circZMYM2/miR-29a/PUMA軸對急性胰腺炎腺泡細胞凋亡的影響及作用機制

高明，王琪，孫遠松，李賀

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 急診外科，安徽 合肥 230601）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床上最常見的急腹癥之一，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)正以每年3.07%的增長幅度逐年提升，其總體病死率約為1%[1]。盡管AP患者大多數(shù)臨床分類為輕度和中度AP，但仍有1/5的患者進展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），表現(xiàn)為持續(xù)性單個器官或多器官功能衰竭，其病死率高達20%[2]。故在疾病早期進行及時有效的針對性干預(yù)治療顯得尤為重要，目前臨床治療上多采用早期目標(biāo)導(dǎo)向液體復(fù)蘇、腸內(nèi)外營養(yǎng)、鎮(zhèn)痛等對癥支持治療，尚缺乏特異性的治療藥物或干預(yù)方法[3]。相關(guān)研究表明，線粒體膜通透性改變引起線粒體功能障礙，進而導(dǎo)致自噬受損、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是引起細胞凋亡和壞死的普遍機制[4]，而胰腺腺泡細胞凋亡是介導(dǎo)AP發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其在促進炎癥反應(yīng)和多器官繼發(fā)損傷方面發(fā)揮重要作用[5-6]。因此，恢復(fù)腺泡細胞凋亡失調(diào)成為治療AP的潛在靶點和方向之一。Wang等[7]表明，敲除鋅指蛋白基因ZMYM2轉(zhuǎn)錄環(huán)狀核糖核酸（zinc finger protein gene ZMYM2 transcribed circular RNA，circZMYM2）可使表達乙型肝炎病毒X蛋白的肝細胞免于DNA損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡；Wang等[8]發(fā)現(xiàn)上調(diào)微小RNA-29a（miR-29a）可改善糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能、減輕心肌組織學(xué)異常和纖維化并降低心肌細胞凋亡；何勇等[9]通過對AP相關(guān)肺損傷的肺組織檢測發(fā)現(xiàn)p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）上調(diào)可促進肺泡上皮細胞凋亡。因此，本研究分析AP腺泡細胞中circZMYM2、miR-29a、PUMA表達水平的變化及其相互關(guān)系，以期為AP的治療提供新靶點及新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠胰腺腺泡細胞AR42J購自上海佰利萊生物科技有限公司；DMEM-F12培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；雨蛙素購自北京索萊寶科技有限公司；pcDNA3.1-si-ZMYM2購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；RAPI蛋白裂解液購自愛必信（上海）生物科技有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自合肥萊爾生物科技有限公司；兔多克隆抗PUMA抗體、鼠單克隆β-actin抗體、山羊抗兔IgG抗體、CCK-8檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-APC細胞凋亡檢測試劑盒、TUNEL檢測試劑盒均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Immobilon? Western HRP底物試劑盒及電泳槽、TRIzol試劑、PrimeScript RT Master混合物、SYBR Premix Ex TaqTM試劑及熒光定量PCR檢測儀、細胞培養(yǎng)箱、全自動多功能酶標(biāo)儀、FACS Caliber流式細胞分析儀均由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研實驗中心付費提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 將AR42J腺泡細胞種于含10%胎牛血清和1%青霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中，再將培養(yǎng)基置于37 ℃條件下、5% CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中保存培養(yǎng)。培養(yǎng)基每48 h更換1次，細胞每周傳代1次，生長和適應(yīng)4～6周后進行實驗。將AR42J腺泡細胞分為對照組、AP組和si-circZMYM2組。對照組不作處理，AP組用10 nmol/L濃度的雨蛙素誘導(dǎo)AP體外模型，si-circZMYM2組使用pcDNA3.1-si-ZMYM2對AR42J腺泡細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的AR42J腺泡細胞置于37 ℃條件下、5% CO2濃度的2 mL正常培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后與AP組同時按照10 nmol/L濃度的雨蛙素誘導(dǎo)AP體外模型。3 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 生化檢測 取上清液并以1 000 r/min離心5 min，采用ELISA法檢測淀粉酶水平。

