荊花蜜質(zhì)量控制指標(biāo)與藥用價(jià)值研究

阮曉雯,張子豪,李燕輝,吳秋媚,朱皓然,殷昌平,王嚇長(zhǎng),李濤,李璇,4

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2. 都安神瑤醫(yī)藥健康管理有限公司,廣西 都安 530799;3. 濟(jì)南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 濟(jì)南 250024;4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中醫(yī)藥健康養(yǎng)生技術(shù)工程研究中心,江蘇 南京 210023)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物結(jié)合后,經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1],我國(guó)藥典記載[2]其性平,歸肺、脾、大腸經(jīng);具有補(bǔ)中,潤(rùn)燥,止痛,解毒,外用生肌斂瘡的功效。主治脘腹虛痛,肺燥干咳,腸燥便秘,解烏頭類藥毒;外治瘡瘍不斂,水火燙傷等。國(guó)內(nèi)外關(guān)于蜂蜜開展了很多研究,其中包括蜂蜜的標(biāo)志性成分分析,藥理活性研究[3]。蜂蜜作為一種天然藥食同源物質(zhì),包括蜜源植物、產(chǎn)地、蜂種、存儲(chǔ)方法等多種因素對(duì)蜂蜜的品質(zhì)均具有顯著影響,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也一直備受關(guān)注。荊條VitexnegundoLinn. Var.Heterophylla(Franch.) Rehd.是我國(guó)常見野生落葉小灌木,在南亞多國(guó)有廣泛分布,有藥用價(jià)值,同時(shí)也是優(yōu)良的蜜源植物。荊花蜜產(chǎn)量豐富,是我國(guó)四大名蜜之一,它具有獨(dú)特的香氣和口感,是深受消費(fèi)者喜愛的蜂蜜品種之一。經(jīng)由蜜蜂采集荊條花蜜露并在蜂巢中釀造成熟的荊花蜜符合世界糧農(nóng)組織標(biāo)準(zhǔn),品質(zhì)優(yōu)于經(jīng)過加熱脫水而制得的蜂蜜產(chǎn)品,但其理化和功能特征研究尚不完善,作為特色單花種蜂蜜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亦尚未建立,這限制了荊花蜜的市場(chǎng)發(fā)展。本文對(duì)其多項(xiàng)理化指標(biāo)和薄層圖譜特征進(jìn)行研究,探索食用荊花蜜對(duì)慢傳輸型便秘模型的影響和改善作用,以期凸顯荊花成熟蜜的品質(zhì)特征,為建立更加科學(xué)和全面可靠的荊花蜜質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物與試劑

荊花蜜由都安神瑤醫(yī)藥健康管理有限公司提供,產(chǎn)地為廣西都安3～4個(gè)固定蜂場(chǎng),年份為2019、2020、2021、2022,共4個(gè)年份樣本,各年份不同蜂場(chǎng)樣本充分混勻后用于實(shí)驗(yàn);采自廣西都安地區(qū)和廣西密云地區(qū)蜂場(chǎng)的干燥荊條花、葉、莖、根由都安神瑤醫(yī)藥健康管理有限公司提供;黃芪蜜、金菊蜜、龍須藤蜜、龍眼蜜、苜蓿蜜、女貞蜜、山花蜜、苕子蜜、油菜蜜、中蜂蜜、中蜂蜜-鹽膚木蜜、中蜂蜜-雜花蜜均由南京中醫(yī)藥大學(xué)校友李曉棟先生收集鑒定并捐贈(zèng);福林酚、羥甲基糠醛、沒食子酸(≥99%)、槲皮素(≥99%)、三氯化鋁、DPPH,對(duì)羥基苯甲酸(≥99%),由上海源葉生物科技有限公司提供;果葡糖漿由廣州雙橋股份有限公司提供;大孔樹脂Amberlite XAD-16、濃硫酸、醋酸酐、甲酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純,由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

SPF級(jí)Balb/c小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡Model YS100,Nikon公司;薄層色譜儀ATS4/ADC2/TLC Visualizer2,Camag公司;蜂蜜波美度計(jì)LB92T,速為電子科技有限公司;電導(dǎo)率儀,上海越平科學(xué)儀器有限公司;pH計(jì)PB-10,Sartorius公司;紫外分光光度計(jì)TU-1810,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;萬分之一天平BSA124S,Sartorius公司;電子天平NewClassic,METTLER TOLEDO公司;超純水儀Milli-Q Direct8,Merck Millipore公司;超聲清洗儀KQ-500DE,昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法

