溫度與光照強度對蝴蝶蘭光合生理與花序發(fā)育的影響

許申平,袁秀云,張 燕,梁 芳,蔣素華,牛蘇燕,崔 波

(鄭州師范學院 生物工程研究中心,河南 鄭州450044)

蝴蝶蘭(Phalaenopsis)為蘭科蝴蝶蘭屬單軸莖蘭花,在其生長的過程中每節(jié)至少有2個未分化的芽原基以休眠的狀態(tài)存在[1]。當環(huán)境條件適宜的時候,從上往下第3～4片葉腋內的休眠芽從葉鞘內抽出形成花序,花序頂端向兩邊不斷生出小花原基和芽原基[2]。小花原基經(jīng)過大約3個月的時間,從花序軸的第5～6節(jié)開放。芽原基以休眠的狀態(tài)位于蝴蝶蘭花序軸的1～5節(jié)間,該休眠芽是目前進行組織培養(yǎng)獲取種苗的主要材料[3]。在蝴蝶蘭家庭養(yǎng)護中,花朵凋謝后從花序軸基部往上第4～5節(jié)處剪去上部開敗的花朵,花序軸腋芽即可萌發(fā)為1個完整的花序,進行2次開花。由此可見,蝴蝶蘭花序軸腋芽可能屬于未分化分生組織,與主莖葉腋內的休眠芽具有相似特性,對其進行研究可避免破壞植株,研究結果對蝴蝶蘭花期調控也具有重要理論價值。另外,蝴蝶蘭品種多樣,其花序類型因品種不同有很大差異。大花類型蝴蝶蘭花序軸常無分枝,表現(xiàn)為總狀花序;小花類型蝴蝶蘭的花序軸多分枝,變現(xiàn)為復總狀花序。在蝴蝶蘭的工廠化栽培中,花序類型的不可調控性嚴重影響了蝴蝶蘭的觀賞品質,花序軸腋芽是否萌發(fā)是影響蝴蝶蘭花序類型的關鍵,但是關于蝴蝶蘭花序軸腋芽與環(huán)境因子的研究目前還未見報道。

蝴蝶蘭屬于多年生熱帶附生景天酸代謝途徑(crassulacean acid metabolism, CAM)植物[4],必須經(jīng)過一段時間的營養(yǎng)生長才能接受環(huán)境刺激而抽梗開花,自然花期一般在每年的3月前后。蝴蝶蘭典型的年宵花特性使其花期調控成為研究的熱點。經(jīng)過多年研究,目前已發(fā)現(xiàn)溫度是影響蝴蝶蘭開花的首要環(huán)境因素[5-6]。環(huán)境溫度持續(xù)高于29 ℃會抑制蝴蝶蘭花芽的形成[7-8],蝴蝶蘭栽培中常通過提高環(huán)境溫度來延長蝴蝶蘭的營養(yǎng)生長階段,從而獲取高質量開花株[8-9]。與持續(xù)高溫相反,晝夜溫差(如25 ℃/20 ℃,或20 ℃/15 ℃)可以促進蝴蝶蘭的生殖生長[10-11],栽培中常采用人工調控溫度的方式使其按需開花[12]。但長期的人工控溫極大地降低了蝴蝶蘭的利潤空間[11]。隨著研究的深入,光照在蝴蝶蘭花期調控過程中的作用也得到印證[13-14],其中光照強度是影響蝴蝶蘭花芽誘導成功的主要因子之一[15]。較低的光照強度利于蝴蝶蘭進行營養(yǎng)生長,較高的光照強度則利于蝴蝶蘭進行生殖生長。與150 μmol·m-2·s-1的光通量密度相比,20 μmol·m-2·s-1會推遲蝴蝶蘭的花芽分化[16]。