1.2.3 細胞活力檢測 用CCK-8檢測試劑盒檢測AR42J腺泡細胞活力，加入CCK-8溶液10 μL后在37 ℃條件下、5% CO2濃度環(huán)境中孵育4 h，通過酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。

1.2.4 細胞凋亡檢測 ⑴ 流式細胞術(shù)：AR42J腺泡細胞用磷酸緩沖溶液（PBS）洗滌2次，使用膜聯(lián)蛋白V-APC細胞凋亡檢測試劑盒進行染色，所有流式細胞術(shù)分析均使用FACS Caliber流式細胞分析儀進行。⑵ TUNEL法：加入原位細胞死亡檢測試劑并在37 ℃條件下孵育1 h后檢測AR42J腺泡細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測 在RAPI蛋白裂解液中裂解后，通過BCA蛋白檢測試劑盒完成總蛋白的定量檢測，再采用SDS-PAGE電泳2 h進行蛋白質(zhì)分離，并轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜上。然后將膜浸泡在Tris緩沖鹽水和5%脫脂牛奶中并在室溫下封閉2 h，最后與以下抗體混合并在4 ℃條件下培養(yǎng)過夜，包括兔多克隆抗PUMA抗體以及鼠單克隆β-actin抗體。用TBST緩沖液洗滌3次后再加入HRP標(biāo)記的抗體山羊抗兔IgG并在室溫下孵育2 h。最后，使用Immobilon? Western HRP底物試劑盒觀察顯色；采用Quantity One version 4.6.9 進行密度定量分析。以β-actin作為內(nèi)參對照。

1.2.6 qRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑裂解AR42J腺泡細胞后分離提取總RNA，并用PrimeScript RT Master混合物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑進行qRT-PCR檢測，使用GAPDH和U6作為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔCT法檢測circZMYM2相對于GAPDH、miR-29a相對于U6的表達情況。qRT-PCR中使用的所有不同引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers sequence for qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用Excel 2019記錄，采用IBM SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8軟件進行圖形生成，服從正態(tài)分布的測量值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異對比使用單因素方差分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 淀粉酶水平比較

ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，AP組和si-circZMYM2組淀粉酶水平均明顯升高（均P＜0.01），表明AP細胞模型成功建立，但si-circZMYM2組淀粉酶水平明顯低于AP組（P＜0.01）（圖1）。

圖1 各組細胞淀粉酶水平比較Figure 1 Comparison of amylase levels among the groups of cells

2.2 細胞活力比較

CCK-8實驗結(jié)果顯示，AP組和si-circZMYM2組的細胞活力均明顯低于對照組（均P＜0.01），而sicircZMYM2組細胞活力明顯高于AP組（P＜0.01）（圖2）。

圖2 各組細胞活力比較Figure 2 Comparison of cell viability among the groups of cells

2.3 細胞凋亡情況比較

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，AP組和sicircZMYM2組細胞凋亡率均顯著高于對照組（均P＜0.01），而與AP組比較，si-circZMYM2組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）（圖3A）。TUNEL法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，AP組和si-circZMYM2組凋亡細胞數(shù)均明顯增加（均P＜0.01），但si-circZMYM2組凋亡細胞數(shù)明顯低于AP組（P＜0.01）（圖3B）。

圖3 各組細胞凋亡情況比較 A：流式細胞術(shù)檢測；B：TUNEL法檢測Figure 3 Comparison of cell apoptosis status among the groups A: Flow cytometry determination; B: TUNEL assay

2.4 PUMA蛋白表達水平比較

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，PUMA蛋白表達水平在AP組和si-circZMYM2組中均明顯升高（均P＜0.01），但si-circZMYM2組PUMA水平明顯低于AP組（P＜0.01）（圖4）。

圖4 各組細胞PUMA蛋白表達水平比較Figure 4 Comparison of PUMA protein expression levels among the groups of cells

