基于網(wǎng)絡藥理學技術探討桑椹治療便秘的作用機制

郭君鑫，林天寶，呂志強＊

（1. 畫水君鑫家庭農(nóng)場，浙江 東陽 322102； 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學研究院 蠶桑與茶葉研究所，浙江 杭州 310021）

便秘是現(xiàn)代人群中比較常見的一種腸道疾病，特別是在老年人群多發(fā)，同時給患者帶來一些并發(fā)癥［1］。近年來，伴隨著現(xiàn)代飲食結構的改變和生活節(jié)奏加快，便秘的發(fā)病率顯著升高，嚴重影響著國民的身體健康［2］。中醫(yī)藥已被證實在臨床上具有良好的便秘預防與治療療效。

桑椹（Fructus Mori），又名桑果、桑棗、文武實等，為桑屬?？粕涞某墒旃麑崳且环N美味、營養(yǎng)價值高的漿果類水果；同時，桑椹還是我國一味傳統(tǒng)中藥材，入藥始載于唐代《新修本草》；味甘、性寒；歸心、肝、腎經(jīng)［3］。桑椹，具有滋陰補血、生津潤腸、填精補腦等功效；具有良好的抗氧化、抗微生物、抗高血糖、抗高脂血癥、抗炎、抗癌作用，常用于眩暈耳鳴，心悸失眠，須發(fā)早白，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，血虛便秘［4］。

桑椹已經(jīng)被臨床上證實具有治療便秘的作用，但其主要活性成分、作用靶點與調(diào)控機制等尚不明確。因此，本研究以桑椹為研究對象，運用網(wǎng)絡藥理學方法篩選桑椹治療便秘的有效成分及潛在靶點，并進行生物信息學分析，得到桑椹分子作用機制，為進一步理論研究及臨床應用提供科學依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源

1.1 桑椹化學成分篩選及靶點獲取

從TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中輸入“桑椹”，檢索藥物化學組分及該組分靶基因，以口服生物利用度（OB）＞30%，并且化合物類藥性（DL）＞0.1為篩選條件，檢索桑椹的主要化學成分并收集化合物的相應靶點。

1.2 便秘相關靶點的獲得

從Gene Cards、OMIM共2個疾病相關靶點的數(shù)據(jù)庫中檢索便秘相關靶點，篩選關鍵詞設置為“constipation”，設定物種為“Homosapiens”，取2數(shù)據(jù)庫共性靶點為便秘相關靶點。

1.3 藥物靶點和疾病靶點交集

利用R語言，對“1.1”與“1.2”所得到的桑椹預測作用靶點和疾病靶點集合的靶點名稱，取交集，得到桑椹治療便秘的靶點。

1.4 構建藥材-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡圖

將上述分析得到的桑椹作用便秘主要化合物以及對應靶點，導入Cytoscapev3.9.1中進行可視化，得到藥材-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡圖，并對網(wǎng)絡圖進行分析。

1.5 靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建

將篩選到的靶點蛋白于STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）進行PPI網(wǎng)絡模型構建，選擇“Homo Sapiens”為分析的生物體，置信度得分設置為最高置信度（0.900）之后進行整合和評估。

1.6 GO與KEGG分析

在DAVID網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）進行靶點的基因本體（GO）功能分析和KEGG（京都基因與基因組百科全書，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。

2 結果

2.1 主要成分信息

從TCMSP（https：//old.tcmsp- e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中輸入“桑椹”，設置口服生物利用度（OB）＞30%”、“DL＞0.1”，得到桑椹中12種活性成分，見表1，共獲得370個預測靶點。從Gene Cards、OMIM共2個疾病相關靶點的數(shù)據(jù)庫中檢索便秘相關靶點452個。通過取交集，共找到桑椹化合物治療便秘靶點211個。

將桑椹與交集靶點導入Cytoscape中，得到藥材-化合物-靶點-疾病通路網(wǎng)絡，結果見圖1。圖中節(jié)點數(shù)量有214個，349條邊，平均相鄰節(jié)點數(shù)量為3.24。在化合物中節(jié)點最大為quercetin 和oleic acid，提示桑椹主要通過quercetin和oleic acid調(diào)控靶點發(fā)揮治療便秘的功效。此網(wǎng)絡中度值排名前5 的靶點為PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1和PPARG。

圖1 化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡圖Fig. 1 Network of ingredients，targets，and disease

2.2 構建蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）及hub蛋白的提取

將211 個靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，以互作分數(shù)（Interaction score）≥0.9為參照，獲取PPI網(wǎng)絡，共獲取39個節(jié)點，100條邊，平均度值為1.59，見圖2。通過Degree分析識別篩選其中的hub蛋白，hub蛋白包括：AR、AKT1、BCL2、CREBBP、FABP1、HMGCR、RXRA、PPARD、PPARG、MMP1、MMP2、TIMP1、TIMP2。

圖2 桑椹-便秘靶點PPI網(wǎng)絡Fig. 2 Ppi network of targets of mulberry fruits for constipation therapy

2.3 靶點GO與KEGG富集分析

在線對于桑椹治療便秘的作用靶點進行GO與KEGG 富集分析。通過GO 富集分析，211 靶點顯著富集于127 個GO 分類（P＜0.05），其中，分子功能（MF）29個、細胞組分（CC）12個、生物學過程（BP）86個，3 個分類排名前10 位分類如圖3 所示。分子功能分類，靶點主要富集于鋅離子結合（zinc ion binding）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）與酶結合（enzyme binding）；細胞組分主要富集于液泡（cytosol）、細胞質(zhì)膜（plasma membrane）和膜的整體成分（integral component of membrane）；生物學過程主要富集于藥物反應（response to drug）、炎癥應答（inflammatory response）和凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）。

圖3 桑椹防治便秘作用靶點GO富集分析柱狀圖Fig. 3 Histogram of GO enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy

KEGG功能注釋富集分析結果顯示，211個作用靶點顯著富集到28條信號通路（P＜0.05），前20條信號通路如圖4 所示。可以看出，PPAR 信號通路（PPAR signaling pathway）、酒精性肝病（alcoholic liver disease）、糖尿病并發(fā)癥AGR 受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）、脂肪細胞內(nèi)脂類分解調(diào)控（regulation of lipolysis in adipocytes）及藥物代謝-細胞色素P450（drug metabolism-cytochrome P450）等。

圖4 桑椹防治便秘作用靶點KEGG富集分析氣泡圖Fig. 4 Bubble diagram of KEGG functional enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy

3 討論

桑椹性味甘寒，人肝腎經(jīng)，具有滋陰補血、生津潤燥功效，能治心腎不交或習慣性便秘（閩南民間草藥）［5］。

本研究結果從數(shù)據(jù)庫中篩選出桑椹候選活性化合物12 個，預測潛在參與便秘治療的相應靶點211 個。通過構建活性成分和靶點網(wǎng)絡模型并分析結果，發(fā)現(xiàn)度值較高的候選活性分子分別是quercetin 和oleic acid，度值較高的靶點為PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1 和PPARG，提示桑椹主要通過quercetin 和oleic acid 調(diào)控這些靶點發(fā)揮治療便秘的功效。通過富集分析和通路分析得出，桑椹中活性成分的靶點主要參與的生物過程包括鋅離子結合、氧化還原酶活性、液泡、藥物反應與炎癥應答等，主要在PPAR 信號通路、酒精性肝病、糖尿病并發(fā)癥AGR 受體信號通路等發(fā)揮其藥理作用。