不同月齡新西蘭兔肝中差異蛋白質(zhì)鑒定與驗證

劉方程,王 峰,畢冬琳,楊東亮,楊曉莉,柏家林,李瓊毅,*

(西北民族大學 a. 生物醫(yī)學研究中心,生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室;b. 生命科學與工程學院,甘肅 蘭州 730030)

兔出血癥病毒(Rabbithaemorrhagicdiseasevirus, RHDV)是兔出血癥(rabbit haemorrhagic disease, RHD)的病原體,又名兔瘟。1984年,我國首次報道了兔出血癥的流行,在之后的12個月內(nèi)中國約有1.4億只家兔因兔出血癥死亡[1]。該疾病在短時間內(nèi)傳播到約50萬km2的區(qū)域,并且在接下來的10年里,該病毒在全球范圍內(nèi)傳播,嚴重威脅世界范圍內(nèi)養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展[2-6]。

成熟RHDV為單股正鏈RNA病毒,呈球形,直徑約32～35 nm,無包膜,表面有典型的杯狀凹陷[7]。RHDV基因組全長約7.5 kb,含有2個重疊的開放閱讀框(ORF),ORF1編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60和7個非結(jié)構(gòu)蛋白[p16、p23、解旋酶、p29、VPg、蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)][8];ORF2則編碼次級結(jié)構(gòu)蛋白VP10[9]。根據(jù)VP60基因組序列,RHDV可分為GⅠ和GⅡ兩個基因群:GⅠ包括GⅠ.1～GⅠ.4共4種基因型,其中GⅠ.1(RHDV1)和GⅠ.2(RHDV2)是兔感染RHD的主要病原體,GⅠ.3和GⅠ.4無致病性;GⅡ包括歐洲棕兔綜合征病毒(EBHSV)和與EBHSV相關(guān)的非致病性兔杯狀病毒(Harecalicivirus, HaCV)[10]。

成年兔對GⅠ.1型RHDV易感,死亡率達90%以上;但2月齡幼兔感染后發(fā)病率較低,3周齡幼兔不發(fā)病[1]。幼兔對RHDV的易感性隨年齡的增加而增加,直到9周齡其發(fā)病率、死亡率與成年兔一樣[11-12]。幼兔對GⅠ.1型RHDV的天然抗病機制尚不明確,但可能與幼兔和成年兔肝結(jié)構(gòu)功能不同[12-13]及固有免疫應(yīng)答差異相關(guān)[14-16]。目前,由于沒有適宜體外復制增殖的細胞系,RHDV致病機制等相關(guān)研究進展緩慢。正因為幼兔對其存在天然抵抗性,故尋找并分析關(guān)鍵的差異蛋白質(zhì)對RHDV易感性的影響將為其致病機制研究和疫苗研發(fā)帶來新突破。本文運用串聯(lián)質(zhì)譜標記(tadem mass tags, TMT)定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)和生物信息學分析對2周齡幼年兔和6月齡成年兔肝中差異蛋白質(zhì)進行分析,旨在從蛋白質(zhì)水平闡明成年兔和幼年兔對RHDV易感性差異的分子機制,為研究RHDV易感染宿主細胞的潛在靶點和RHDV體外擴增細胞系的構(gòu)建提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

未接種RHDV疫苗的2周齡幼年和6月齡成年新西蘭兔各3只,購自甘肅省水思圓智能科技工程有限公司。將兔用空氣栓塞法處死,解剖采集肝組織,切成1 cm×1 cm×1 cm大小方塊,用錫箔紙包裹,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。兔腎細胞系RK-13購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC);TMT分子標記試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、乙醇、甲酸、乙腈、丙酮、納升級肽段分析柱(75 μm×250 mm)和HSPA9兔單克隆抗體均購自美國賽默飛世爾科技公司;4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三氟乙酸(TFA)和甲酸銨均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)和測序級胰蛋白酶(Trypsin)購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司;三乙基碳酸氫銨(TEAB)和25%氨水購自上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司;Sep-Pak C18除鹽柱(100 mg)和高pH反相色譜柱均購自上海沃特世有限公司;尿素購自美國英杰生物技術(shù)有限公司;KRT8鼠單克隆抗體、KRT18鼠單克隆抗體、ACAT1兔單克隆抗體、ALDH1A1兔單克隆抗體和GAPDH鼠單克隆抗體均購自Abcam公司;SLBP兔單克隆抗體、山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP購自上海睿鉑賽生物科技有限公司;Hyper Signal高敏ECL發(fā)光底物購自北京四正柏生物科技有限公司;磷酸緩沖鹽液(PBS,pH值7.2～7.4)、10×電轉(zhuǎn)液、RIPA裂解液和TBST緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 蛋白質(zhì)提取、酶解

