基于紅外光譜與聚類(lèi)分析法的忍冬屬中藥鑒別研究

徐 榮, 敖冬梅, 李曼鈿, , 劉 賽, 郭 昆, 胡 穎, 楊春梅, 徐常青

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所, 北京 100193

2. 北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部, 北京 100094

引 言

忍冬屬中藥材主要包括金銀花和山銀花, 均為我國(guó)常用大宗中藥材。 金銀花, 別名忍冬、 二花等, 為忍冬科忍冬屬植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花, 主要分布在河南、 山東等省份, 在我國(guó)有悠久的藥用歷史。 山銀花為忍冬屬灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、 紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、 華南忍冬LoniceraconfusaDC. 、 黃褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或初開(kāi)的花, 主要分布在湖南、 四川、 貴州、 云南等南方省份。 金銀花和山銀花均具有清熱解毒、 疏散風(fēng)熱的功效[1], 主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)包括有機(jī)酸、 黃酮、 三萜及皂苷、 環(huán)烯醚萜、 揮發(fā)油等多種化合物, 但藥材基原不同其具體成分和含量具有一定差異[2]。 目前, 在藥材流通領(lǐng)域, 忍冬科忍冬屬中藥因種類(lèi)多、 產(chǎn)量大、 分布范圍廣、 性狀特征相似、 功效相近, 存在摻偽混淆等現(xiàn)象, 尤其因山銀花價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于金銀花而摻偽混淆嚴(yán)重, 對(duì)臨床用藥的安全性、 有效性造成影響。 因此, 開(kāi)展不同基原忍冬屬中藥材的鑒別研究十分必要。

當(dāng)前, 對(duì)忍冬屬中藥的鑒別方法多集中于《中國(guó)藥典》規(guī)定的性狀鑒別、 顯微鑒別以及結(jié)合現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的薄層色譜法、 高效液相色譜法、 超高效液相色譜法、 核磁共振氫譜法、 DNA條形碼技術(shù)等方法的鑒別[3-7]。 性狀鑒別和顯微鑒別方法條件簡(jiǎn)單、 操作方便, 但需要具備專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)、 實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)豐富的評(píng)價(jià)人員, 而利用儀器檢測(cè)技術(shù)雖然能夠準(zhǔn)確、 有依據(jù)地判斷忍冬屬中藥的基原, 但檢測(cè)程序較為繁瑣, 樣品前處理繁雜、 耗時(shí)長(zhǎng)、 樣品損耗多, 不適宜對(duì)大批量樣品進(jìn)行鑒別, 因此亟需建立一種快速、 無(wú)損、 低成本的鑒別方法。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)具有無(wú)損、 快速、 特征性強(qiáng)、 儀器操作簡(jiǎn)便、 環(huán)保等優(yōu)點(diǎn), 并且能夠顯現(xiàn)有機(jī)物的分子振動(dòng)信息, 同時(shí)紅外吸收峰窄、 譜峰重疊可分離、 樣品信息豐富, 能夠體現(xiàn)樣品的宏觀(guān)性、 整體性, 已在中藥的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)方面得到廣泛應(yīng)用[8-11]。 另外, 采用儀器分析技術(shù)同化學(xué)計(jì)量法相結(jié)合對(duì)中藥進(jìn)行模式識(shí)別, 也日益成為一種快速鑒別中藥材基原植物、 產(chǎn)地來(lái)源和真?zhèn)蝺?yōu)劣的有效途徑。 本工作采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)結(jié)合Soft independent modding of class analogy(SMICA)聚類(lèi)分析法對(duì)來(lái)源于忍冬、 灰氈毛忍冬、 紅腺忍冬和黃褐毛忍冬的4種不同基原忍冬屬中藥材的鑒別方法進(jìn)行了研究, 為忍冬屬中藥的鑒別提供了新的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Spectrum GX型傅里葉變換紅外光譜儀(Perkin-Elmer公司); Assure ID軟件(PerkinElmer公司); Atlas 15T手動(dòng)壓片機(jī)(德國(guó)Specac公司); AB265-S(1/10萬(wàn))電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); 瑪瑙研缽; KBr光譜純(北京化學(xué)試劑公司)。

