基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的生物傳感器研究進(jìn)展

李倩,范高超

(青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,山東 青島 266042)

聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)和CRISPR相關(guān)酶(Cas)統(tǒng)稱為CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng),其主要功能是作為分子剪刀破壞入侵的核酸,通過切割特定的外源DNA或RNA來保護(hù)細(xì)菌免受外源基因的入侵[1]。近十年來,CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯已成為最強大的分子生物學(xué)工具之一,應(yīng)用擴展到生命科學(xué)的各個角落,廣泛用于臨床診斷、生物傳感和生物成像等領(lǐng)域。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由Cas效應(yīng)器、非編碼CRISPR RNA(crRNA)和在某些情況下的反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)組成。crRNA由兩部分結(jié)構(gòu)組成,一部分是與Cas效應(yīng)器結(jié)合的發(fā)夾結(jié)構(gòu),另一部分是與目標(biāo)物特異性識別的“原間隔”基序[2](一般為20個堿基,20 nt)。由于crRNA能特異性識別目標(biāo)DNA或RNA,所以CRISPR/Cas系統(tǒng)具有極高的特異性,而且不需要傳統(tǒng)基因編輯工具中涉及的復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程。此外,Cas效應(yīng)器的特異性核酸酶活性僅在目標(biāo)識別時觸發(fā),可以實現(xiàn)從目標(biāo)識別到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的無縫過渡。接下來簡要概述第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,這類系統(tǒng)包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14。

1 CRISPR/Cas9

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述

CRISPR/Cas9是第一個用于真核細(xì)胞基因編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng),開啟了生物化學(xué)的一個嶄新時代。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由三部分組成:化膿性鏈球菌Cas9(spCas9)、crRNA和tracrRNA。crRNA和tracrRNA可以結(jié)合在一起,形成單一的引導(dǎo)RNA(gRNA)[3]。spCas9可通過gRNA靶向下游具有“原間隔鄰近基序”(PAM)的20 nt的目標(biāo)雙鏈DNA(dsDNA)。此時spCas9作為核酸內(nèi)切酶的活性被激活,可以在PAM的上游對目標(biāo)dsDNA進(jìn)行位點特異性裂解。其中,Cas9識別的PAM序列是一段富含G堿基的序列(5’-NGG-3’)。Cas9的特異性由與目標(biāo)DNA互補的20 nt序列的gRNA決定,而且位于目標(biāo)序列下游的PAM序列對于Cas9與目標(biāo)鏈的識別也至關(guān)重要[4]。CRISPR/Cas9的這種特點有助于提高生物分析工具開發(fā)的檢測特異性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)示意圖如圖1所示。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)示意圖

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用研究

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以作為生物識別的工具。生物識別是生物分析工具的基本組成部分,通過生物識別可以實現(xiàn)核酸、蛋白質(zhì)和小分子等目標(biāo)物的特異性檢測和成像。CRISPR/Cas9憑借獨特的crRNA引導(dǎo)的序列結(jié)合特性,目前已成為最常用的生物識別機制之一,可用于體外或生命系統(tǒng)中核酸的高度特異性識別。Pardee等人[5]介紹了這樣一項工作,通過將Cas9與基于核酸序列的擴增(NASBA)相結(jié)合,設(shè)計了一種CRISPR/Cas9生物傳感器用以區(qū)分寨卡病毒株。寨卡病毒是一種通過蚊蟲傳播的病毒,最初在非洲發(fā)現(xiàn),后來廣泛傳播到美洲等地。但美洲寨卡病毒株的亞基因組序列含有一個與Cas9特異性識別的PAM序列,而非洲寨卡病毒株則沒有。所以利用CRISPR/Cas9生物傳感器可以特異性地切割美洲寨卡病毒基因序列,而不切割非洲寨卡病毒序列,以此來實現(xiàn)這兩種病毒的區(qū)分。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用于基因編輯。Actinomycetal(放線菌)是革蘭氏陽性細(xì)菌,能夠產(chǎn)生各種各樣的醫(yī)學(xué)和工業(yè)相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物,例如抗生素、除草劑、化療藥物和免疫抑制劑等,開發(fā)具有藥物先導(dǎo)特性的放線菌次級代謝產(chǎn)物對醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。2015年,Tong等人[6]報道了一種CRISPR/Cas9系統(tǒng)來編輯放線菌基因組。該系統(tǒng)可以對某個基因或基因簇進(jìn)行特異性地敲除,從而有效和可逆地控制放線菌的基因表達(dá)。此外,他們還開發(fā)了一種基于催化失活的Cas9變體(dCas9)系統(tǒng)(CRISPR/dCas9),該系統(tǒng)也可以有效和可逆地控制靶基因的表達(dá)。Shi等人[7]最近開發(fā)了一種高效的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),用來改變Starmerellabombicola(球擬假絲酵母菌)的基因組序列,從而生產(chǎn)具有廣泛用途的酸型槐糖脂。該CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過同源定向修復(fù)提高了基因整合和靶基因破壞的效率,實現(xiàn)了多基因同時破壞。還通過在體內(nèi)組裝多個DNA片段進(jìn)一步構(gòu)建了一個工程菌株,該菌株可以產(chǎn)生單一的酸型槐糖脂。CRISPR/Cas9提供了一種方便且高效的基因編輯技術(shù),在生物學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)中具有良好的應(yīng)用前景。

