建的MAGIC群體,揭示了GhRBB1_A07基因與棉花優(yōu)良纖維品質(zhì)的功能關(guān)聯(lián);Bossa-Castro等[16]通過GWAS分析水稻的8親本MAGIC群體,檢測到11個和抗病相關(guān)的QTLs;Ravelombola等[17]利用GWAS評估8親本豇豆MAGIC群體的耐鹽性,鑒定到與耐鹽性相關(guān)的SNPs。但至今未有葫蘆科MAGIC群體的相關(guān)研究報道。

本研究利用8個瓠瓜親本構(gòu)建的MAGIC群體,以多代自交后純合的F8代203個株系為材料,通過苗期接種白粉病鑒定不同株系的抗病表型,結(jié)合重測序獲得的基因型數(shù)據(jù)開展GWAS分析,挖掘與白粉病抗性相關(guān)的顯著SNP位點,分析瓠瓜白粉病抗性的候選基因,研究結(jié)果為瓠瓜抗白粉病基因克隆和分子標記輔助育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究中MAGIC群體的8個親本為J083(抗白粉病)、HZCG(感白粉病)、J077、J120、G32、Yaohulu、J104、J098,通過多代人工自交獲得純系F8代203個株系作為研究MAGIC群體的材料(圖1)[18]。

圖1 八個MAGIC群體的親本(A)和MAGIC群體構(gòu)建流程圖(B)Fig.1 Eight MAGIC population parents (A) and MAGIC population construction flow chart (B)

1.2 白粉病抗性表型鑒定

將203份材料的種子在3%鹽酸中浸泡15 min,清水洗凈后在28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽,等種子露白后播于基質(zhì)中,在日光溫室中育苗,待幼苗長至一葉一心期移栽到18 cm×20 cm的塑料花盆內(nèi),每個株系共16株(每盆4株,3個重復,1個對照)。分別在2020和2021年對203個株系的瓠瓜白粉病抗性進行鑒定。白粉病孢子采自浙江省農(nóng)業(yè)科學院海寧試驗基地瓠瓜田白粉病病葉,用蒸餾水將孢子制成1×105mL-1的孢子懸浮液,采用溫室噴霧接種法對二葉一心期的材料進行苗期人工接種鑒定,接種白粉病菌10 d后進行白粉病病情指數(shù)調(diào)查。根據(jù)不同的發(fā)病情況進行病情分級,計算出最后病情指數(shù)。病情指數(shù)公式:

式中:VDI為病情指數(shù),si為發(fā)病級別,ni為相應病級級別的株數(shù),i為病情分級的各個級別,N為調(diào)查總株數(shù)。按照沈鏑等[19]制訂的白粉病病級分級標準,分為0～5級。

1.3 基因型鑒定

使用CTAB法提取新鮮葉片中的DNA,基因組DNA用內(nèi)切酶隨機打斷成短的DNA片段后,進行平末端修復。然后在DNA片段兩端連接dA尾,并連接測序接頭。加上接頭的DNA片段經(jīng)過AMPure XP磁珠進行純化,并選擇300～400 bp的片段進行PCR擴增。建好的文庫經(jīng)過純化、庫檢,采用Hiseq X10 PE150進行雙末端測序?；赑LINK v1.9軟件篩選MAGIC群體的SNP標記,過濾掉MAF<0.05,H>0.1的SNP標記,根據(jù)HZCG參考基因組序列鑒定到221 043個高質(zhì)量的SNPs用于后續(xù)分析(基因組上標記密度為0.059 SNP·kb-1)。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel軟件基于GLM(PCA)、GLM(Q)、MLM(PCA+K)和MLM(Q+K)4種關(guān)聯(lián)分析模型對瓠瓜MAGIC群體白粉病抗性進行GWAS分析,以-lgP≥4為標準篩選顯著相關(guān)的SNP,對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果繪制相應的Manhattan-Plot和QQ-Plot,根據(jù)QQ圖期望P值和預測P值的擬合程度,綜合考慮后選擇GLM(PCA)的模型進行瓠瓜白粉病病情指數(shù)與標記之間的關(guān)聯(lián)分析。