將-80 ℃保存的肝組織研磨后加入1.0 mL裂解液,放于冰上超聲破碎10 min,4 ℃、20 000×g離心30 min,取上清液,使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒對蛋白質(zhì)進行定量檢測。吸取100 μg蛋白質(zhì)溶液,添加1 mol·L-1三乙基碳酸氫銨(TEAB)至100 μL,加入二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)至終濃度為0.1 mol·L-1,56 ℃還原1 h,加入碘乙酰胺(IAA)至終濃度0.55 mol·L-1,室溫避光孵育1 h;加入預冷丙酮沉淀蛋白質(zhì),離心收集沉淀;加入1 mL 50%丙酮、50%乙醇溶液混懸沉淀,-20 ℃沉淀3 h以上;離心、收集沉淀,加入100 μL 1 mol·L-1TEAB溶液復溶沉淀,加入胰蛋白酶37 ℃反應(yīng)12 h,酶解蛋白質(zhì)懸浮液。

1.3 肽段標記

根據(jù)TMT分子標記試劑盒說明書對每個樣品肽段進行標記,將TMT試劑溶于150 μL異丙醇,取100 μg樣品肽段,加入已溶解的TMT試劑,于室溫下反應(yīng)2 h后,加入100 μL超純水終止反應(yīng);隨后將樣品離心,真空冷凍干燥。

1.4 標記肽段除鹽

將標記后的干燥樣品溶于400 μL 0.1% TFA、0.5%乙腈溶液,使用200 μL 0.1% TFA、60%乙腈活化除鹽柱,加入400～600 μL 0.1% TFA、1%乙腈溶液平衡除鹽柱,將重溶樣品加入除鹽柱內(nèi),使樣品緩慢流過除鹽柱,標記肽段被除鹽柱捕集,鹽和其他非疏水性小分子流出、舍棄。再添加200 μL 0.1% TFA、0.5%乙腈溶液清洗除鹽柱,洗去殘留鹽類。添加300 μL 0.1% TFA、60%乙腈溶液,使液體緩慢流過除鹽柱,將肽段洗脫下來,使用新EP管收集洗脫溶液。最后將洗脫溶液冷凍干燥,去除乙腈。

1.5 反相色譜分離與質(zhì)譜

用Waters公司的H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)進行分離,高pH流動相A為pH值10.0的0.1 mol·L-1甲酸銨,高pH流動相B為pH值10.0的0.1 mol·L-1甲酸銨、90%乙腈,色譜柱為超高效色譜柱(BEH C18 1.7 μm, 2.1 mm×150 mm),上樣量50 μL,流速250 μL·min-1,215 nm紫外光譜檢測。結(jié)束色譜分離后,用Q Exative質(zhì)譜分析肽段。離子源噴霧電壓為2.0 kV,Q Exative質(zhì)譜儀加熱毛細管設(shè)定溫度為320 ℃,采用數(shù)據(jù)依賴模式自動在MS和MS/MS間切換采集。條件設(shè)置:最大進樣時間50 ms,全掃描分辨率17 500 FWHM,MS/MS分辨率50 000 FWHM,母離子掃描范圍110～2 000 m/z,碰撞能量30 eV。

1.6 蛋白質(zhì)鑒定和定量檢測

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入到Proteome Discoverer(PD)軟件(version 1.4.0.288, Thermo Fisher Scientific)后,軟件先對質(zhì)譜圖進行篩選。PD軟件提取后的譜圖用Mascot(version 2.3.2, Matrix Science)進行搜索,搜索結(jié)束后PD軟件根據(jù)Mascot搜索結(jié)果和質(zhì)譜圖進行定量分析。蛋白質(zhì)組學原始數(shù)據(jù)庫已通過iProX存儲庫存入國際蛋白質(zhì)組學共享聯(lián)盟(ProteomeXchange),項目ID號為IPX0005504001。