到目前為止,雖然溫度與光照在蝴蝶蘭花期調控中的研究較多,但僅限于單一因素對蝴蝶蘭花芽誘導的影響,關于溫度與光照強度互作的研究并未見報道。本研究以蝴蝶蘭品種大辣椒開花株為試驗材料,通過調控溫度與光照強度對蝴蝶蘭光合作用、生理、花序軸腋芽發(fā)育形態(tài)和解剖結構進行研究,以期為蝴蝶蘭生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以蝴蝶蘭大辣椒(Phalaenopsis‘Big Chili’)開花株為材料,從下往上留1個花序軸腋芽,剪除上部花序,把只有1個蝴蝶蘭花序軸腋芽的植株放入人工氣候箱里進行處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

共4個處理:(1)低溫強光(晝夜溫度24 ℃/18 ℃,光通量密度為200 μmol·m-2·s-1);(2)低溫弱光(晝夜溫度24 ℃/18 ℃,光通量密度為30 μmol·m-2·s-1);(3)高溫強光(晝夜溫度30 ℃/28 ℃,光通量密度為200 μmol·m-2·s-1);(4)高溫弱光(晝夜溫度30 ℃/28 ℃,光通量密度為30 μmol·m-2·s-1)。每個處理均選取長勢一致的蝴蝶蘭100株。

試驗于2021年8月在鄭州師范學院蘭花工程研究中心的人工氣候培養(yǎng)箱(Percival LT-36VL,美國)中進行,培養(yǎng)箱相對濕度75%,光照時間為12 h。用花多多1號提供肥料供給,稀釋3 000倍,每株施用200 mL,每周用1次。在處理7、14、21、28、35 d時,選取上部完全展開的功能葉(從上到下第2片葉,下同)中部進行氣體交換參數(shù)的測定,并于相應的處理階段采集葉片組織,用液氮速凍后于-80 ℃保存,用于生理生化指標的測定。

1.2.2 光合參數(shù)測定

于22:00—24:00,利用便攜式光合作用測定儀Li-6400(美國LI-COR公司),在各自處理的環(huán)境條件下測定蝴蝶蘭葉片的凈CO2吸收速率和氣孔導度(stomatal conductance,Gs)。每個發(fā)育階段測定5個植株,每個葉片重復3次。

1.2.3 生理參數(shù)測定

利用80%丙酮測定葉綠素含量[17];用蒽酮比色法測定蝴蝶蘭葉片的總可溶性糖含量[18];淀粉含量的測定參照Zapata等[19]的方法;葉片可溶性蛋白含量的測定參考Bradford[20]的方法。

1.2.4 花序軸腋芽形態(tài)與解剖結構觀察

在試驗處理的第35天,取蝴蝶蘭花序軸腋芽的芽點,用去離子水沖洗,剝去苞片,用50% FAA固定液(50%乙醇450 mL+冰醋酸25 mL+40%甲醛25 mL)固定。采用常規(guī)石蠟制片法,用LEICA_ASP200S全密封式組織脫水機脫水,用LEICA_EG1160組織包埋機包埋,用Leica RM2245旋轉切片機切片,切片厚度8 μm,用番紅固綠二重染色,用加拿大樹膠封片,在鳳凰PH100-3B41L-IPL顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS v15.0軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性,使用SigmaPlot 11.0和Excel 2010軟件繪制圖片。

2 結果與分析

2.1 溫度與光照對蝴蝶蘭葉片凈CO2吸收速率和Gs的影響

在蝴蝶蘭花序軸腋芽發(fā)育過程中,溫度與光照對蝴蝶蘭葉片的凈CO2吸收速率和Gs都有顯著影響(圖1)。在2個溫度條件下,強光條件下蝴蝶蘭葉片的凈CO2吸收速率均高于弱光條件下。溫度對凈CO2吸收速率的影響因光照強度不同而有顯著差異,在相同的光照條件下,高溫利于蝴蝶蘭葉片進行CO2氣體的吸收。隨著試驗的進行,蝴蝶蘭葉片凈CO2吸收速率始終保持高溫強光>低溫強光>高溫弱光>低溫弱光的趨勢。

