重組牛皰疹病毒1型轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與初步應(yīng)用

戴莎莎,馬小靜,王景松,田興苗,王健霖,李繼東

(寧夏大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,寧夏 銀川,750021)

關(guān)鍵字：牛皰疹病毒1型;同源臂;轉(zhuǎn)移載體;同源重組

牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是由牛皰疹病毒1型(Bovineherpesvirus1, BHV-1)引起的一種接觸性傳染病,主要引起牛高熱、呼吸困難和上呼吸道炎癥等癥狀[1]。IBR的傳染源主要為帶毒病畜,可通過飛沫、交配、接觸傳播和吸血昆蟲傳播,病畜在自然條件下可不定期向外界排毒。牛是BHV-1自然感染的唯一宿主,以肉牛最為易感[2],奶牛次之。由于缺乏有效的治療方法和抗病毒藥物,接種疫苗仍是防止BHV-1傳播流行最有效的方法[3]。

傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗存在免疫原性低或者減毒不充分等缺點(diǎn),而基因工程疫苗彌補(bǔ)了這部分缺點(diǎn)。皰疹病毒可以作為病毒載體插入多個(gè)外源基因序列,誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生廣泛的免疫反應(yīng),不僅可以誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫,還可以誘導(dǎo)特異性的黏膜免疫應(yīng)答[4]。王子書等[5]利用細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)技術(shù)和病毒拯救技術(shù)在火雞皰疹病毒(Herpesvirusofturkey, HVT)基因組中插入雞傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus, IBDV)的VP2基因,以及新城疫病毒(Newcastlediseasevirus, ND)的F基因,獲得了共表達(dá)NDV和IBDV保護(hù)性抗原基因的重組HVT;Feng等[6]將非洲豬瘟病毒(Africanswinefevervirus, ASFV)的CD2V基因插入到TK、gE、gI基因缺失的偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)基因組中,為ASF疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ);Shao等[7]將NDV的F基因插入到缺失US9基因的雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectiouslaryngotracheitisvirus, ILTV)基因組中,得到重組毒ILTV-ΔUS9-F,且重組病毒的生長特性與親本病毒相似;Aligholipour Farzani等[8]構(gòu)建了表達(dá)重組牛皰疹病毒4型N蛋白的質(zhì)粒,并通過小鼠致死性攻毒試驗(yàn)驗(yàn)證了其對(duì)BALB/c小鼠的免疫原性和保護(hù)潛力。

經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組病毒需要構(gòu)建一個(gè)轉(zhuǎn)移載體,大部分轉(zhuǎn)移載體只能用于一次特定的病毒重組。為了便捷地進(jìn)行BHV-1的同源重組,筆者擬設(shè)計(jì)、構(gòu)建一個(gè)能用于BHV-1重組的轉(zhuǎn)移載體,采用雙向CMV啟動(dòng)子分別控制標(biāo)記基因GFP(綠色熒光蛋白基因)和外源抗原基因的表達(dá),引入多克隆位點(diǎn)便于選擇插入不同同源臂作為重組位點(diǎn)。構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體將方便BHV-1的重組,并以此研究基因功能和研發(fā)重組病毒活載體疫苗,為IBR的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株菌株與細(xì)胞

BHV-1 HVRI-002病毒株、BVDV NADL病毒株和牛腎(Madin-Darby bovine kidney, MDBK)細(xì)胞均由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存,DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑

DNA/RNA提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、DNA Marker DL 2000、6×loading buffer購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;DNA凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品;氨芐青霉素鈉購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;LB培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技公司;pVAX1質(zhì)粒為Invitrogen公司產(chǎn)品,pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒為Clontech公司產(chǎn)品,由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存;兔抗BVDV E2抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 BHV-1轉(zhuǎn)移載體prPgP的構(gòu)建

在pVAX1質(zhì)粒序列第753位堿基處設(shè)計(jì)上游引物,第695位堿基處反向設(shè)計(jì)下游引物,引物中引入酶切位點(diǎn),用NsiⅠ酶切后構(gòu)建質(zhì)粒pVAX1-1,缺失部分多克隆位點(diǎn);以pVAX1質(zhì)粒131～735位互補(bǔ)序列為模板設(shè)計(jì)上、下游引物,引物中引入酶切位點(diǎn),擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子和部分酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)序列rCMV;以質(zhì)粒pVAX1-1為模板,在第1位堿基處設(shè)計(jì)上游引物,在2 960位堿基處反向設(shè)計(jì)下游引物,引物中引入酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增目的片段pVAX1-2;rCMV和pVAX1-2用SalⅠ、XmaⅠ雙酶切后連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒prPP;以pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增GFP基因,用AflⅡ、NheⅠ雙酶切后連接于prPP,得到重組質(zhì)粒prPgP(圖1)。利用Prime premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,序列見表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以pVAX1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增pVAX1-1、rCMV,以pVAX1-1為模板擴(kuò)增pVAX1-2。以pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GFP。PCR退火溫度見表1。