2.1 花粉粒鑒定

稱取蜂蜜樣品10 g,置15 mL離心管中,加入蒸餾水至12 mL,溶解稀釋。以4 000 r·min-1的速度離心10 min,棄去約3/4的上清液,加入2 mL乙酸并用渦旋儀混勻,靜置2 h。將放置后的樣品進(jìn)行離心(4 000 r·min-1,10 min),棄去約1/2的上清液,加入新配制的濃硫酸和醋酸酐的混合液(體積比為9∶1)0.5 mL,并用渦旋儀混勻,然后將離心管放入80 ℃水浴鍋中水浴加熱7 min。停止加熱后,迅速離心(4 000 r·min-1,10 min),棄去1/2上清液,加10 mL蒸餾水混勻,離心(4 000 r·min-1,10 min),棄去4/5上清液。再加入10 mL蒸餾水,離心(4 000 r·min-1,10 min),去上清,留下約3 mL的樣液。取適量樣液放在蓋玻片上,蓋上蓋玻片,將邊緣多余液體用濾紙吸干,用血球計(jì)數(shù)板觀察,蓋玻片一端靠在載玻片上呈45°,然后緩緩放下蓋玻片,防止出現(xiàn)氣泡影響觀察[4]。

2.2 水分含量測(cè)定

打開蜂蜜波美度計(jì)蓋板,取樣品數(shù)滴,置于檢測(cè)棱鏡上,合上蓋板,避免氣泡產(chǎn)生,使溶液遍布棱鏡表面,通過目鏡讀出蜂蜜樣品水分?jǐn)?shù)值。

2.3 電導(dǎo)率的測(cè)定

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 18932.15—2003》規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)量[5],稱取相當(dāng)于20 g蜂蜜樣品,置于100 mL燒杯中,加入40 mL水,用玻璃棒攪拌使之完全溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,再用30 mL水分?jǐn)?shù)次洗滌燒杯后,轉(zhuǎn)移至容量瓶中,最后用水定容至刻度,搖勻。將樣液倒入100 mL燒杯中,將電極放入樣液中,輕輕搖動(dòng),趕出氣泡,待測(cè)定值穩(wěn)定后,記錄樣品的電導(dǎo)率,用mS·cm-1來表示。

2.4 pH測(cè)定

取10 g蜂蜜樣品,溶于75 mL蒸餾水(蒸餾水使用前需煮沸去除CO2并冷卻至室溫)中,充分?jǐn)嚢杌靹?將pH電極插入到溶液中,記錄pH值。

2.5 游離酸、內(nèi)酯、總酸測(cè)定

根據(jù)AOAC所描述的方法[6]進(jìn)行測(cè)定,用氫氧化鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。游離酸的測(cè)定:取10 g蜂蜜樣品,溶于75 mL蒸餾水(蒸餾水使用前需煮沸去除CO2并冷卻至室溫)中,充分?jǐn)嚢杌靹?將pH電極插入到溶液中,記錄pH值。以5 mL·min-1的速率勻速滴加0.05 mol·L-1的NaOH溶液至溶液pH達(dá)到8.5,記錄使用的NaOH溶液的體積為VNaOH。游離酸含量(VNaOH-V空白)×50/m蜂蜜樣品。溶液pH值達(dá)到8.5后,立即加入10 mL 0.05 mol·L-1的氫氧化鈉溶液,然后使用0.05 mol·L-1的HCl溶液反滴至蜂蜜樣品溶液pH值為8.30,記錄使用HCl的體積為VHCl。內(nèi)酯含量為(10-VHCl)×50/m蜂蜜樣品。樣品中的總酸含量為游離酸與內(nèi)醋酸含量的總和。

2.6 淀粉酶活性測(cè)定

2.6.1 溶液的配制 碘儲(chǔ)備液:稱取2.2 g碘化鉀于100 mL容量瓶中,加入3～4 mL水溶解,再稱取0.88 g的碘加入容量瓶中,用水定容至100 mL;碘溶液:稱取4.0 g碘化鉀,用水溶解,置100 mL容量瓶中,再加入1 mL碘儲(chǔ)備液,加水定容至刻度;乙酸鹽緩沖液:稱取8.7 g乙酸鈉于80 mL水中,加入2.1 mL冰乙酸,用水定容至100 mL;氯化鈉溶液:稱取1.45 g氯化鈉,用水溶解并定容至50 mL。按此法重復(fù)制備以備測(cè)量樣品所需;淀粉溶液:溶解2 g淀粉于90 mL水中,迅速煮沸再微沸3 min,至室溫后,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中。