LT-HL,低溫強光處理;LT-LL,低溫弱光處理;HT-HL,高溫強光處理;HT-LL,高溫弱光處理。無相同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。LT-HL, Low temperature with high light intensity treatment; LT-LL, Low temperature with low light intensity treatment; HT-HL, High temperature and high light intensity treatment; HT-LL, High temperature with low light intensity treatment. Data marked without the same lowercase letter indicated significant differences among treatments at P<0.05. The same as below.圖1 溫度與光照對蝴蝶蘭大辣椒葉片凈CO2吸收速率和氣孔導度的影響Fig.1 Effects of temperature and light intensity on net CO2 absorption rate and stomatal conductance in Phalaenopsis ‘Big Chili’ leaves

氣孔是空氣中CO2進入植物體內和植物體內水分蒸發(fā)的主要通道,對植物來說有著至關重要的作用。溫度與光照對蝴蝶蘭葉片的Gs也有顯著影響,在試驗處理的初期,高溫條件下葉片的Gs顯著高于低溫條件,隨著試驗處理的進行,蝴蝶蘭葉片的Gs和凈CO2吸收速率呈現(xiàn)相似的變化趨勢,高溫強光條件下的Gs顯著大于低溫強光條件,但低溫弱光和高溫強光條件下則沒有顯著差異。

2.2 溫度與光照對蝴蝶蘭葉片葉綠素含量的變化

葉綠素是植物進行光合作用的主要光合色素。溫度和光照強度對蝴蝶蘭葉綠素含量有不同的影響,如圖2所示,在低溫條件下,強光可促進葉綠素含量的積累,在高溫條件下,弱光則促進葉綠素含量的積累。在強光條件下,葉綠素含量在高溫和低溫之間的差異不顯著,在弱光條件下,高溫促進了葉綠素含量的積累。在整個試驗處理的過程中,高溫弱光條件下的葉綠素含量都高于其他處理組。

數(shù)據(jù)以鮮重計。下同。Data was detected based on fresh weight. The same as below.圖2 溫度與光照強度對蝴蝶蘭大辣椒葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of temperature and light intensity on chlorophyl content in Phalaenopsis ‘Big Chili’ leaves

2.3 溫度與光照對蝴蝶蘭葉片碳水化合物含量的影響

碳水化合物是植物光合作用的重要產(chǎn)物,也是植物進行營養(yǎng)生長與生殖生長的重要調控信號。如圖3所示,蝴蝶蘭葉片的碳水化合物含量在不同處理條件下具有一定的差異,強光條件可以促進蝴蝶蘭葉片碳水化合物含量的積累。對于可溶性糖含量來說,在處理的第7天,4個處理的可溶性糖含量都較低,在隨后的處理中,強光促進了蝴蝶蘭葉片可溶性糖含量的積累,其中低溫強光處理下的可溶性糖含量最大,平均為15.49 mg·g-1,高溫強光下的可溶性糖含量平均為11.04 mg·g-1;弱光條件下可溶性糖含量為3～9 mg·g-1,顯著低于強光處理。對于淀粉含量來說,強光處理下蝴蝶蘭葉片淀粉含量顯著高于弱光處理。在整個試驗處理過程中,高溫強光條件下的淀粉含量一直維持較大值,平均含量為17.54 mg·g-1,其次為低溫強光條件,平均含量為14.60 mg·g-1。

圖3 溫度與光照對蝴蝶蘭大辣椒葉片碳水化合物含量的影響Fig.3 Effects of temperature and light intensity on the carbohydrate contents in Phalaenopsis ‘Big Chili’ leaves