1.5 候選基因的預測和功能注釋

以瓠瓜HZCG為參考基因組,根據(jù)兩年與目標性狀顯著關(guān)聯(lián)且表型解釋率較高的位點的物理位置,兩端各延伸群體的LD衰減距離為邊界確定候選區(qū)間的范圍,根據(jù)瓠瓜基因組數(shù)據(jù)庫的基因注釋信息(http://www.gourdbase.cn/),對候選基因進行預測與功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓠瓜MAGIC群體抗白粉病鑒定結(jié)果

對2020和2021年的203份株系的MAGIC群體材料進行苗期人工接種鑒定,按照病情指數(shù)將所有材料劃分為5種類型:高抗(VDI為0～0.15);抗病(0.150.75)(圖2)。兩年的試驗中均發(fā)現(xiàn)抗白粉病類型的分布呈現(xiàn)正態(tài)分布(圖2、圖3),在2020年和2021年呈現(xiàn)感病和中等抗性的株系占絕大多數(shù),說明白粉病抗性屬于數(shù)量性狀,在MAGIC群體株系間差異廣泛。

A和B分別表示2020年和2021年的表型數(shù)據(jù)。A and B represent phenotype data in 2020 and 2021 respectively.圖2 瓠瓜MAGIC群體白粉病抗性類型Fig.2 Type of powdery mildew resistance in the MAGIC population of bottle gourd

2.2 群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系及連鎖不平衡分析

基于篩選得到的SNP標記,用MEGA軟件進行NJ樹的構(gòu)建, MAGIC群體被分成8個大類(圖4-A)。使用Admixture軟件進行群體結(jié)構(gòu)的推斷,分別假設(shè)樣品的分群數(shù)(K值)為1～12,然后進行聚類。根據(jù)交叉驗證錯誤率(cross-validation error, CV error)來確定最優(yōu)分群數(shù)。當K=8時,CV error最小,所以群體結(jié)構(gòu)將MAGIC群體分成8個亞群(圖4-B和D)。進行主成分分析,獲得各個主成分的方差解釋率及群體在各個主成分中的得分矩陣,可以看出群體的遺傳分類也是分成8個組(圖4-C)。群體分類情況顯示,MAGIC群體8個親本親緣關(guān)系分布合理,雜交后代重組充分,為基因定位的良好群體。MAGIC群體親緣關(guān)系是基于TASSEL軟件中pairwise IBS法計算的,計算得到的K矩陣代表不同材料間的親緣關(guān)系(圖5-A),K矩陣在關(guān)聯(lián)分析中和Q矩陣效果類似,作為關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量用于減少結(jié)果的假陽性。利用PopldDecay軟件對SNP標記之間的R2進行計算,根據(jù)R2估算瓠瓜MAGIC群體的LD水平,LD衰減距離為400 kb左右(圖5-B)。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)

利用Tassel軟件基于GLM(PCA)、GLM(Q)、MLM(PCA+K)和MLM(Q+K) 4種關(guān)聯(lián)分析模型,以評價群體結(jié)構(gòu)(Q)、主成分分析(PCA)和親緣關(guān)系(K)對控制假陽性關(guān)聯(lián)的效果。比較4個模型下觀察到的P值和預期P值之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)MLM(Q+K)和MLM(PCA+K)模型下觀察的P值和預期P值之間偏離程度較大(圖6),可能造成較高的假陽性關(guān)聯(lián)。綜合分析最終選擇GLM(PCA)對瓠瓜MAGIC群體白粉病抗性進行GWAS分析(圖7)。在2020年的數(shù)據(jù)中檢測到204個超過閾值的SNP,在2021年中檢測到50個超過閾值的SNP,經(jīng)過分析篩選,兩年內(nèi)重復檢測到46個顯著相關(guān)的SNP位點(表1),位于瓠瓜4號、5號、6號、7號、8號、10號和11號染色體上,其中33個位于6號染色體上且距離較近,可能位于一個或者兩個QTL內(nèi),33個SNP分布在6號染色體的24～26 MB的位置區(qū)間,其中在6號染色體上這些位點表型變異解釋的范圍為10%～16%。