2.6.2 淀粉酶溶液的標(biāo)定 吸取5.0 mL淀粉溶液和10 mL水并分別置于40 ℃水浴中15 min。將淀粉溶液倒入10.0 mL水中并充分混合后,取1.0 mL加到10.0 mL的碘溶液中,混勻,用一定體積的水稀釋后,以水為空白對(duì)照,用分光光度計(jì)于660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,確定產(chǎn)生0.760±0.02吸光度所需稀釋水的體積數(shù),并以此體積數(shù)作為樣品溶液的稀釋倍數(shù)。當(dāng)?shù)矸蹃碓锤淖儠r(shí),需重新標(biāo)定。

2.6.3 樣品測(cè)定 稱取約5 g蜂蜜樣品,置于20 mL燒杯中,加入15 mL水和2.5 mL乙酸鹽緩沖液,移入含有1.5 mL氯化鈉溶液的25 mL容量瓶中并定容。吸取5.0 mL淀粉溶液,10.0 mL樣品溶液和10 mL碘溶液,分別置于40 ℃水浴中15 min,將淀粉溶液倒入樣品溶液中,以前后傾斜的方式充分混合后開始計(jì)時(shí),5 min時(shí)取1.0 mL樣品混合溶液,加入到10.0 mL的碘溶液中,再用淀粉溶液標(biāo)定時(shí)確定的稀釋水的體積數(shù)進(jìn)行稀釋并用前后傾斜的方式充分混合后,以水為空白,用分光光度計(jì)于660 nm處測(cè)定吸光度值。如吸光度>0.235,應(yīng)繼續(xù)按照上述步驟重復(fù)操作,直至吸光度<0.235為止。

2.6.4 計(jì)算 以吸光度值為縱坐標(biāo),檢測(cè)時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)作圖,連接各點(diǎn)成直線,計(jì)算出樣品吸光度與0.235交叉的點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間,按照如下公式計(jì)算:

式中X為樣品中的淀粉酶值,單位為mL·g-1·h-1;t為對(duì)應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間,單位為min。

2.7 5-羥甲基糠醛測(cè)定

2.7.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取0.001 04 g的標(biāo)準(zhǔn)試劑于10 mL容量瓶中,精密稱定,加入甲醇定容至刻度,配成0.104 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋,配成0.325、0.65、1.3、2.6、5.2、10.4 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用0.22 μm的濾膜過濾,注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7.2 樣溶液的制備 吸取1.000 0 g的樣品,精密稱定,置于25 mL燒杯中,加入1 mL甲醇,攪拌均勻,使試樣完全溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,充分混勻。用0.22 μm的濾膜過濾,注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

2.7.3 5-HMF含量測(cè)定 以標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)不同批次蜂蜜樣品中5-HMF含量進(jìn)行測(cè)定。

2.8 總酚含量測(cè)定

2.8.1 溶液的配制 福林酚試劑的配制:取原裝的福林酚試劑(濃度為2 mol·L-1),加蒸餾水14 mL,充分混合,得0.25 mol·L-1的福林酚試劑;15%碳酸鈉溶液的配制:取無水的碳酸鈉1.111 9 g,溶于20 mL水中,混勻,即得。

2.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg,用甲醇溶解并定容到25 mL,得0.2 mg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液;對(duì)照品溶液的制備:精密吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液1、1.5、2、2.5、3、4、5 mL,分別置25 mL量瓶中,并用甲醇定容至刻度,制成不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取0.25 mol·L-1福林酚試劑1 mL到不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中,混合,靜置3 min,加入2 mL的15%碳酸鈉溶液,搖勻,置水浴鍋45 ℃加熱90 min冷卻至室溫,離心,取上清液。另取甲醇1 mL,同法操作,作為空白對(duì)照溶液。

用樣品溶液將比色皿潤(rùn)洗3次,分別吸取對(duì)照品溶液2 mL注入比色皿中,測(cè)定吸光度(A);以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到回歸方程。