表1 prPgP載體構(gòu)建引物序列與酶切位點(diǎn)

prPP 多克隆位點(diǎn)(MCS)Ⅰ:SalⅠ, NsiⅠ, BglⅡ, EcoRⅠ, PstⅠ, EcoR V, NotⅠ, XhoⅠ, XbaⅠ, ApaⅠ; prPP 多克隆位點(diǎn)(MCS)Ⅱ:ClaⅠ, SaIⅠ, BspEⅠ, BamHⅠ, KpnⅠ, HindⅢ, AflⅡ, PmeⅠ, NheⅠ, XmaⅠ。prPP multiple cloning site (MCS) Ⅰ: SalⅠ, NsiⅠ, BglⅡ, EcoRⅠ, PstⅠ, EcoR V, NotⅠ, XhoⅠ, XbaⅠ, ApaⅠ; prPP multiple cloning site (MCS) Ⅱ: ClaⅠ, SaIⅠ, BspEⅠ, BamHⅠ, KpnⅠ, HindⅢ, AflⅡ, PmeⅠ, NheⅠ, XmaⅠ.圖1 載體prPgP構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of construction of universal vector prPgP

1.4 BHV-1 p△gErPgP-E2載體的構(gòu)建

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與目的片段擴(kuò)增

利用Prime premier 5.0軟件,根據(jù)BHV-1全基因組(AJ004801.1)、BVDVE2基因序列(M31182.1)設(shè)計(jì)引物,序列見表2,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。取BHV-1和BVDV病毒液,用Omega基因組提取試劑盒提取病毒基因組。對(duì)BVDV基因組進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以BHV-1 DNA為模板擴(kuò)增重組同源臂gEL、gER序列,以BVDV cDNA為模板擴(kuò)增E2基因。PCR退火溫度見表2。用DNA凝膠純化回收試劑盒回收PCR目的產(chǎn)物,儲(chǔ)存于-20 ℃。

表2 p△gErPgP-E2質(zhì)粒引物序列與酶切位點(diǎn)

1.4.2 p△gErPgP-E2重組質(zhì)粒構(gòu)建

用BamHⅠ、HindⅢ酶切g(shù)EL片段,用PstⅠ、EcoRⅤ酶切g(shù)ER片段,依次將同源臂gEL和gER插入prPgP的多克隆位點(diǎn)Ⅰ(multiple cloning site, MCSⅠ)和MCSⅡ中;用BglⅡ、PstⅠ酶切BVDVE2基因,將E2連接到正向CMV啟動(dòng)子下的MCSⅡ中。重組質(zhì)粒圖譜見圖2。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

圖2 重組載體p△gErPgP-E2構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematic diagram of construction of recombinant vector p△gErPgP-E2

1.5 BHV-1重組病毒的產(chǎn)生與鑒定

1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將MDBK細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞長滿底部70%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)基,用磷酸緩沖鹽液(PBS)洗滌后加入500 μL BHV-1病毒液,37 ℃恒溫吸附2 h后棄去病毒液,再次用PBS洗滌后加入2 mL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基。p△gErPgP-E2質(zhì)粒質(zhì)量濃度為440 ng·μL-1,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量為2 500 ng。轉(zhuǎn)染步驟如下:

(1)稀釋Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑:125 μL opti-MEM和3.75 μL Lipofectamine 3000混合;(2)稀釋質(zhì)粒:將5.7 μL質(zhì)粒加入125 μL opti-MEM中,再加入5 μL P3000混合均勻;(3)將稀釋的轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)?；靹?室溫靜置10～15 min;(4)向6孔板中加入質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物,37 ℃孵育6 h后換成含2% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的Dulbecco’s改良培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM),繼續(xù)培養(yǎng)2～4 d。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%左右時(shí)收集細(xì)胞和培養(yǎng)液,于-80 ℃保存。

1.5.2 重組病毒純化

將收獲的細(xì)胞和培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次,按10-1～10-4梯度進(jìn)行稀釋,接種至長滿單層MDBK細(xì)胞的96孔板中,37 ℃培養(yǎng)2 h后換為含2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基,48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察,收集熒光較多的細(xì)胞孔連續(xù)進(jìn)行稀釋、接種、培養(yǎng),直到整個(gè)細(xì)胞孔全部呈現(xiàn)熒光。獲得的重組病毒命名為rBHV-1-△gE/E2。