1.7 生物信息學分析

1.7.1 GO功能注釋

使用NCBI BLAST+軟件和Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)對篩選出的差異蛋白質(zhì)進行搜索,然后利用GO進行定位和注釋。

1.7.2 KEGG通路注釋

將篩選出的差異蛋白質(zhì)在京都基因與基因組百科全書Pathway數(shù)據(jù)庫(KEGG)(www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進行對比,對目標蛋白質(zhì)進行KO歸類,并獲取目標蛋白質(zhì)序列參與的通路信息。

1.7.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks, PPI)分析

利用IntAct(http://www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml)和STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫查找差異蛋白質(zhì)之間的直接和間接相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.2.1軟件進一步分析功能性蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并計算每種蛋白質(zhì)的豐度以評估蛋白質(zhì)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性,構(gòu)建差異蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.8 差異蛋白質(zhì)Western blot驗證

收集生長狀態(tài)良好的RK-13細胞、成年家兔和幼年家兔肝組織,用RIPA(含1%蛋白酶抑制劑PMSF)裂解液裂解,制備好的蛋白質(zhì)樣品分別加入SDS-PAGE膠上樣孔中,每孔上樣量為10 μg;設(shè)置恒壓80 V電泳120 min,電泳完成后,用伯樂半干轉(zhuǎn)膜儀10 V、1 A條件下轉(zhuǎn)膜30 min,轉(zhuǎn)印至PVDF膜。用脫脂奶粉封閉1 h后加入差異蛋白質(zhì)單克隆抗體,4 ℃孵育過夜,用TBST洗膜5次,加入HRP標記的二抗,室溫孵育1 h,用TBST洗膜5次,用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)顯色。

1.9 數(shù)據(jù)分析

對篩選得到的差異蛋白質(zhì)進行Western blot檢測,檢測結(jié)果采用ImageJ(v1.8.0)軟件進行灰度分析,其余數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 8.0.1軟件進行多組間單因素方差分析(one-way analysis of variance)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白質(zhì)的篩選與鑒定

本試驗共鑒定了4 353個蛋白質(zhì),篩選出821個具有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質(zhì)。相對于幼年兔,成年兔肝中顯著上調(diào)表達蛋白質(zhì)294個,顯著下調(diào)表達蛋白質(zhì)527個,差異蛋白質(zhì)表達火山圖和熱圖如圖1所示。根據(jù)2種月齡兔肝中蛋白質(zhì)定量比值將篩選出的差異蛋白質(zhì)進行排序,篩選出了比值最大的6個差異蛋白質(zhì),其中醇脫氫酶(aldehyde dehydrogenase 1A1, ALDH1A1)、角蛋白8(keratin 8, KRT8)、角蛋白18(keratin 18, KRT18)和組蛋白結(jié)合蛋白1(histone binding protein 1, SLBP1)共4個蛋白質(zhì)的表達顯著上調(diào),膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(cholesterol acyltransferase 1, ACAT1)和熱休克蛋白9(heat shock protein family A member 9,HSPA9)的表達顯著下調(diào)(表1)。

A,差異蛋白火山圖;B,差異蛋白聚類熱圖。A, Volcano plot of differential proteins; B, Clustering heat map of differential proteins.圖1 差異蛋白質(zhì)的篩選與鑒定Fig.1 Screening and identification of differential proteins

2.2 差異蛋白質(zhì)GO富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示,821種差異蛋白質(zhì)主要富集到生物學過程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)3大類(圖2-A)。BP中小分子代謝(small molecule metabolic process)蛋白質(zhì)145個、氧化還原過程(oxidation-reduction process)蛋白質(zhì)111個、代謝過程(metabolic process)蛋白質(zhì)478個;CC中細胞外成分(intracellular-part)蛋白質(zhì)528個、線粒體(mitochondrion)蛋白質(zhì)139個、細胞質(zhì)(cytoplasmic part)蛋白質(zhì)366個;MF中催化活性(catalytic activity)蛋白質(zhì)342個、氧化還原活性(oxidoreductase activity)蛋白質(zhì)93個、輔酶結(jié)合(coenzyme binding)蛋白質(zhì)50個(圖2-B)。