1.2 樣品來(lái)源

紅腺忍冬藥材樣品50份, 來(lái)自廣東、 廣西、 湖北、 浙江; 灰氈毛忍冬藥材樣品90份, 來(lái)自湖北、 湖南、 四川、 重慶、 云南; 黃褐毛忍冬藥材樣品20份, 來(lái)自貴州; 忍冬藥材樣品40份, 來(lái)自北朝鮮、 湖北、 陜西。 經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定, 分別為忍冬科忍冬屬植物紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、 灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、 黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng及忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

樣品充分干燥并粉碎過(guò)100目篩, 取2.5 mg樣品粉末放入研缽, 再放入150 mg KBr粉末混勻, 研磨至無(wú)明顯顆粒, 轉(zhuǎn)移到模具中, 約10 MPa下經(jīng)15 sec壓成近透明薄片。

1.3.2 光譜測(cè)定

室內(nèi)溫度保持在20～25 ℃, 相對(duì)濕度保持在18%～30%, 光譜范圍4 000～400 cm-1, 分辨率為4 cm-1, 累計(jì)掃描16次, 掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除H2O和CO2的干擾, 以溴化鉀為背景, 每個(gè)樣品重復(fù)3組。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品獲得的3張紅外光譜圖, 進(jìn)行加和運(yùn)算取其平均圖譜作為該樣品的紅外光譜圖。 得到圖譜后采用SpectrumV10.3.6軟件進(jìn)行基線(xiàn)自動(dòng)校正, 13點(diǎn)平滑、 吸光度歸一化為1.3。 二階導(dǎo)數(shù)譜范圍為1 800～400 cm-1, 用SpectrumV10.3.6軟件中的compare軟件, 以S1為設(shè)置參比, 計(jì)算紅外光譜圖譜帶較密集的指紋區(qū)(1 800～400 cm-1)的相似系數(shù)并選取13點(diǎn)平滑計(jì)算二階導(dǎo)數(shù)譜。 提取上述忍冬屬藥材紅外光譜差異特征, 采用Assure ID軟件進(jìn)行SIMCA聚類(lèi)分析, 進(jìn)行聚類(lèi)建模, 帶入其他已知基原植物的樣品對(duì)結(jié)果模型進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn)

同一樣品片, 連續(xù)測(cè)定5次紅外光譜, 計(jì)算所得到的紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。 其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8, 0.999 6, 0.999 2, 0.999 0, 0.999 0, RSD=3.63×10-4。 結(jié)果表明, 本方法具有良好的精密度。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同一樣品, 取其供試粉末壓片1片, 放入真空干燥器內(nèi)保存, 每隔1 h進(jìn)行1次紅外光譜測(cè)定, 計(jì)算5 h內(nèi)所得到的紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。 其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9、 0.999 9、 0.999 9、 0.999 8、 0.999 6, RSD=1.30×10-4。 結(jié)果表明, 儀器和樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

同一樣品, 取其供試粉末壓片5片, 分別進(jìn)行紅外光譜測(cè)定, 計(jì)算所得到的紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。 其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 2、 0.998 3、 0.997 7、 0.997 1、 0.996 8, RSD=9.64×10-4。 結(jié)果表明, 本方法具有良好的重現(xiàn)性, 符合樣品分析要求。