1.5.3 重組病毒PCR鑒定

收集重組病毒培養(yǎng)液,提取基因組DNA,分別設(shè)計(jì)針對(duì)缺失的gE基因、標(biāo)記基因GFP、外源基因E2的引物,進(jìn)行PCR以鑒定重組病毒的特征(表3)。

表3 重組病毒PCR鑒定引物序列

1.5.4 重組病毒與野毒株TCID50測(cè)定

分別將親本病毒和重組病毒倍比稀釋,設(shè)置10-1～10-10共10個(gè)稀釋梯度,接種于長滿單層MDBK細(xì)胞的96孔板中,于24、48、72 h后分別觀察細(xì)胞病變情況。用Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。

1.5.5 重組病毒體外生長曲線測(cè)定

用24孔板培養(yǎng)MDBK細(xì)胞,接種重組病毒。于12、24、36、48、60、72 h收集細(xì)胞和培養(yǎng)液,分別測(cè)定其TCID50,繪制病毒生長曲線。

1.5.6 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)

將MDBK細(xì)胞鋪于6孔板中,待細(xì)胞長滿底部70%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌后加入500 μL rBHV-1-△gE/E2重組病毒液和BHV-1親本病毒液,37 ℃吸附2 h后棄去病毒液,換成含2%胎牛血清的DMEM,37 ℃培養(yǎng)24 h后取出,進(jìn)行以下IFA試驗(yàn)。

(1)用PBS洗滌細(xì)胞后加入1 mL 4%多聚甲醛,37 ℃固定30 min,用PBS洗滌3次。(2)加入1 mL 1% Triton-100溶液,37 ℃透膜20 min,用PBS洗滌3次;(3)加入1 mL 2% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)溶液,37 ℃封閉1 h,用PBS洗滌3次;(4)加入1 mL 1∶400倍稀釋的兔抗BVDV E2,4 ℃孵育過夜,用PBS洗滌3次;(5)加入1 mL 1∶50倍稀釋的羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔IgG,37 ℃避光孵育1 h,用PBS洗滌3次,于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 prPgP載體目的片段PCR結(jié)果

PCR擴(kuò)增出的pVAX1-1、rCMV、pVAX1-2和GFP預(yù)期大小分別是2 966、629、2 984、738 bp,結(jié)果符合預(yù)期(圖3)。

M1,DL5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,pVAX1-1;M2,DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);2,rCMV;3,pVAX1-2;M3,DL1000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);4,綠色熒光蛋白基因。M1, DL5000 DNA marker; 1, pVAX1-1; M2, DL2000 DNA marker; 2, rCMV; 3, pVAX1-2; M3, DL1000 DNA marker; 4, GFP gene.圖3 prPgP載體目的片段PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products of PRPGP vector target fragment

2.2 重組質(zhì)粒prPP和prPgP的酶切鑒定

將重組質(zhì)粒prPP用SalⅠ、XmaⅠ雙酶切,得到大小約2 966 bp和623 bp的兩條帶;將重組質(zhì)粒prPgP用AflⅡ、NheI雙酶切得到大小約3 582 bp和720 bp的兩條帶,均與預(yù)期結(jié)果一致(圖4),說明載體構(gòu)建成功。

M,DL5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,prPP用SalⅠ、XmaⅠ雙酶切;2,rCMV;3,pVAX1-1;4,prPgP用AflⅡ、NheⅠ雙酶切;5,GFP基因;6,prPP。M, DL5000 DNA marker; 1, Enzymatic cleavage of PrPP with SalⅠ and XmaⅠ; 2, rCMV; 3, pVAX1-1; 4, Enzymatic cleavage of prPgP with AflⅡ and NheⅠ; 5: GFP gene; 6: prPP.圖4 prPP、prPgP重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid prPP and prPgP by double restriction enzyme digestion

2.3 同源臂gE L、gE R和E2的擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增的重組上下游同源臂gEL和gER產(chǎn)物大小和預(yù)期相符,分別為654、795 bp,BVDVE2基因大小約1 156 bp,與預(yù)期相符(圖5)。

M1,DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,gE L片段;M2,DL1000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);2,gE R;3,E2基因。M1, DL2000 DNA marker; 1, gE L; M2, DL1000 DNA marker; 2, gE R; 3, E2 gene.圖5 p△gErPgP-E2質(zhì)粒目的片段PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of PCR product of p△gErPgP-E2 plasmid target fragment