2.5 circZMYM2及miR-29a表達水平比較

qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示，circZMYM2表達水平在AP組明顯高于對照組，而在si-circZMYM2組明顯低于對照組和AP組（均P＜0.01）；miR-29a表達水平在AP組明顯低于對照組，而在si-circZMYM2組中明顯高于對照組和AP組（P＜0.01）（圖5）。

圖5 各組細胞circZMYM2及miR-29a表達水平比較Figure 5 Comparison of circZMYM2 and miR-29a expression levels among the groups of cells

3 討 論

AP是多種病因引起的胰酶過度激活釋放、胰腺實質(zhì)自身消化的急性炎癥性疾病[10]，常見病因包括高脂血癥、膽源性結(jié)石繼發(fā)膽胰管梗阻、酒精、內(nèi)鏡逆行胰膽管造影以及藥物等，上述病因觸發(fā)胰腺腺泡細胞一系列病理通路和細胞器功能障礙，最終導(dǎo)致腺泡細胞凋亡壞死以及局部或全身性炎癥反應(yīng)[11]。發(fā)生AP時，在嚴重或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）破壞保護性細胞反應(yīng)從而引起不可逆的細胞損傷，細胞凋亡信號通路被激活、細胞凋亡和炎癥反應(yīng)隨之發(fā)生[12]。細胞凋亡被認為與AP的進展密切相關(guān)，AP中非胰腺器官的損傷主要即由細胞凋亡引起[13-14]。因此，進一步探究凋亡機制及信號通路，通過對信號通路相關(guān)蛋白的調(diào)控來改善細胞凋亡途徑，延緩甚至逆轉(zhuǎn)AP的發(fā)展病程，成為了治療AP潛在有吸引力的治療靶點和思路。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類非編碼閉環(huán)RNA，具有結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定性、細胞組織特異性表達、物種間高度保守等特征[15-16]。其中circZMYM2基因編碼一種鋅指蛋白，主要定位于細胞核，根據(jù)circBase收錄信息，circZMYM2可通過反向剪接產(chǎn)生60個環(huán)狀RNA。circRNA富含穩(wěn)定的微小核糖核酸（microRNA，miRNA）應(yīng)答元件，后者作為一種重要的競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNA結(jié)合，發(fā)揮miRNA海綿作用，常通過負調(diào)控miRNA調(diào)節(jié)下游靶基因表達水平[17]。An等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，circZMYM2可以通過對其靶點miR-335-5p的海綿作用來抑制miR-335-5p的表達，調(diào)節(jié)下游致癌基因JMJD2C的表達水平并調(diào)控細胞凋亡，從而延緩胰腺癌的進展。吳明浩等[19]的研究表明circKIF4A可與miR-515-5p結(jié)合發(fā)揮海綿作用并靶向下游SLC7A11的表達，在結(jié)直腸癌的生長與侵襲中可能發(fā)揮重要作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)，circZMYM2表達水平在AP組中顯著高于對照組、miR-29a表達水平顯著低于對照組，而通過對circZMYM2進行轉(zhuǎn)染抑制表達后，與AP組相比，circZMYM2表達水平顯著降低、miR-29a表達水平顯著升高，腺泡細胞活力顯著增加、細胞凋亡率及凋亡細胞數(shù)顯著降低，初步表明circZMYM2可能同樣包含有相應(yīng)競爭性內(nèi)源ceRNA并與miR-29a結(jié)合發(fā)揮miRNA海綿作用，并通過負調(diào)控來下調(diào)miR-29a水平，從而在AP中調(diào)控腺泡細胞凋亡。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長度約為18到25個核苷酸的小型非編碼RNA，這些小分子RNA可以在翻譯或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mRNA及靶基因的表達，從而在細胞多種生理和病理過程如增殖、轉(zhuǎn)移、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用[20]。miR-29家族是疾病中最常見的關(guān)聯(lián)miRNA之一，在多種疾病如骨關(guān)節(jié)炎[21]、骨質(zhì)疏松癥[22]和惡性腫瘤[23]中均有異常表達，是上述疾病的病因?qū)W和發(fā)病機制的核心，其中以miR-29a表達最為豐富[24]。相關(guān)研究[25]表明，在炎癥刺激誘導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)中，促炎細胞因子可激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子并導(dǎo)致包括miR-29a在內(nèi)的多種miRNA的上調(diào)。Hsu等[26]雖已在糖尿病腎小球功能障礙中證實過表達miR-29a可以通過DKK1/Wnt/β-catenin信號通路挽救高糖誘導(dǎo)的小鼠系膜細胞凋亡并具有保護作用，但在AP等急性炎癥性疾病中尚無研究。本研究通過建立AP細胞模型發(fā)現(xiàn)，AP組中miR-29a表達水平顯著低于對照組，而通過對circZMYM2進行表達抑制后，與AP組相比，si-circZMYM2組的miR-29a表達水平顯著升高，而PUMA水平顯著下降、細胞凋亡率及凋亡細胞數(shù)明顯減少，本研究初步表明miR-29a在AP中可能具有抗凋亡作用，其表達水平可能受circZMYM2調(diào)控，亦可調(diào)控下游PUMA的表達而參與腺泡細胞凋亡。