2.8.3 樣品溶液的制備及測(cè)定 取樣品1.000 0 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度。取樣品溶液1 mL,加入0.25 mol·L-1林酚試劑1 mL,混合,靜置3 min,加入2 mL 15%的碳酸鈉溶液,搖勻,至45 ℃水浴中加熱90 min,冷卻至室溫,離心,取上清液于波長(zhǎng)760 nm測(cè)定吸光度(A)。另取甲醇1 mL,同法操作,作為空白對(duì)照溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品的濃度(C,mg·kg-1)。

2.9 總黃酮含量的測(cè)定

2.9.1 溶液的配制 3 mg·mL-1槲皮素儲(chǔ)備液:精密稱取槲皮素樣品30 mg,甲醇定容至10 mL; 25、75、125、175、225 μg·mL-1槲皮素溶液:取適量?jī)?chǔ)備液加入甲醇定容至10 mL;5%氯化鋁溶液:精密稱取5 g氯化鋁固體,溶解于少量甲醇中,隨后用甲醇定容至100 mL,超聲30 min。

2.9.2 測(cè)定 取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL,加入15 mL甲醇,隨后加入0.5 mL 5%氯化鋁溶液,最后繼續(xù)用甲醇定容至25 mL容量瓶中,暗室靜置30 min后,在425 nm處測(cè)定其吸光度,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.99)。

精密稱取荊花蜜10 g和果葡糖漿30 g,置于25 mL容量瓶中,加入15 mL左右甲醇混勻后,加入5%氯化鋁0.5 mL,再以甲醇定容至25 mL,以上各個(gè)樣品需做3組平行。暗室中靜置30 min后,在425 nm下測(cè)定其吸光度。

2.10 DPPH清除能力的測(cè)定

2.10.1 溶液的配制 300 μmol·L-1DPPH溶液:精密稱取12 mg DPPH固體,先溶解于少量甲醇中,隨后用甲醇定容至100 mL容量瓶中(現(xiàn)配現(xiàn)用);荊花蜜240 mg·mL-1溶液:稱取荊花蜜2.4 g,甲醇定容至10 mL;果葡糖漿1 350 mg·mL-1溶液:稱取果葡糖漿13.5 g,甲醇定容至10 mL。

2.10.2 DPPH清除能力測(cè)定 準(zhǔn)備7個(gè)試管,編號(hào)0～6,按表1配制反應(yīng)溶液。

表1 DPPH清除能力測(cè)定加樣量表(mL)

0～6號(hào)管先加甲醇和樣品溶液,再加DPPH時(shí),每管間隔1 min。加完后搖勻,確?；旌暇鶆?30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度。

2.10.3 EC50的計(jì)算 DPPH剩余量的計(jì)算:

K1(%)=A1×100/A0

其中,K1: DPPH 剩余量%;A0:0號(hào)管的吸光度值;A1:不同濃度樣品試管的吸光度值。

EC50值的計(jì)算:

以樣品溶液濃度為橫坐標(biāo)(mg·mL-1),DPPH剩余量(%)為縱坐標(biāo)作直線圖,顯示公式

y=ax+b

其中a為直線的斜率,b為直線的截距, EC50=(50-b)/a。

2.11 薄層色譜鑒別

2.11.1 供試品溶液的制備 取蜂蜜樣品50 g,置500 mL燒杯中,加入250 mL溶液(pH=2的鹽酸水溶液),用棉花過濾以除去固體顆粒。然后將濾液加入Amberlite XAD-16樹脂柱進(jìn)行分離,首先用pH=2的鹽酸水100 mL洗脫,再加入300 mL蒸餾水洗脫,除去糖和其他極性的化合物;再用300 mL甲醇洗脫,得到中小極性成分,40 ℃減壓干燥,將殘留物溶解在5 mL水中,用乙酸乙酯萃取(5 mL×3),合并乙酸乙酯萃取液,減壓干燥,1 mL甲醇復(fù)溶,即得[7-8]。

取不同產(chǎn)地的荊條的根、莖、葉、花粉末,稱取約2 g,加入25 mL甲醇,超聲提取30 min,過濾,取上清,即得。

2.11.2 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含對(duì)羥基苯甲酸0.98 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.11.3 展開劑的選擇 照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn),吸取供試品溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(5∶4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。