2.4 重組質(zhì)粒p△gErPgP-E2的酶切鑒定

將p△gELrPgP用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切,得到大小約4 302 bp和654 bp的兩條帶;將p△gErPgP用PstⅠ、EcoRⅤ雙酶切得到約4 956 bp和795 bp的兩條帶,將p△gErPgP-E2用BglⅡ、PstⅠ雙酶切得到約5 751 bp和1 156 bp的兩條帶,所有酶切產(chǎn)物大小均符合預(yù)期(圖6)。

M,DL5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,p△gELrPgP用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切;2,p△gELrPgP;3,rCMV;4,p△gErPgP用PstⅠ、EcoRⅤ雙酶切;5,p△gErPgP;6,gE R片段;7,p△gErPgP-E2用BglⅡ、PstⅠ雙酶切;8,p△gErPgP;9,BVDV E2。M, DL5000 DNA marker; 1, Enzymatic cleavage of p△gELrPgP with BamHⅠ and HindⅢ; 2, p△gELrPgP; 3, rCMV; 4, Enzymatic cleavage of p△gErPgP with PstⅠ and EcoRⅤ; 5, p△gELrPgP; 6, gE R; 7, Enzymatic cleavage of p△gErPgP-E2 with BglⅡ and PstⅠ; 8, p△gErPgP; 9, BVDV E2.圖6 p△gErPgP-E2質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.6 Identification of p△gErPgP-E2 plasmid by double restriction enzyme digestion

2.5 重組載體的測(cè)序結(jié)果

重組質(zhì)粒prPP、prPgP和p△gErPgP-E2經(jīng)DNA測(cè)序,結(jié)果和預(yù)期一致。

2.6 重組病毒的純化結(jié)果

重組病毒培養(yǎng)液經(jīng)10倍系列稀釋、連續(xù)傳代篩選后,在熒光顯微鏡下不同代次重組病毒的綠色熒光差異明顯。隨著培養(yǎng)代次的遞增,表達(dá)GFP的重組病毒占比逐漸增加,培養(yǎng)至第9代后得到全部呈現(xiàn)熒光的重組毒株rBHV-1-△gE/E2(圖7)。

2.7 重組病毒的PCR鑒定

將培養(yǎng)至第9代的重組病毒rBHV-1-△gE/E2接種于MDBK細(xì)胞中進(jìn)行增殖,提取病毒基因組,用引物擴(kuò)增缺失的gE基因,沒有獲得目的條帶;擴(kuò)增GFP標(biāo)記基因和外源抗原E2基因獲得了預(yù)期的擴(kuò)增條帶(圖8)。鑒定結(jié)果表明,重組病毒rBHV-1-△gE/E2中的gE基因已經(jīng)缺失,并攜帶了標(biāo)記基因GFP和外源抗原基因E2,同時(shí)證明重組病毒中不含親本病毒,獲得了rBHV-1-△gE/E2的純培養(yǎng)物。

M1,DL500 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,重組病毒GFP鑒定;2,GFP陽性對(duì)照;3,GFP陰性對(duì)照;M2,DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);4,重組病毒缺失gE片段鑒定;5,gE陰性對(duì)照;6,gE陽性對(duì)照;7、8,重組病毒E2鑒定;9、10,E2陽性對(duì)照;11,E2陰性對(duì)照。M1, DL500 DNA marker; 1, Identification of GFP in recombinant virus; 2, GFP positive control; 3, GFP negative control; M2, DL2000 DNA marker; 4, Deletion identification of gE fragment in recombinant virus; 5, gE positive control; 6, gE negative control; 7 and 8, Identification of E2 in recombinantvirus; 9 and 10, E2 positive control; 11, E2 negative control.圖8 重組病毒PCR鑒定Fig.8 PCR identification of recombinant virus

2.8 TCID50測(cè)定

根據(jù)測(cè)定結(jié)果(表4、表5),BHV-1親本病毒滴度約為104TCID50·μL-1,重組病毒滴度約為103.5TCID50·μL-1。

表4 BHV-1的TCID50測(cè)定結(jié)果

表5 rBHV-1-△gE/E2的TCID50測(cè)定結(jié)果

2.9 體外生長曲線測(cè)定

病毒生長曲線如圖9所示,親本病毒和重組病毒沒有明顯差異,證明gE基因缺失和外源基因的插入對(duì)病毒增殖無顯著影響。

2.10 BVDV E2表達(dá)的鑒定

將重組病毒rBHV-1-△gE/E2接種MDBK細(xì)胞 24 h后,進(jìn)行IFA試驗(yàn)。熒光顯微鏡下可見重組病毒感染細(xì)胞后呈現(xiàn)明亮的紅色熒光,表明E2基因成功表達(dá)(圖10)。