2.4 溫度與光照對蝴蝶蘭葉片可溶性蛋白含量的影響

在不同溫度和光照條件下,蝴蝶蘭大辣椒葉片的可溶性蛋白含量有顯著差異。與碳水化合物的變化趨勢一樣,強光可以促進蝴蝶蘭葉片可溶性蛋白含量的積累。在試驗處理的過程中,蝴蝶蘭葉片的可溶性蛋白含量變化呈現(xiàn)高溫強光>低溫強光>高溫弱光>低溫弱光的趨勢。在處理的第28天和第35天,高溫強光條件下蝴蝶蘭葉片的可溶性蛋白含量顯著高于其他處理,比低溫弱光條件下分別高96%和156%(圖4)。

圖4 溫度與光照強度對蝴蝶蘭大辣椒葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effects of temperature and light intensity on the soluble protein content in Phalaenopsis ‘Big Chili’ leaves

2.5 蝴蝶蘭花序軸腋芽的發(fā)育形態(tài)與解剖結構特征

蝴蝶蘭花序打頂之后,花序軸腋芽開始萌發(fā)。在不同的溫度和光照條件下,花序軸腋芽發(fā)育的形態(tài)有顯著差異(圖5)。在低溫強光條件下,蝴蝶蘭花序軸腋芽萌動伸長,逐漸露出節(jié)間,先端有鱗片包裹,顏色呈現(xiàn)褐紅色(圖5-A1)。觀察顯微結構發(fā)現(xiàn),該處理下腋芽發(fā)育為完整的花序,頂端的花序分生組織飽滿圓潤,向兩側分化圓球狀小突起,即為花序的側花原基,側花原基進一步變寬增大,繼而從邊緣分化出突起,即為花萼原基(圖5-A2);在花序的最下面,有2個圓柱形的休眠芽,倘若條件合適,可發(fā)育為次生花序。在處理的第35天,低溫強光下蝴蝶蘭花序軸腋芽發(fā)育為具有次生花序的完整花序,發(fā)育進程位于花萼原基分化期。

A,低溫強光;B,低溫弱光;C,高溫強光;D,高溫弱光。IM,花序分生組織;FM,花分生組織;SE,花萼分生組織;PE,花瓣分生組織;DB,休眠芽;CO,合蕊柱原基;VC,生長錐;YL,幼葉。A, Low temperature and high light intensity; B, Low temperature and low light intensity; C, High temperature and high light intensity; D, High temperature and low light intensity. IM, Inflorenscence meristem; FM, Floral meristem; SE, Sepal meristem; PE, Petal meristem; DB, Dormant bud; CO, Column primordium; VC, Vegetative cone; YL, Young leaf.圖5 溫度與光照對蝴蝶蘭大辣椒花序軸腋芽發(fā)育的影響Fig.5 Effects of temperature and light intensity on the axillary bud development of flower stalk in Phalaenopsis ‘Big Chili’

在低溫弱光處理條件下,蝴蝶蘭花序軸腋芽生長較慢,外觀形態(tài)與低溫強光條件下相似,但是生長較低溫強光條件下慢,且顏色呈綠色(圖5-B1)。觀察顯微結構發(fā)現(xiàn),該處理誘導的腋芽仍發(fā)育為花芽,發(fā)育過程和低溫強光相似,但下部節(jié)間分生組織沒有形成典型的休眠芽,而且進程晚于低溫強光,腋芽僅發(fā)育到花原基分化期(圖5-B2)。

在高溫強光處理下,蝴蝶蘭花序軸腋芽生長較快,在處理的第35天,外觀已能看到分化的節(jié)間和花蕾,外觀顏色呈現(xiàn)褐紅色(圖5-C1)。顯微結構觀察發(fā)現(xiàn),腋芽發(fā)育頂端仍在進行花原基、花萼原基和花瓣原基的分化,對可見花蕾進行解剖發(fā)現(xiàn),花蕾已進入蕊柱和花粉塊的分化期(圖5-C2)。