A,差異蛋白質(zhì)GO富集分析分類直方圖;B,差異蛋白質(zhì)GO富集分析分類氣泡圖。BP,生物學過程;CC,細胞組分;MF,分子功能。A, Classification histogram of differential proteins by GO enrichment analysis; B, Classification bubble diagram of differential proteins by GO enrichment analysis. BP, Biological process; CC, Cellular component; MF, Molecular function.圖2 差異蛋白質(zhì)GO富集分析結(jié)果Fig.2 The results of GO enrichment analysis of differential proteins

2.3 KEGG信號通路注釋結(jié)果

對成年兔和幼年兔肝中的821個差異蛋白質(zhì)進行通路富集分析,結(jié)果共注釋到47條KEGG信號通路,排名前10的通路如表2所示。其中,代謝途徑(metabolic pathways)通路中富集的蛋白質(zhì)差異極顯著(P<0.01),且富集的蛋白質(zhì)數(shù)量較多,剩余通路主要包括糖代謝(carbon metabolism)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、剪切小體(spliceosome)等。

2.4 差異蛋白的PPI構(gòu)建分析

由成年兔和幼年兔肝中差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖和柱形圖(圖3-A、3-B)可看出,關(guān)聯(lián)度排名前10位的差異蛋白質(zhì)分別是線粒體核糖體蛋白S15(mitochondrial ribosomal protein S15, MRPS15)、人核糖體蛋白L26(ribosomal protein L26, RPL26)、線粒體核糖體蛋白L11(mitochondrial ribosomal protein L11, MRPL11)、核糖體蛋白L11(ribosomal protein L11, RPL11)、泛醌氧化還原酶亞單位AB1(ubiquinone oxidoreductase subunit AB1, NDUFAB1)、線粒體核糖體蛋白L15(mitochondrial ribosomal protein L15, MRPL15)、小核糖核蛋白多肽F(small nuclear ribonucleo protein polypeptide F, SNRPF)、60S核糖體蛋白L27(60S ribosomal protein L27, LOC100356974)、線粒體核糖體蛋白L17(mitochondrial ribosomal protein L17, MRPL17)、線粒體核糖體蛋白L3(mitochondrial ribosomal protein L3, MRPL3),關(guān)聯(lián)度最高的是MRPS15。以上蛋白質(zhì)均為核糖體蛋白質(zhì),其功能聚類于細胞功能調(diào)控方面。

2.5 差異蛋白質(zhì)的驗證

根據(jù)蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果,用成年兔、幼年兔肝組織和5周齡幼兔腎細胞系(RK-13)作為樣品,對篩選獲得的6個差異蛋白質(zhì)(ALDH1A1、KRT8、KRT18、ACAT1、SLBP和HSPA9)進行蛋白質(zhì)表達水平驗證。Western blot結(jié)果表明:幼年兔組和RK-13組的ALDH1A1、SLBP蛋白表達水平均極顯著(P<0.001)低于成年兔組,且RK-13組的ALDH1A1、SLBP蛋白表達水平極顯著(P<0.001)低于幼年兔組(圖4A、4-B、圖4-I、4-J);幼年兔組和RK-13組的KRT8蛋白表達水平極顯著低于成年兔組,且RK-13組顯著(P<0.05)低于幼年兔組(圖4-C、4-D);幼年兔組和成年兔組的KRT18蛋白表達水平均極顯著(P<0.001)低于RK-13組,幼年兔組KRT18蛋白表達水平極顯著(P<0.001)低于成年兔組(圖4-E、4-F);成年兔組、RK-13組的ACAT1蛋白表達水平極顯著(P<0.001)低于幼年兔組,RK-13組的ACAT1蛋白表達水平極顯著降低于成年兔組(P<0.001)(圖4-G、4-H);幼年兔組和RK-13組的HSPA9蛋白表達水極顯著(P<0.001)高于成年兔組,但RK-13組與幼年兔組間HSPA9蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)(圖4-K、4-L)。