A,重組毒株rBHV-1-ΔgE/E2感染細(xì)胞的熒光情況;C,親本病毒BHV-1感染細(xì)胞的熒光情況;B、D分別是A、C對(duì)應(yīng)的明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)。A is the fluorescence of recombinant strain rBHV-1-ΔgE/E2 infected cells; C is the fluorescence of parental virus BHV-1 infected cells; B and D are the cell morphology under bright field corresponding to A and C, respectively.圖10 重組病毒接種MDBK細(xì)胞IFA結(jié)果(100×)Fig.10 IFA result of MDBK cell inoculated with recombinant virus (100×)

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因工程疫苗技術(shù)日漸成熟,其中病毒活載體疫苗是當(dāng)今與未來疫苗研制與開發(fā)的重要方向之一[4]。BHV-1作為活病毒載體具有多種優(yōu)勢(shì),包括安全性好、能夠插入多個(gè)外源基因、宿主范圍窄、能夠?qū)⒉《究乖苯映蔬f到黏膜表面激發(fā)特異性的黏膜免疫反應(yīng)等[9]。所以,用BHV-1作為活病毒載體研制疫苗來控制牛病具有很大優(yōu)勢(shì)。

經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組病毒需要構(gòu)建一個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體,這個(gè)載體必須包含與重組位點(diǎn)一致的上下游同源臂,根據(jù)需要還可攜帶外源基因[10]。鑒于以往BHV-1重組轉(zhuǎn)移載體的使用范圍不夠廣泛,每次重組都需要重新構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體,筆者設(shè)計(jì)、構(gòu)建了一個(gè)可廣泛應(yīng)用于重組BHV-1的轉(zhuǎn)移載體。在質(zhì)粒pVAX1 CMV啟動(dòng)子的反向位點(diǎn)引入一個(gè)反向CMV啟動(dòng)子,通過PCR反應(yīng)在反向啟動(dòng)子下引入多克隆位點(diǎn),構(gòu)建了能夠?qū)崿F(xiàn)雙向表達(dá)外源基因的載體prPP,進(jìn)一步在反向啟動(dòng)子下插入GFP標(biāo)記基因,方便重組病毒的篩選,所得轉(zhuǎn)移載體命名為prPgP。由于在正、反向啟動(dòng)子下都有多克隆位點(diǎn),prPgP可以方便地插入用于重組的同源臂序列,還可以根據(jù)需要選擇不同的標(biāo)記基因和外源抗原基因。

本研究利用構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體prPgP,進(jìn)一步構(gòu)建在BHV-1gE基因位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的轉(zhuǎn)移載體,以驗(yàn)證其應(yīng)用的便捷性。首先在prPgP中插入重組位點(diǎn)的同源臂gEL和gER,利用同源重組將BHV-1中的gE基因缺失,同源臂的長度需控制在1 000 bp左右;長度過長會(huì)導(dǎo)致后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)受到影響,過短則會(huì)影響B(tài)HV-1基因組識(shí)別[11]。構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體p△gErPgP-E2攜帶了GFP標(biāo)記基因和BVDVE2抗原基因,標(biāo)記基因和目的基因分別位于gE缺失部位中2個(gè)方向相反的啟動(dòng)子下,獨(dú)立控制2個(gè)外源基因的表達(dá),互不干擾,保證了表達(dá)后重組蛋白的天然結(jié)構(gòu)[12]。對(duì)于本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體,今后可通過優(yōu)化同源臂的長度,改變標(biāo)記基因和外源基因的種類進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。例如王銀[13]利用BHV-1表達(dá)BVDV的E2基因,馮軍科等[14]利用BHV-1表達(dá)牛呼吸道合胞體病毒G蛋白基因,任憲剛等[15]利用BHV-1表達(dá)O型口蹄疫病毒VP1基因等,這些都可以用prPgP轉(zhuǎn)移載體實(shí)現(xiàn)。此外,本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體還可以用于不同BHV-1基因缺失毒株的構(gòu)建,為相關(guān)基因功能的研究提供方便。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建的prPgP含有2個(gè)獨(dú)立的CMV啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn),可方便地用于BHV-1不同位點(diǎn)的同源重組,以研究BHV-1的基因功能;同時(shí)獲得了能夠獨(dú)立表達(dá)2個(gè)外源基因的重組BHV-1,后續(xù)可用該病毒研制活載體疫苗,達(dá)到“一苗多用”的疫病防控目的。