在高溫弱光處理下,腋芽的發(fā)育與其余3個處理明顯不同。該處理下腋芽發(fā)育非常緩慢,在處理的第35天,僅表現(xiàn)為芽體膨大(圖5-D1),當繼續(xù)在該條件下處理2個月,可發(fā)育為幼苗(圖5-D3)。顯微結構下可觀察到腋芽為典型的葉芽,芽體中央有一個芽軸,其頂端染色較深的地方為生長錐,緊鄰生長錐的下方周圍有葉原基,遠離生長錐的葉原基已經(jīng)發(fā)育長大為幼葉包圍著生長錐(圖5-D2)。

3 結論與討論

CAM植物占高等植物的6%～7%[21],因夜間氣孔打開固定CO2的特殊方式,而導致其光合生理的研究相對較少。蝴蝶蘭為典型的CAM植物[4,22],夜間吸收CO2,還原為蘋果酸儲存于細胞的液泡中;白天,液泡里的蘋果酸脫羧釋放CO2進入卡爾文循環(huán)。白天的脫羧反應屬于光依賴反應[23],光照不足導致的脫羧不完全,會抑制夜間氣孔的開放,從而影響蝴蝶蘭的凈CO2吸收速率。本研究中,弱光條件下蝴蝶蘭葉片的凈CO2吸收速率顯著低于相應的強光處理,該結果與C3植物中發(fā)現(xiàn)的光照強度降低會導致光合速率的下降[24-25]的結果一致。溫度對CAM植物凈CO2吸收速率的影響因品種不同而有顯著差異,一般認為,涼爽的夜溫(15～20 ℃)和晝夜溫差有利于CAM植物蘋果酸的夜間積累[26];但本研究卻發(fā)現(xiàn),高溫(晝夜:30 ℃/28 ℃)條件下蝴蝶蘭葉片的凈CO2吸收速率顯著高于低溫(晝夜:24 ℃/18 ℃)條件,相似的研究結果在蝴蝶蘭滿天紅的研究中也得到證實,28 ℃條件下植株葉片CO2吸收速率顯著高于17 ℃條件下[27],目前對于這一現(xiàn)象的主要原因還不清楚,可能主要是由于蝴蝶蘭原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū),28 ℃的夜溫仍屬于適宜生長的溫度。

葉片是蝴蝶蘭感受低溫的主要器官,把去掉葉片的蝴蝶蘭植物放在低溫環(huán)境下處理并不能誘導產(chǎn)生花芽[28]。因此,蝴蝶蘭葉片光合產(chǎn)物的含量與其花芽的發(fā)育具有緊密的關系。碳水化合物既是光合作用的主要產(chǎn)物,又是蝴蝶蘭由營養(yǎng)生長向生殖生長轉化的重要能量物質[29-30]。對蝴蝶蘭大辣椒來說,強光顯著促進了光合產(chǎn)物的積累,這與葉片的凈CO2吸收速率的研究結果一致。但在溫度與光照強度互作條件下,蝴蝶蘭葉片的碳水化合物含量變化趨勢與凈CO2吸收速率并不一致,高溫強光下蝴蝶蘭葉片的凈CO2吸收速率顯著高于其他處理,而低溫強光下蝴蝶蘭葉片具有較高的可溶性糖含量和淀粉含量。在成花過程中,葉片作為“源”是干物質積累的主要器官,花芽作為“庫”是能量消耗的主要器官,植株通過改變體內的“能量分配”關系來平衡“源-庫”的關系,改變同化物質在各器官的供應[31]。在蝴蝶蘭花芽發(fā)育過程中,花芽的碳水化合物含量顯著高于葉片[30,32]。本研究中,高溫強光下蝴蝶蘭花序軸腋芽發(fā)育進程較快,光合作用形成的產(chǎn)物可能大多分配到花芽中;而且,葉片中碳水化合物的不足會增強葉片的光合能力,這與高溫強光下蝴蝶蘭葉片的凈CO2吸收速率較高相一致。