2.12 對(duì)小鼠便秘模型的影響

將BALB/c小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、糖漿5%組、荊花蜜1.7%、5%、15%組,每組10只,雌雄各半?？瞻捉M和模型組飲用滅菌水,其他組自由飲用相應(yīng)飲水,并記錄體質(zhì)量,連續(xù)4周。依據(jù)文獻(xiàn)給予造模藥物鹽酸洛哌丁胺[9],實(shí)驗(yàn)結(jié)束前2 d,每日灌胃給予鹽酸洛哌丁胺50 mg·kg-1誘導(dǎo)便秘模型小鼠,更換新籠盒,立即收集5 h糞便,稱取質(zhì)量、記錄濕糞便質(zhì)量W1,以比較組間排便量差異;然后將各組小鼠的糞便放入鼓風(fēng)機(jī)內(nèi)進(jìn)行高溫烘干、脫水。鼓風(fēng)機(jī)設(shè)置為 100 ℃,連續(xù)烘干 2 h,再次進(jìn)行稱質(zhì)量,記錄干糞便質(zhì)量W2。造模完成后,小鼠禁食過夜以排空腸內(nèi)容物。至第2天上午開始進(jìn)行小鼠腸道推進(jìn)率檢測(cè)。具體方法為:每只小鼠經(jīng)口灌0.2 mL印度墨水,15 min 后脫頸椎處死。迅速打開小鼠腹腔,取出自幽門至肛門的全腸道,無張力拉直后測(cè)量腸道全長(zhǎng)L1;然后再測(cè)量墨汁在腸道內(nèi)的行進(jìn)長(zhǎng)度L2,計(jì)算小鼠腸道推進(jìn)率D=L2/L1×100%。

2.13 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 花粉粒鑒定

參照文獻(xiàn)中荊條花粉特征顯微鏡下觀察[10],荊條花粉為近球形,極面觀為三裂圓形,赤道面觀為近圓形。花粉大小赤徑為微米左右。具三溝。外壁兩層,厚度幾乎相等,表面具不明顯的顆粒狀雕紋,如圖1所示,2022年的荊花蜜的花粉特征與上述描述相符,且占比超過80%,2019—2021年結(jié)果與2022年一致。

圖1 荊花蜜花粉粒鑒別顯微圖

3.2 水分、電導(dǎo)率、pH值

如表2所示,四年份蜂蜜的水分均小于20%,符合國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)以及中國(guó)一級(jí)蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)要求,通過優(yōu)化蜂蜜生產(chǎn)過程,水分可以達(dá)到18%以下。

表2 2019～2022四年份荊花蜜理化指標(biāo)

蜂蜜的電導(dǎo)率受蜜種及成分、溫度、水分、加工狀態(tài)等影響,是反映蜂蜜來源的重要指標(biāo),常用的蜂蜜摻假手段是添加果葡糖漿,這也會(huì)引起蜂蜜電導(dǎo)率的變化[11]。通過電導(dǎo)率儀對(duì)蜂蜜樣品的電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表2所示,果葡糖漿電導(dǎo)率不足0.1 mS·cm-1,而四年份荊花蜜樣品電導(dǎo)率在0.24～0.28之間均低于0.8 mS·cm-1,均符合歐盟及CAC相關(guān)規(guī)定,荊花蜜的電導(dǎo)率范圍仍需更多樣品數(shù)據(jù)的積累以制定出合理的數(shù)值范圍。

蜂蜜一般為酸性,且荊條蜜中含有較多的酸性物質(zhì),如有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì);除此之外,蜂蜜的采集和貯存過程也會(huì)對(duì)蜂蜜的pH產(chǎn)生影響。通過pH計(jì)對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表2所示,四年份荊花蜜樣品的pH在3.67～3.93之間。

3.3 游離酸、總酸、內(nèi)酯

蜂蜜中的游離酸主要來源于其成熟過程中糖的氧化產(chǎn)生的葡萄糖醛酸和蘋果酸等有機(jī)酸,在蜂蜜成熟或貯存的過程中,蜂蜜中的氧化酶和酵母能夠分解葡萄糖產(chǎn)生乙醇進(jìn)一步氧化產(chǎn)生乙酸,造成蜂蜜酸敗變質(zhì),故各國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)均對(duì)蜂蜜中的游離酸含量做出了含量限度規(guī)定(歐盟規(guī)定不得超過50 meq·kg-1)。四年份蜂蜜樣品測(cè)定結(jié)果如表2所示,游離酸含量27.3～32.3 meq·kg-1,內(nèi)酯含量為15.6～21.5 meq·kg-1,總酸含量35.4～53.7 meq·kg-1之間。