PUMA作為B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）家族中促凋亡的BCL-2同源3（BH3）成員，是各種刺激誘導(dǎo)細胞凋亡的最有效介質(zhì)之一[27]。其中只有PUMA-α和PUMA-β編碼蛋白顯示出促凋亡活性，它們與線粒體膜中的BCL-2家族成員相互作用，直接激活促凋亡載體BCL-2相關(guān)X蛋白（BCL-2-associated X protein，BAX）和/或BCL-2拮抗劑（BCL-2 antagonist/killer，BAK），從而導(dǎo)致線粒體外膜通透（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP）及線粒體功能障礙、凋亡分子釋放以及caspase級聯(lián)激活，最終誘導(dǎo)細胞凋亡壞死[28]。目前已有研究[29]表明miR-29a可調(diào)控Bax和PUMA的表達、Caspase-3的激活以及細胞凋亡。Wei等[30]通過螢光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot分析進一步證明了miR-29a在成熟交感神經(jīng)元中能夠靶向調(diào)控促凋亡BCL-2家族成員PUMA的表達。本研究發(fā)現(xiàn)在AP組中PUMA表達水平顯著升高，細胞活力下降、細胞凋亡率及凋亡細胞數(shù)明顯增加，而通過對circZMYM2進行表達抑制后，腺泡細胞miR-29a表達水平顯著升高，而PUMA水平顯著下降、細胞凋亡率及凋亡細胞數(shù)明顯減少，表明miR-29a對促凋亡基因PUMA可能起負調(diào)控作用并抑制其表達，從而調(diào)控腺泡細胞凋亡。

綜上所述，circZMYM2在AP的腺泡細胞中表達水平顯著升高，其可能通過內(nèi)源競爭性作用與miR-29a結(jié)合并抑制miR-29的表達，從而上調(diào)下游靶基因PUMA的表達水平并誘導(dǎo)腺泡細胞凋亡，而通過抑制circZMYM2表達可上調(diào)miR-29a表達水平并抑制下游PUMA表達水平，進而減少腺泡細胞凋亡，據(jù)此筆者推測circZMYM2/miR-29a/PUMA軸可能在AP的腺泡細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用，為AP的特異性治療方面提供新靶點及新思路。然而，本研究也存在一定局限性，如未在臨床水平檢測正常患者和AP患者circZMYM2、miR-29a及PUMA的表達水平變化，也未在細胞實驗中過表達或沉默miR-29a進一步驗證circZMYM2/miR-29a/PUMA軸的靶向作用機制，本課題組將在后續(xù)實驗中進一步完善來加以佐證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：高明負責(zé)實驗設(shè)計與實施以及論文撰寫，王琪負責(zé)數(shù)據(jù)的收集與統(tǒng)計學(xué)分析，孫遠松負責(zé)技術(shù)、材料支持，李賀負責(zé)指導(dǎo)實驗、審核和修改論文。