2.4 候選基因的預測

由于MAGIC群體的LD衰減距離約為400 kb,經(jīng)過與瓠瓜基因組數(shù)據(jù)庫的基因注釋信息(http://www.gourdbase.cn/)進行對比,在顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點上下游400 kb內(nèi)共找到32個與抗病相關(guān)的基因,其中預測有9個基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、有2個是非典型的R蛋白基因編碼跨膜受體蛋白的富含半胱氨酸受體蛋白,還有1個基因是典型的MLO基因(表2),這3類蛋白在前人研究中[20-23]已經(jīng)明確地表明與白粉病抗性相關(guān),后續(xù)還需要進一步實驗去驗證。

表2 候選基因的染色體、位置、基因注釋

3 討論

瓠瓜白粉病主要由白粉菌Podosphaeraxanthii(Sphaerothecafuliginea)引起。在高濕高溫的條件下,患病植株由一開始的粉末斑點逐漸蔓延至一層厚厚的白色粉末。目前生產(chǎn)上主要通過種植抗病品種、施用殺菌劑和輪作種植等方法來解決,但防治效果甚微,易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留的食品安全問題。

瓠瓜作為我國南方地區(qū)夏季重要的特色瓜類蔬菜,在白粉病抗性基因的研究進展目前仍處于起步階段。近年來,隨著瓠瓜上大量的SSR、InDel、SNP標記的開發(fā)以及高密度遺傳圖譜、高質(zhì)量瓠瓜基因組的構(gòu)建[14,24],挖掘和定位瓠瓜抗白粉病基因的條件已經(jīng)成熟。在傳統(tǒng)的QTL定位中,通常使用雙親群體來確定影響表型性狀基因座的基因組位置和效應大小[26-28]。這種方法通常分辨率較低,因為每個位點只分析2個等位基因,且遺傳重組有限。構(gòu)建MAGIC有望獲得更高的遺傳多樣性、更小的單倍型區(qū)域、更高的重組率和更好的定位分辨率[29]。此外,由于高通量SNP基因分型平臺的發(fā)展和統(tǒng)計方法的進步,多親本群體現(xiàn)在對研究人員具有很大的吸引力。本研究是第一次在葫蘆科作物中構(gòu)建MAGIC群體,結(jié)合GWAS分析進行白粉病抗病基因定位。通過構(gòu)建MAGIC可以更加精準、高效定位到抗病基因。

MAGIC群體親本之一的J083是本課題組多年種質(zhì)資源評價中篩選鑒定出的一份優(yōu)異瓠瓜材料,在大多數(shù)瓠瓜品種都不抗白粉病的情況下,J083對白粉病的抗性達到近乎免疫水平。基于抗白粉病種質(zhì)材料J083、感病品種HZCG等8個親本構(gòu)建的MAGIC群體,利用GWAS分析兩年的數(shù)據(jù),篩選出了46個與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的位點,進一步分析預測了12個基因可能與瓠瓜白粉病抗病相關(guān),在已有的相關(guān)報道中這些都是屬于典型的白粉病抗性基因類別,例如Zhang等[5]利用QTL-seq技術(shù)在韓國黃瓜品種中找到抗白粉病的候選基因CsGy5G015660,該基因涉及編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RPK2;Xu等[30]在41.1 kb的區(qū)域掃描到一個顯性遺傳的PM抗性QTL,并從jin5-508衍生的SSSL0.7系中鑒定了兩個富含半胱氨酸的受體樣激酶基因(Csa1M064780和Csa1M064790)作為候選基因;Cheng等[31]從甜瓜中克隆出MLO基因,并命名為CmMLO2,發(fā)現(xiàn)其可能在白粉病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。本研究為克隆抗白粉病基因明確其功能,深入解析瓠瓜抗白粉病的分子機制奠定基礎(chǔ),對瓠瓜抗白粉病分子育種具有重要意義,同時為葫蘆科其他作物的抗白粉病研究提供有力支撐。