ALDH1A1,醇脫氫酶;KRT8,角蛋白8;KRT18,角蛋白18;ACAT1,膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1;SLBP,組蛋白結(jié)合蛋白1;HSPA9,熱休克蛋白9;Adult,成年兔;Young,幼年兔。*、**、***分別表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平差異顯著。ALDH1A1, Aldehyde dehydrogenase 1A1; KRT8, Keratin 8; KRT18, Keratin 18; ACAT1, Cholesterol acyltransferase 1; SLBP, Histone binding protein 1; HSPA9, Heat shock protein family A member 9; Adult, Adult rabbit; Young, Young rabbit. *, ** and *** meant significa differences at the levels of P<0.05, P<0.01 and P<0.001, respectively.圖4 成年兔和幼年兔肝、5周齡幼兔腎組織細胞系(RK-13)的差異蛋白表達水平Fig.4 Differential protein expression levels in livers of adult and young rabbits, and kidney cell lines (RK-13) of 5-week-old rabbits

3 結(jié)論與討論

RHDV是一種在全球范圍傳播的兔急性、高度致死性傳染病,對家兔養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[17-18]。疫苗是預防兔出血癥的主要手段,但目前為止,仍尚未構(gòu)建出允許體外培養(yǎng)RHDV毒株的細胞系[19-20]。因此,深入研究RHDV感染后的體液和細胞免疫機制,比較幼年兔和成年兔感染RHDV的機制,可為合理開發(fā)RHD疫苗提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

病毒感染是一個極為復雜的過程,涉及基因、蛋白質(zhì)、代謝物等物質(zhì)的相互作用,蛋白質(zhì)組學可較全面地揭示生物系統(tǒng)中差異蛋白質(zhì)對病毒感染的影響[21]。目前基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學定量方法有同位素標記相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)、多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(multiple reaction monitoring, MRM)、TMT和平行反應(yīng)監(jiān)測(parallel reaction monitoring, PRM)等[22],其中TMT是賽默飛世爾科技(Thermo Scientific)公司推出的一種基于體外同位素標記的相對與絕對定量蛋白質(zhì)組學技術(shù),即利用同位素試劑標記蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的多肽,可同時分析多達16種樣品間的蛋白質(zhì)表達量,具有不依賴抗體、可同時測定多樣品多目標,易形成標準化操作等優(yōu)點,應(yīng)用最為廣泛[22]。本研究采用TMT技術(shù)對成年兔和幼年兔肝中的差異蛋白質(zhì)進行了篩選和分析,共鑒定出4 353個蛋白質(zhì),篩選出821個具有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質(zhì),其中294個顯著上調(diào),527個顯著下調(diào)。差異蛋白質(zhì)GO功能注釋生物學過程中主要富集到小分子代謝、氧化還原過程和代謝過程;細胞組分中主要富集到細胞外成分、線粒體和細胞質(zhì);分子功能中主要富集到催化活性、氧化還原活性和輔酶結(jié)合。KEGG通路數(shù)據(jù)庫分類注釋到47條KEGG信號通路,主要涉及代謝途徑、糖代謝、氧化磷酸化、帕金森氏癥、剪接體、阿茲海默病和丙酸代謝等通路。結(jié)合文獻報道,本課題組對角蛋白8、角蛋白18、熱休克蛋白9、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1、醇脫氫酶和組蛋白結(jié)合蛋白進行后續(xù)驗證。

熱休克蛋白9屬于熱休克蛋白家族,參與細胞增殖、細胞器蛋白穩(wěn)定、凋亡、蛋白質(zhì)的囊泡運輸和神經(jīng)退行性疾病等多個生理病理過程[23]。已有研究表明,熱休克蛋白家族作為一種細胞外的免疫原,可引起主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)交叉呈遞抗原[24]。Neave等[16]研究發(fā)現(xiàn),感染RHDV GI.2株后,幼年家兔肝中的殺傷細胞受到激活,相關(guān)功能基因(PTPN22、VaV1和ARRB2)表達下調(diào),推測幼年家兔肝內(nèi)HSPA9上調(diào)后,雖然會活化殺傷細胞,但由于相關(guān)基因被下調(diào),不會誘導過強的炎癥反應(yīng)來阻礙RHDV GI.2株感染。本研究中幼年兔肝內(nèi)HSPA9表達上調(diào),推測感染RHDV GI.1株后,幼年兔可同時活化CD4+T細胞、CD8+T細胞和自然殺傷細胞,激活特異性細胞免疫進而阻礙病毒感染[25]。此外,也有研究表明,HSPA9是坦布蘇病毒(TMUV)在雞成纖維細胞(DF-1)上的病毒受體,推測HSPA9可能與病毒進入細胞有關(guān)[26]。