2 CRISPR/Cas12

2.1 CRISPR/Cas12系統(tǒng)概述

Cas12是Cas家族中一個獨特的核酸酶,與Cas9不同的是,它們識別并切割單鏈DNA(ssDNA)和目標(biāo)dsDNA,并且在切割dsDNA時產(chǎn)生黏性末端。第一個發(fā)現(xiàn)的Cas12酶是Cas12a(也叫Cpf1),是在普雷沃氏菌和弗朗西斯菌的基因組中發(fā)現(xiàn)的。Cas12家族的另一個亞型Cas12b(稱為C2c1)則是從不同的細(xì)菌物種中發(fā)現(xiàn)的。Cas12a和Cas12b具有相似的結(jié)構(gòu),但激活機制上有所不同,Cas12b需要crRNA和tracrRNA來結(jié)合靶標(biāo),而Cas12a只需要crRNA。LbCas12a(來自拉克諾螺旋菌)和AsCas12a(來自同源酸氨基球菌)的PAM序列為5’-TTTV,而BhCas12b(來自希薩希芽孢桿菌)的PAM序列為5’-ATTN。Cas12與PAM識別之后,dsDNA開始解離,隨后解離的目標(biāo)鏈與crRNA進(jìn)行堿基配對。目標(biāo)鏈與crRNA雜交后使得Cas12的催化位點轉(zhuǎn)化為活性構(gòu)型,從而切割目標(biāo)DNA和附近的非靶ssDNA。這種獨特的反式切割(也稱為側(cè)邊切割)特性使Cas12成為集目標(biāo)識別和信號放大于一體的強大信號放大器[8]。CRISPR/Cas12系統(tǒng)示意圖如圖2所示。

圖2 CRISPR/Cas12系統(tǒng)示意圖

2.2 CRISPR/Cas12系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用研究

CRISPR/Cas12a系統(tǒng)可以實現(xiàn)信號擴增檢測。Petri等人[9]提出了一種基于重組酶聚合酶擴增反應(yīng)(RPA)的DETECTR(DNA核酸內(nèi)切酶靶向CRISPR反轉(zhuǎn)錄報告器)檢測平臺,該平臺是一項超靈敏的等溫核酸檢測技術(shù)。在這項工作中,作者發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas12a復(fù)合物可以識別dsDNA和ssDNA,并誘導(dǎo)靶向特異性側(cè)邊切割。而且dsDNA目標(biāo)物的識別更加嚴(yán)格,需要PAM進(jìn)行特異性識別以及目標(biāo)物與crRNA互補,而ssDNA目標(biāo)物只需要與crRNA互補即可。與PCR相比,DETECTR檢測平臺通過將Cas12a的側(cè)邊裂解特性與RPA結(jié)合,可以在37～42 ℃實現(xiàn)等溫擴增,而且擴增速度快得多(短至20 min)。

2021年,Zhang等人[10]通過將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)和雙等溫擴增技術(shù)結(jié)合,建立了一種超靈敏檢測橘霉素(Citrinin,CIT)的方法。在該策略中,抗原修飾的金納米顆粒(AuNPs)通過金硫鍵將ssDNA連接在AuNPs上,以此形成探針。抗原修飾的AuNPs通過與CIT競爭,結(jié)合到涂有抗CIT抗體的磁珠上。經(jīng)過簡單的磁分離后,收集AuNPs,用二硫蘇糖醇溶液洗滌后釋放ssDNA。ssDNA首先通過指數(shù)擴增反應(yīng)擴增,然后在隨后的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中用作引物,產(chǎn)生dsDNA,該dsDNA包含一個PAM序列,CRISPR/Cas12a能對其進(jìn)行特異性識別,從而激活CRISPR/Cas12a的活性,裂解ssDNA報告基因產(chǎn)生熒光信號。該方法具有較低的檢出限(0.127 ng/mL)和較寬的線性范圍(0.005～500 μg/mL)。燕麥和面粉中CIT的檢測回收率分別為97%～104%和105%～111%,實現(xiàn)了食品毒素的高靈敏度和高選擇性檢測。