3.4 淀粉酶活性、5-羥甲基糠醛

蜂蜜中存在多種活性酶,淀粉酶就是其中一種,有相關(guān)研究表明[12-14],淀粉酶可以作為衡量蜂蜜樣品是否被加工處理、新鮮程度、是否被加熱處理、蜂蜜質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)指標(biāo)。目前。歐盟及CAC委員會(huì)規(guī)定的蜂蜜中淀粉酶含量不低于8。根據(jù)蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 18932.16—2003》采用紫外分光光度法對(duì)四年份蜂蜜樣品進(jìn)行淀粉酶含量的測(cè)定,結(jié)果顯示(表2),淀粉酶活性17.6～21.5 U。由此說明樣品新鮮程度較好,質(zhì)量合格。

5-羥甲基糠醛(5-HMF)是蜂蜜中的葡萄糖和果糖在酸性條件下經(jīng)加熱脫水形成的一種物質(zhì),是衡量蜂蜜新鮮度的一項(xiàng)重要指標(biāo),含量越少,說明蜂蜜質(zhì)量越好,新鮮純正的蜂蜜甚至不含有5-HMF。加拿大、美國(guó)、歐盟、CAC標(biāo)準(zhǔn),都對(duì)蜂蜜中羥甲基糠醛做了限量規(guī)定,要求蜂蜜中5-HMF含量小于40 mg·kg-1。通過采用HPLC的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表1所示,四年份蜂蜜樣品5-HMF含量均小于40 mg·kg-1,符合相關(guān)含量規(guī)定。通過測(cè)量結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),5-HMF含量:2019年>2020年>2021年>2022年,說明5-HMF含量隨存放時(shí)間的增加而增加,也驗(yàn)證了5-HMF是檢驗(yàn)蜂蜜新鮮度的指標(biāo)。

3.5 總酚、黃酮含量及DPPH清除能力

蜂蜜具有一定抗氧化活性,酚類和黃酮類成分是蜂蜜抗氧化的主要物質(zhì)基礎(chǔ),蜂蜜中的酚類和黃酮類化合物含量越高,則其抗氧化活性越好。因此酚類和黃酮類化合物也是目前相關(guān)研究的重點(diǎn)。結(jié)果如表2所示,四年份荊花蜜多酚類化合物含量在450～650 mg·kg-1之間,總黃酮含量在16.3～26.6 mg·kg-1之間,EC50為67.5～90.1 mg·mL-1。

3.6 薄層鑒別

薄層色譜作為一個(gè)傳統(tǒng)的質(zhì)量控制的方法,具有操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。相較于GC-MS、LC-MS/MS等方法,TLC容易操作[15]。對(duì)荊花蜜的薄層色譜進(jìn)行研究,可為鑒別不同蜂蜜提供參考,實(shí)現(xiàn)更好的荊花蜜質(zhì)量控制。

我國(guó)南北都有荊條分布,為了探索荊條蜜成分與蜜源植物之間的關(guān)系,本文對(duì)來源于具有南北代表性的廣西都安和北京密云地區(qū)的荊條的根、莖、葉、花樣品進(jìn)行提取,采用建立的薄層色譜方法進(jìn)行分析,為項(xiàng)目后期研究蜜源植物區(qū)域分布與荊花蜜質(zhì)量控制的關(guān)系的研究提供更多數(shù)據(jù)支持。結(jié)果如圖2所示,荊花蜜薄層色譜圖呈現(xiàn)出相似的條帶特征,同時(shí),對(duì)產(chǎn)于廣西都安和北京密云的荊條植物根、莖、葉、花進(jìn)行分析,通過與荊花蜜之間的薄層色譜進(jìn)行對(duì)比,可以確定一種共有成分同時(shí)存在于荊條花和荊條葉中,與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比確認(rèn)該化學(xué)成分為對(duì)羥基苯甲酸。在254 nm檢測(cè)條件下,荊花蜜在Rf值為0.71時(shí)顯黑色斑點(diǎn),可以明顯地區(qū)別荊花蜜與其他品種的蜂蜜,而在366 nm檢測(cè)條件下,各批荊花蜜主要斑點(diǎn)相似。

注:1. 根-都安;2. 根-密云;3. 莖-都安;4. 莖-密云;5. 花-都安;6. 花-密云;7. 葉-都安;8. 葉-密云;9. 對(duì)羥基苯甲酸;10. 2019年荊花蜜;11. 2020年荊花蜜;12. 2021年荊花蜜