線粒體核糖體蛋白S15(MRPS15)是存在于真核細胞線粒體內(nèi)的一種核糖體,與線粒體蛋白的翻譯相關(guān)[27]。研究表明,線粒體核糖體蛋白可以與MAVS結(jié)合,促進MAVS活化,并且可以從線粒體轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)并促進RIG-I/MDA5的K63連接泛素化[28]。Neave等[16]對先天免疫因子基因的表達分析表明,幼年家兔和成年家兔在感染RHDV GI.1株或GI.2株后不同的抵抗效應(yīng)正是基于這些早期免疫調(diào)節(jié)過程。本研究中根據(jù)PPI分析,MRPS15關(guān)聯(lián)度最高,推測由于幼年兔肝中MRPS15表達較高,當受到RHDV刺激后,可能通過MRPS15與MAVS的互作,進一步促進MAVS的活化,激活天然免疫并拮抗病毒感染。在幼年兔對RHDV GI.1株的應(yīng)答中,MHCⅠ型和干擾素誘導的基因上調(diào),導致CD4+T和自然殺傷細胞的激活活性增強,這些結(jié)果可能與幼年兔對RHDV GI.1株不具有感染性相關(guān)。相反,在感染RHDV GI.2株后,幼年家兔肝中MHCⅠ型和干擾素誘導的基因下調(diào),這可能與幼年家兔對RHDV GI.2株具有感染性有關(guān)[26]。

角蛋白8(KRT8)屬于角蛋白家族,是消化系統(tǒng)中最大的中間絲蛋白和細胞骨架的主要組成部分[29]。李文靜等[30]研究發(fā)現(xiàn),丙型肝炎病毒(HCV)感染可導致角蛋白8表達上調(diào),從而反過來促進HCV自身的復制,并且下調(diào)角蛋白8具有抗HCV作用,并增強抗HCV藥物的抗病毒作用。Ye等[23]研究發(fā)現(xiàn),角蛋白8突變體在慢性乙型肝炎病毒(CHBV)感染后表達上調(diào),其突變體可能阻止細胞骨架的組裝,并增加人體對急性肝衰竭的易感性。膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(也稱為甾醇-O-?；D(zhuǎn)移酶,ACAT1)主要功能是催化膽固醇酯的形成并在體內(nèi)發(fā)揮多種功能,包括調(diào)節(jié)膽固醇的儲存和細胞膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[31];Pokhrel等[32]研究發(fā)現(xiàn),膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1抑制劑可抑制諾如病毒(NV)復制,說明膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1和NV復制相關(guān)。組蛋白結(jié)合蛋白(SLBP)是一種新的RNA結(jié)合蛋白,參與轉(zhuǎn)錄翻譯和mRNA降解,復制依賴性組蛋白mRNA是其唯一已知的靶點[33]。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn),HIV-1感染者的血漿中TNF-α水平與組蛋白結(jié)合蛋白水平呈負相關(guān),說明組蛋白結(jié)合蛋白是HIV-1潛在的重要細胞調(diào)節(jié)因子。Albright等[35]研究發(fā)現(xiàn),HCMV能夠利用組蛋白結(jié)合蛋白作為另一種途徑來協(xié)助病毒粒子的產(chǎn)生。這些差異蛋白質(zhì)目前沒有與RHDV感染機制相關(guān)的報道,我們將在后續(xù)的實驗中進行逐一探索。

本文采用TMT標記定量蛋白質(zhì)組學篩選鑒定出了成年兔和幼年兔肝中的差異蛋白質(zhì),并對其進行了相應(yīng)的生物學分析,有助于進一步了解差異蛋白質(zhì)在RHDV感染中的作用,為RHDV體外擴增細胞系構(gòu)建提供新的研究思路。差異蛋白質(zhì)篩選僅僅邁出了第一步,后續(xù)還需在細胞水平上進行差異蛋白質(zhì)對病毒感染影響的驗證。