2.2 紅外光譜分析

如圖1所示, 紅外光譜圖中, 4種不同基原忍冬屬藥材的一維紅外圖譜非常相似, 譜峰的位置和峰高都比較接近, 其共同吸收峰位于1 629～1 635、 1 376～1 384、 1 265～1 282、 1 152～1 158、 1 050～1 051、 814～816、 611～614和534～537 cm-1。 說(shuō)明4種不同基原的忍冬屬藥材主要成分具有一定的相似性, 然而不同基原藥材的某些吸收峰強(qiáng)度、 位置和形狀存在差異。 不同之處在于, 僅忍冬顯示了1 731 cm-1吸收峰, 紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬及黃褐毛忍冬此處吸收峰不明顯, 按峰高排序未被標(biāo)注; 在相同條件下, 紅腺忍冬顯示的吸收峰較灰氈毛忍冬、 黃褐毛忍冬及忍冬少, 在1 525、 1 446、 859、 815和780 cm-1處吸收峰不明顯, 而其他3種基原的藥材在這些位置附近均具有吸收峰; 黃褐毛忍冬與忍冬具有428(425) cm-1附近吸收峰; 黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬在1 075 cm-1附近顯示吸收峰; 灰氈毛忍冬與忍冬顯示1 103 cm-1附近吸收峰; 在425～859 cm-1波段, 紅腺忍冬有4個(gè)明顯吸收峰, 黃褐毛忍冬與忍冬有6個(gè)明顯吸收峰, 灰氈毛忍冬有5個(gè)明顯吸收峰, 且4種藥材所顯示的吸收峰峰高、 峰形寬窄均略有差異。 一維紅外光譜結(jié)果表明, 4種藥材在化學(xué)組成上既含有共同種類(lèi)的化學(xué)成分, 如揮發(fā)油、 環(huán)烯醚萜、 黃酮、 有機(jī)酸類(lèi)等, 又含有各自的特征性成分, 且共同種類(lèi)的化學(xué)成分在結(jié)構(gòu)類(lèi)型及含量上也存在一定的差異。 因此, 根據(jù)特征峰的位置和顯示程度從一維紅外光譜圖中能夠?qū)?種不同基原的忍冬屬藥材一一區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖1 四種不同基原忍冬屬藥材的紅外光譜分析圖a: 紅腺忍冬; b: 黃褐毛忍冬; c: 灰氈毛忍冬; d: 忍冬

表1 四種不同基原忍冬屬藥材的主要紅外吸收峰及其指認(rèn)

采用Spectrum v10.3.6軟件的compare功能計(jì)算四者的相似系數(shù), 以紅腺忍冬為參照, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬相似系數(shù)為0.97, 與忍冬的相似系數(shù)為0.96, 與黃褐毛忍冬的相似系數(shù)為0.94; 以黃褐毛忍冬為參照, 黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬的相似系數(shù)為0.95, 與忍冬的相似系數(shù)為0.96; 以灰氈毛忍冬為參照, 灰氈毛忍冬與忍冬的相似系數(shù)為0.98。 結(jié)果表明, 4種不同基原的忍冬屬藥材間存在一定的差異, 其中, 紅腺忍冬與黃褐毛忍冬的差異最大, 忍冬與灰氈毛忍冬的相似度較高。