對(duì)包括荊花蜜在內(nèi)的13種可溯源蜂蜜樣品進(jìn)行薄層色譜分析,結(jié)果如圖3所示,各樣品薄層色譜特征均有所不同, 但能否作為不同蜂蜜的鑒別技術(shù)手段應(yīng)用還需更多數(shù)據(jù)積累比對(duì)。

注:1.苜蓿蜜;2.苕子蜜;3.黃芪蜜;4.油菜蜜;5.金菊蜜;6.中蜂蜜;7.女貞蜜;8.龍眼蜜;9.中蜂蜜-雜花蜜;10.山花蜜;11.中蜂蜜-鹽膚木;12.龍須藤蜜;13.荊花蜜

3.7 荊花蜜改善小鼠便秘模型腸道功能

鹽酸洛哌丁胺作用于腸壁阿片受體,組織乙酰膽堿和前列腺素的釋放[6],從而抑制腸蠕動(dòng),延長(zhǎng)腸內(nèi)容物的滯留時(shí)間,可用于制作小鼠便秘模型。小鼠每日自由飲用蜂蜜水4周后,給予造模藥物,飲用5%、15%蜂蜜水的小鼠濕糞質(zhì)量、干糞質(zhì)量和小腸推進(jìn)率都有明顯增加,這表明飲用蜂蜜水可以使便秘模型的便秘癥狀得到改善和緩解。飲用相近濃度的果葡糖漿溶液能促進(jìn)小腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng),但對(duì)于濕糞和干糞質(zhì)量無明顯影響。連續(xù)四周飲用果葡糖漿和不同濃度荊花蜜水對(duì)體質(zhì)量無明顯影響,如圖4所示。

4 討論

蜂蜜是人類最早的甜味物質(zhì),數(shù)千年來一直深受人類的喜愛,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有我國(guó)人民食用蜂蜜的記載,我國(guó)也擁有悠久的養(yǎng)蜂和食用蜂蜜的傳統(tǒng)。到了近代,戰(zhàn)亂不斷,我國(guó)的養(yǎng)蜂業(yè)逐漸落后于世界先進(jìn)水平。關(guān)于新西蘭的麥盧卡蜂蜜的專門研究始自20世紀(jì)90年代,自2007年起發(fā)表科研論文數(shù)量逐年增加,多國(guó)科學(xué)家合作研究了麥盧卡蜂蜜特征成分“丙酮醛MGO”的來源及轉(zhuǎn)化條件[16-19],德國(guó)科學(xué)家研究結(jié)果表明美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物是麥盧卡的特定成分[19]。麥盧卡蜂蜜的抗菌[20]、抗炎、修復(fù)傷口、抗氧化、抗腫瘤等作用也相繼被發(fā)表[20-24]。建立在這些科學(xué)研究基礎(chǔ)之上,麥盧卡蜂蜜迅速成為蜂蜜產(chǎn)品領(lǐng)域中的殿堂級(jí)產(chǎn)品,價(jià)高難求,也為蜂蜜的研究提供了良好的思路。由此,本研究立足于荊花蜜的品質(zhì)與藥用價(jià)值兩方面,研究荊花蜜的質(zhì)量控制指標(biāo)和其代表功能,以期為后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)制定和產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