前期研究結果表明,蝴蝶蘭花序軸腋芽在花序形態(tài)建成初期就已形成[32]?；ㄐ蜉S腋芽的萌發(fā)與品種的遺傳特性緊密相關,大花型蝴蝶蘭的花序軸腋芽在成花過程中以休眠的狀態(tài)存在,小花型蝴蝶蘭花序軸腋芽常發(fā)育為次生花序。此外,芽原基的發(fā)育也受到環(huán)境因素的調控。CO2濃度升高會增加蝴蝶蘭花序的側枝[33],尤其是CO2濃度升高與強光照互作[34],但高溫會降低花序的分枝[35]。本研究與已有的研究結果有顯著差異,以剪除花序的方式來抑制頂端優(yōu)勢以促進花序軸腋芽萌發(fā)。在本研究的4個處理下,花序軸腋芽均能正常萌發(fā)生長,但不同的環(huán)境條件下腋芽發(fā)育的機制和進程完全不同:在高溫弱光處理下,蝴蝶蘭腋芽進行營養(yǎng)生長,發(fā)育為植株幼苗;在其他3個處理中,雖然發(fā)育進程有所差異,但從發(fā)育形態(tài)和解剖結構來看,腋芽皆進行生殖生長,發(fā)育為花序進行二次開花。大部分研究已證明,溫度和光照是影響蝴蝶蘭營養(yǎng)生長與生殖生長的主要環(huán)境因子[7,16,27,36],本研究也進一步印證了這一結論。本研究中,高溫強光條件下,蝴蝶蘭花序軸腋芽仍進行生殖生長,并能夠形成完整的花部形態(tài),這與以往的研究結果并不一致[7-8]。An等[7]認為,白天持續(xù)12 h的高溫(29 ℃)能充分促進蝴蝶蘭的營養(yǎng)生長,完全防止花序的發(fā)生;Newton等[8]認為,持續(xù)高溫(>29 ℃)8 h就能阻止部分蝴蝶蘭品種開花。這一結論相違背的主要原因可能有2種情況:一是,本研究以蝴蝶蘭花序軸腋芽為試驗材料,該腋芽屬于花序的附屬器官,在花序形成的過程中有可能已經(jīng)完成了生殖誘導,在條件適宜的情況下就萌發(fā)生長,但在高溫弱光的條件下,發(fā)生了發(fā)芽逆轉的情況;二是,本研究中的高溫條件下設置了每天12 h 200 μmol·m-2·s-1的光通量密度,在溫度與光照強度共存的條件下,較強的光照強度有可能優(yōu)先促進蝴蝶蘭花序軸腋芽完成花芽誘導,以進行正常的生殖生長。蝴蝶蘭花芽逆轉的研究發(fā)現(xiàn),28 ℃的環(huán)境溫度會導致早期分化(長度<5 cm)的蝴蝶蘭花芽發(fā)生逆轉的現(xiàn)象,但花芽分化后期(長度>10 cm),28℃的環(huán)境溫度并不會影響蝴蝶蘭的生殖發(fā)育,而且會加速花芽的生長而提早開花[2,13,37]。蝴蝶蘭品種豐富,每個品種之間具有一定的特性差異,為探索高溫強光對蝴蝶蘭成花誘導的具體影響機制,在后期的研究中,可以選用成熟的蝴蝶蘭植株為試驗材料,以排除花序軸腋芽有可能早期發(fā)育的情況。倘若較強的光照強度能夠減弱高溫對蝴蝶蘭成花的抑制作用,將對以后蝴蝶蘭的生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟意義。

目前,以花序軸腋芽為試驗材料進行蝴蝶蘭成花誘導的研究還處于初級階段,該發(fā)育機制與成熟植株的研究結果是否一致,還需要進行更廣泛和深入的研究。如果能夠以花序軸腋芽的發(fā)育來闡述蝴蝶蘭的花芽誘導機制,將改變早期花芽分化對蝴蝶蘭植物破壞性損傷的現(xiàn)狀,為蝴蝶蘭花期調控提供豐富的經(jīng)濟有效的試驗材料。