2.3 二階導(dǎo)數(shù)圖譜分析

圖2為4種不同基原忍冬屬藥材的二階導(dǎo)數(shù)圖譜, 與一維紅外圖譜相比, 其中重疊的吸收峰被分開(kāi), 使一些特征譜帶間的差異更明顯。 如紅腺忍冬在1 516～1 700及781～980 cm-1波段吸收峰頻率及形狀與其他3種基原藥材有較大差異。 在1 516～1 700 cm-1波段紅腺忍冬的吸收峰表現(xiàn)為峰形窄、 峰高低、 吸收峰密集, 表明紅腺忍冬中含有的黃酮類(lèi)、 環(huán)烯醚萜類(lèi)等成分與其他3種藥材相比含量略偏低、 結(jié)構(gòu)類(lèi)型比較多。 在781～980 cm-1波段吸收峰表現(xiàn)為峰形寬、 峰高低、 吸收峰稀疏, 表明紅腺忍冬中含有的黃酮類(lèi)、 有機(jī)酸類(lèi)等成分與其他3種藥材相比含量略偏低、 結(jié)構(gòu)類(lèi)型相對(duì)較少。 另外, 紅腺忍冬與其他3種基原藥材的二階導(dǎo)數(shù)譜相比, 缺少1 598 cm-1附近吸收峰。 由此, 可以將紅腺忍冬與其他3種藥材區(qū)分開(kāi)來(lái)。 黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬的二階導(dǎo)數(shù)譜相比, 除在1 631、 1 376和945 cm-1附近有差異外, 峰形具有較大的相似性。 同時(shí), 除黃褐毛忍冬在1 384 cm-1附近—CH3的吸收峰不明顯, 其他3種基原藥材均有。 由此, 可以將黃褐毛忍冬與其他3種藥材區(qū)分開(kāi)來(lái)。 紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬和黃褐毛忍冬都顯示了1 317 cm-1附近吸收峰, 只忍冬沒(méi)有顯示。 這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[17]的紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬和黃褐毛忍冬中含有的醇類(lèi)物質(zhì)比忍冬中種類(lèi)更多、 含量更高相吻合。 由此, 可以將忍冬與其他3種藥材區(qū)分開(kāi)來(lái)。 由此可見(jiàn), 從分辨率更高的二階導(dǎo)數(shù)圖譜上, 可以清晰地看到紅腺忍冬、 黃褐毛忍冬、 灰氈毛忍冬及忍冬的顯著差異, 4種基原的忍冬屬中藥均得到了很好的鑒別與區(qū)分。

圖2 四種不同基原忍冬屬藥材的二階導(dǎo)數(shù)圖a: 紅腺忍冬; b: 黃褐毛忍冬; c: 灰氈毛忍冬; d: 忍冬

2.4 聚類(lèi)分析

2.4.1 聚類(lèi)模型構(gòu)建

建立不同基原忍冬屬藥材的聚類(lèi)模型, 需對(duì)紅外光譜預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行選擇, 反復(fù)修改比較, 使聚類(lèi)模型成為最優(yōu)模型。 在模型建立過(guò)程中應(yīng)選擇譜峰信息豐富的區(qū)域, 因此本研究選擇了400～1 800 cm-1波段; 同時(shí)對(duì)譜圖進(jìn)行基線(xiàn)校正和矢量歸一化(standard normal variate, SNV)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換處理以保證譜圖的規(guī)范化。

2.4.1.1 聚類(lèi)模型類(lèi)間距分析

類(lèi)間距是指聚類(lèi)中心之間的距離, 間距數(shù)值越大, 類(lèi)與類(lèi)之間的差異越明顯, 因此類(lèi)間距能夠判別聚類(lèi)效果。 表2為4種不同基原忍冬屬藥材的類(lèi)間距, 顯示紅腺忍冬與灰氈毛忍冬的類(lèi)間距值最低, 為2.73, 說(shuō)明其相似度高; 黃褐毛忍冬與紅腺忍冬及灰氈毛忍冬差異較大, 類(lèi)間距值分別為6.86、 5.26。 類(lèi)間距數(shù)值越大表示差異越大。 因此, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬、 忍冬差異較小, 而黃褐毛忍冬與其他3種基原的藥材差異較大。

表2 四種不同基原忍冬屬藥材的類(lèi)間距

本研究中4種不同基原忍冬屬藥材的類(lèi)間距與紅外光譜相似系數(shù)的大小順序基本一致, 但相似系數(shù)結(jié)果表明, 忍冬和灰氈毛忍冬的相似性最近, 為0.98; 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬相似系數(shù)為0.97, 僅次于忍冬; 而類(lèi)間距結(jié)果表明, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬的類(lèi)間距值最低, 為2.73; 忍冬與灰氈毛忍冬的類(lèi)間距值為2.79。 結(jié)合文獻(xiàn)[18]綜合分析, 導(dǎo)致這些結(jié)果的原因可能與聚類(lèi)模型紅外光譜譜段的選擇有關(guān)。