蜂蜜的品質(zhì)與蜜源植物密切相關(guān)。荊條蜜的蜜源植物為馬鞭草科(Verbenaceae)植物黃荊(Vitexcen-nalrfalia Sieb. et Zuee.)的一個(gè)變種,稱之為荊條。黃荊適宜生存在熱帶及溫帶地區(qū),南亞很多國(guó)家都有分布,如中國(guó)、印度尼西亞、印度和菲律賓等,生長(zhǎng)于海拔1 500 m處,在我國(guó)黃荊廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及南部各省區(qū)。黃荊生自山野間,為落葉灌木,葉對(duì)生,長(zhǎng)柄,掌狀復(fù)葉13-5小葉,披針形或長(zhǎng)橢圓形,邊緣如粗鋸齒,頭銳尖,頂生圓錐花序,夏日開淡紫色小唇形花,結(jié)小球形核果,黑熟。《中國(guó)藥物植物志》載:“牡荊與黃荊,最相近似,然不難鑒別,牡荊毛雖細(xì)密,但均直立,不似黃荊毛之相互織為絨毛狀,牡荊的葉面綠色,而黃荊的葉的下面為粉白色,牡荊的葉具鋸齒,黃荊正種則為全綠,或只具小齒”。又載“黃荊條為黃荊的變種,其異于黃荊者在深裂如羽狀的小葉,在黃荊則為全綠或只具淺齒,有時(shí)黃荊條的小葉也只具粗齒,形如牡荊,惟牡荊的葉下面綠色是其異點(diǎn)”?，F(xiàn)在一般認(rèn)為本品有3種:①牡荊VitexnegundoL. var.cannabifolia(Sieb. et Zucc.)Hand.-Mazz.;②黃荊VitexNegundoLinn.;③黃荊條VitexNegundoZinnVerincisa(Lam) clarke。在藥用上的性質(zhì),均完全相同[25]。本研究發(fā)現(xiàn),2019、2020、2021和2024年荊花蜜中,除了穩(wěn)定存在的1個(gè)成分對(duì)羥基苯甲酸外,還有7個(gè)共有成分有待鑒定,本研究后續(xù)將推進(jìn)相關(guān)研究,完成荊花蜜指紋圖譜的繪制。

注:A. 荊花蜜對(duì)連續(xù)4周體質(zhì)量的影響;B.荊花蜜對(duì)小腸推進(jìn)率的影響;C.荊花蜜對(duì)濕糞質(zhì)量的影響;D.荊花蜜對(duì)干糞質(zhì)量的影響。Con.空白對(duì)照組;M.模型組;Sy.果葡糖漿5%飲用組;ViH1.7.荊花蜜1.7%飲用組;ViH5.荊花蜜5%飲用組;ViH15.荊花蜜15%飲用組; W1.實(shí)驗(yàn)第1周;W2.實(shí)驗(yàn)第2周;W3.實(shí)驗(yàn)第3周;W4.實(shí)驗(yàn)第4周。與對(duì)照組相比,#P<0.05;與模型組相比,@P<0.05。

圖4 荊花蜜對(duì)小鼠便秘模型的影響

Fig.4 Effect of Vitex honey on mouse constipation model

黃荊子、葉、枝及根均可入藥。黃荊子即為植物的種子,亦即《本草綱目》所載的黃荊子,能“祛風(fēng)滌痰鎮(zhèn)咳”,八九月間采實(shí)陰干供藥用。黃荊有止咳、祛痰及緩解支氣管痙攣的作用,主治感冒、咳嗽、哮喘、風(fēng)痹、瘧疾、胃痛、疝氣、痔漏。黃荊葉清熱解表,利濕解毒,主治感冒、中暑、吐瀉、痢疾、瘧疾、黃疸、風(fēng)濕、跌打腫痛、創(chuàng)痛疥癬,并能防止甲醛性關(guān)節(jié)炎腫脹的發(fā)生[26]。在黃荊中共發(fā)現(xiàn)四大類共120種化合物,主要是類黃酮、木脂素、萜類和類固醇化合物[27]。Gill等綜述了黃荊提取物中的活性成分抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗癌、抗微生物等多種功能及其作用機(jī)制的研究[28]。荊條蜜的成分與功能研究相關(guān)的文獻(xiàn)并不多。中國(guó)的荊條蜜總酚和總黃酮含量分別為344～520 mg·kg-1(GAE)和19～31 mg·kg-1(蘆丁),給予大鼠20 g·kg-170 d后,能提高撲熱息痛所致肝毒性大鼠血清中抗氧化相關(guān)指標(biāo),改善肝功能相關(guān)指標(biāo)[29]。柴霞等[30]報(bào)道了果蠅培養(yǎng)基中加入荊條蜜能促進(jìn)果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育、延緩衰老、抗氧化,提高繁殖能力。郭順悅等[31]報(bào)道通過HPLC-MS/MS鑒定出荊條蜜中的獨(dú)特成分3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷,將其命名為荊條素(Vitexin)。張永清等[32]應(yīng)用實(shí)時(shí)LAMP方法對(duì)荊條蜜真實(shí)性進(jìn)行快速檢測(cè)。本團(tuán)隊(duì)后續(xù)將繼續(xù)進(jìn)行荊花蜜功能-物質(zhì)基礎(chǔ)關(guān)系研究,以闡明其可能的作用機(jī)理。