CRISPR/Cas12a系統(tǒng)還可以與電化學(xué)傳感器相結(jié)合,用來開發(fā)具有高靈敏度、高特異性、高可編程性和普遍適用性的生物傳感器。Qing等人[11]首次將CRISPR/Cas系統(tǒng)引入一個無固定化的電化學(xué)生物傳感平臺,用于靈敏和特異性地檢測疾病相關(guān)的核酸和小分子。在該策略中,通過模塊化滾環(huán)擴增(Rolling Circle Amplification,RCA)反應(yīng)將目標(biāo)鏈擴增為一長串通用的DNA觸發(fā)鏈,用以激活CRISPR/Cas12a的脫氧核糖核酸酶活性,從而進(jìn)一步實現(xiàn)信號擴增的目的。靶激活阻滯劑探針的裂解使亞甲基藍(lán)標(biāo)記的報告探針被還原的氧化石墨烯修飾電極捕獲,從而產(chǎn)生顯著增加的電化學(xué)信號。該電化學(xué)生物傳感器展示了一種“信號開啟”模型,實現(xiàn)了對microRNAs(miRNAs)、細(xì)小病毒B19(PB-19)基因序列和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的高靈敏度和特異性檢測。

Cas12b屬于V-B型CRISPR/Cas系統(tǒng),是一種嗜熱RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶。與Cas12a相比,其研究應(yīng)用比較少。Li等人[12]報道了一種基于CRISPR/Cas12b的可用于四種不同應(yīng)用的HOLMESv2系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以特異性識別單核苷酸多態(tài)性(SNP);通過恒溫一步法與LAMP擴增相結(jié)合,可以精確定量目標(biāo)核酸,而且可以有效避免交叉污染的出現(xiàn);該方法可以對環(huán)狀RNA、病毒RNA、人類細(xì)胞的mRNA進(jìn)行簡單檢測;同時也可以準(zhǔn)確定量目標(biāo)DNA的甲基化程度。實驗證明,HOLMESv2系統(tǒng)在分子診斷和表觀遺傳學(xué)應(yīng)用中具有極大的潛力。

3 CRISPR/Cas13

3.1 CRISPR/Cas13系統(tǒng)概述

Cas13是一類RNA引導(dǎo)的核糖核酸酶,包括4個主要亞型:Cas13a(也叫C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d。有研究發(fā)現(xiàn),Cas13家族不需要特定的PAM來進(jìn)行目標(biāo)識別。與Cas12相似,Cas13與crRNA以及目標(biāo)鏈特異性結(jié)合之后,催化位點會轉(zhuǎn)化為活性構(gòu)型,進(jìn)而催化近端RNA鏈的非特異性裂解[13]。Cas13家族的無差別裂解活性也使它們成為生物分析應(yīng)用的理想信號放大器,而且目前的大多數(shù)研究主要是基于Cas13a進(jìn)行的。CRISPR/Cas13系統(tǒng)示意圖如圖3所示。

圖3 CRISPR/Cas13系統(tǒng)示意圖

3.2 CRISPR/Cas13系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用研究

CRISPR/Cas13a于2016年被首次報道,是一項有潛力的基因編輯技術(shù)。與CRISPR/Cas9系統(tǒng)類似,CRISPR/Cas13a也可用于抑制真核細(xì)胞中的基因表達(dá),是一種高效的、特異性的基因治療工具。Fan等人[14]介紹了一項CRISPR/Cas13a介導(dǎo)的基因治療技術(shù),靶向治療膀胱癌中高表達(dá)的人血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR2)。通過開發(fā)一種多功能脂質(zhì)體系統(tǒng),將CRISPR/Cas13a系統(tǒng)輸送到膀胱癌細(xì)胞中。在該策略中,CRISPR/Cas13a僅作為一種用于基因編輯的工具,而不影響細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性;該系統(tǒng)可以特異性靶向VEGFR2,具有精確識別目標(biāo)的能力;而且可以通過近紅外光來介導(dǎo)藥物系統(tǒng)的釋放。這種基于CRISPR/Cas13a的近紅外光介導(dǎo)的靶向腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)傳遞系統(tǒng)為膀胱癌基因治療開辟了一種新策略,具有極大的應(yīng)用潛力。

CRISPR/Cas系統(tǒng)還可用于核酸檢測。近年來,有研究者報道了一種CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a/d系統(tǒng),用以檢測煙草花葉病毒、煙草蝕刻病毒和馬鈴薯X病毒三種RNA病毒。該策略可以通過CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對PCR擴增產(chǎn)生的病毒DNA擴增序列進(jìn)行檢測,并可以實現(xiàn)對混合感染的植物的多重檢測。之后通過調(diào)整檢測系統(tǒng),可以繞過昂貴的RNA純化步驟,利用 CRISPR/Cas13a/d系統(tǒng)可以直接檢測病毒RNA,避免了復(fù)雜的預(yù)擴增步驟。該系統(tǒng)可以在葉片收獲后30 min內(nèi)進(jìn)行病毒診斷,為開發(fā)簡單、快速、經(jīng)濟有效的植物病毒檢測方法提供了一種新的思路,極大地拓寬了CRISPR/Cas系統(tǒng)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。