2.4.1.2 聚類(lèi)模型識(shí)別率和拒絕率分析

識(shí)別率是指樣品落入該模型區(qū)域的幾率, 而拒絕率則是指樣品模型對(duì)不屬于該類(lèi)的未知樣品的拒絕程度, 即是否都落在該類(lèi)模型的區(qū)域外。 當(dāng)識(shí)別率與拒絕率達(dá)到100%時(shí), 表明物質(zhì)之間沒(méi)有重疊, 區(qū)分效果較好。 由表3可見(jiàn), 4種不同基原忍冬屬藥材各自的識(shí)別率和拒絕率均能達(dá)到99%以上, 說(shuō)明這幾種樣品區(qū)分聚類(lèi)效果良好。

表3 四種不同基原忍冬屬藥材的識(shí)別率和拒絕率

2.4.1.3 類(lèi)模型圖分析

圖3為4種不同基原忍冬屬藥材的類(lèi)模型圖。 由圖3可見(jiàn), 同一基原物種的樣品很好地聚集在每個(gè)橢圓區(qū)及方形區(qū)內(nèi), 兩個(gè)不同集合之間并無(wú)重疊, 可以明顯地鑒別出不同基原物種的忍冬屬藥材樣品。

圖3 四種不同基原忍冬屬藥材的聚類(lèi)模型圖

2.4.2 聚類(lèi)模型校驗(yàn)

隨機(jī)選取4種已知基原的忍冬屬樣品各2份共8個(gè)樣品, 將其紅外光譜圖導(dǎo)入所建聚類(lèi)模型進(jìn)行檢驗(yàn), 結(jié)果校驗(yàn)樣品均被正確識(shí)別, 說(shuō)明此聚類(lèi)模型準(zhǔn)確可用。

3 結(jié) 論

在進(jìn)行紅外光譜比較和相似系數(shù)比較時(shí), 采用紅外光譜平均圖譜進(jìn)行比較研究是建立在樣品個(gè)體光譜之間差異分析的基礎(chǔ)上的。 4種基原忍冬屬藥材樣品個(gè)體光譜研究表明, 來(lái)自同一基原的個(gè)體樣品紅外光譜具有很強(qiáng)的相似度, 譜峰的位置和峰高都比較接近, 可以消除一些由樣品來(lái)源差異而對(duì)基原鑒別結(jié)果產(chǎn)生影響的因素。

采用傅里葉紅外光譜結(jié)合SIMCA聚類(lèi)分析法, 建立了一種快速、 無(wú)損地對(duì)4種不同基原忍冬屬中藥進(jìn)行鑒別的聚類(lèi)分析模型。 不同基原藥材的一維圖譜及二階導(dǎo)數(shù)圖譜都顯示了差異, 二階導(dǎo)數(shù)圖譜比一維圖譜更詳細(xì)直觀(guān)地在峰位置、 峰強(qiáng)度方面顯示了差異性, 驗(yàn)證了一維圖譜的差異度。 進(jìn)一步采用聚類(lèi)分析法對(duì)其進(jìn)行鑒別分級(jí), 根據(jù)類(lèi)間距的差異, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬、 忍冬的相似度稍高, 而黃褐毛忍冬與其他3種藥材的差異最大, 結(jié)合文獻(xiàn)[3], 可以將紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬和忍冬劃分為一類(lèi)、 黃褐毛忍冬來(lái)源樣品為一類(lèi)。 聚類(lèi)分析顯示, 樣品的識(shí)別率和拒絕率均達(dá)到99%以上, 類(lèi)模型圖中不同基原物種兩兩分開(kāi), 實(shí)現(xiàn)了不同基原藥材的鑒別及分級(jí), 表明采用紅外光譜結(jié)合SIMCA聚類(lèi)分析法對(duì)4種不同基原忍冬屬藥材進(jìn)行鑒別及構(gòu)建分級(jí)模型是具有較強(qiáng)的識(shí)別能力, 是科學(xué)合理的。 另外, 本研究中紅外光譜相關(guān)系數(shù)分析、 聚類(lèi)分析結(jié)果相互補(bǔ)充和印證, 可為今后深入研究忍冬屬中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供實(shí)驗(yàn)參考。