外泌體miRNAs作為一種癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物,在癌癥生物學(xué)中起著關(guān)鍵的作用。最近,Zhang等人[15]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas13a的脂質(zhì)體介導(dǎo)的膜融合策略(MFS-CRISPR),該策略可以將CRISPR/Cas13a轉(zhuǎn)染到外泌體中,用以直接測量血漿中的外泌體miRNA-21(miR-21)。脂質(zhì)體介導(dǎo)的MFS可將熒光信號限制在融合囊泡內(nèi),用于外泌體異質(zhì)性分析。通過臨床樣本的檢測,發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者與健康人體miR-21表達(dá)差異顯著,這進(jìn)一步證明了MFS-CRISPR平臺檢測的準(zhǔn)確性。MFS-CRISPR檢測平臺具有寬的線性檢測范圍和低的檢測限,而且靈敏度高,操作簡單,在癌癥診斷和治療監(jiān)測方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

4 CRISPR/Cas14

Cas14于2018年由Doudna等人首次發(fā)現(xiàn),它由400～700個氨基酸組成,Cas14蛋白比較小,其大小是其他Cas蛋白的一半[16]。Cas14家族有3個亞型:Cas14a、Cas14b和Cas14c。Cas14的結(jié)構(gòu)尚未被揭示,但研究表明,所有Cas14亞型都有一個RuvC結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)目標(biāo)鏈的切割。而且Cas14也具有反式裂解活性,只切割ssDNA,而不切割dsDNA或單鏈RNA。Cas14不需要PAM序列,但是Cas14對crRNA與目標(biāo)序列堿基對錯配的耐受性較低,因此與其他Cas蛋白相比具有更高的特異性,可用于核酸序列的檢測[17]。有研究表明,Cas14能夠很好地區(qū)分單核苷酸多態(tài)性,比如能夠很好地區(qū)分決定人類眼鏡顏色的HERC2變體。這為拓展Cas14在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

5 結(jié)論

CRISPR/Cas系統(tǒng)是最強大的分子剪刀之一,它可以簡單、靈活、特異性地識別和切割目標(biāo)核酸,這是其他分子剪刀(如核酸內(nèi)切酶和鋅指核酸酶)所實現(xiàn)不了的。當(dāng)用于分析和診斷分析時,CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其獨特的特性具有明顯的優(yōu)勢[18]。首先,CRISPR/Cas系統(tǒng)通過crRNA間隔區(qū)的20個堿基特異性地識別目標(biāo)核酸,這確保了核酸的序列特異性檢測和位點特異性成像,并使脫靶結(jié)合或切割最小化。而且crRNA可以通過化學(xué)合成大量生產(chǎn)和修飾,這極大地加速了具有可調(diào)特異性(即對單核苷酸突變敏感或耐受)的crRNA的篩選和應(yīng)用。其次,CRISPR/Cas系統(tǒng)不需要變性就可以識別dsDNA。這種獨特的結(jié)合特性使得CRISPR/Cas系統(tǒng)在不同的光學(xué)和電化學(xué)檢測平臺上直接捕獲和檢測目標(biāo)基因,以及在活細(xì)胞中對基因組位點進(jìn)行原位成像成為可能。第三,由于dsDNA擴增子易于識別,CRISPR/Cas系統(tǒng)可與其他常用的核酸擴增技術(shù)(如PCR、LAMP、RPA)相結(jié)合,從而開發(fā)超靈敏的核酸檢測方法。第四,CRISPR/Cas系統(tǒng)是高度靈活和模塊化的,具有不同的核酸酶活性模式?？梢酝ㄟ^選擇合適的Cas機制來檢測不同類別的核酸靶標(biāo),包括dsDNA、ssDNA和RNA[19]。

盡管有許多優(yōu)點,但基于CRISPR的分析和診斷分析的開發(fā)和應(yīng)用也面臨著一些挑戰(zhàn)。比如,CRISPR/Cas機制存在被生物樣品或周圍環(huán)境中的RNA酶和蛋白酶降解的風(fēng)險;RNA和蛋白質(zhì)組分的不穩(wěn)定性會導(dǎo)致試劑成本增加,所以需要對CRISPR試劑的使用、儲存和運輸進(jìn)行規(guī)范;還可能因試劑失效而導(dǎo)致檢測結(jié)果假陰性等。所以對于CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究,以拓寬其在生物學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。