不同種源野生花苜蓿種子特征及萌發(fā)特性研究

唐 芳,侯瑞虹,杜 柯,高佳荷,黃偉業(yè),石鳳翎

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院,草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

花苜蓿(MedicagoruthenicaL.)又名扁蓿豆、扁豆草等,為豆科苜蓿屬多年生草本植物[1]。其廣泛分布于溫帶和寒溫帶的典型草原、沙質(zhì)草原等植被類型區(qū),能夠適應(yīng)低溫、干旱等不良環(huán)境[2]。因此,在改良草場(chǎng)、建植人工草地、退化草場(chǎng)的生態(tài)恢復(fù)、水土保持等方面發(fā)揮著重要的價(jià)值[3-5]。此外,花苜蓿不僅蛋白含量高,適口性好,且不含皂素,家畜過(guò)量采食不會(huì)發(fā)生膨脹病[6]。

種子是種群繁衍、擴(kuò)散、生存的關(guān)鍵環(huán)節(jié),種子的形態(tài)特征是物種遺傳的重要特征之一,種子的商品品質(zhì)、物種的擴(kuò)散能力、種子萌發(fā)及幼苗存活率等指標(biāo)都深受其影響,也是高質(zhì)量種子形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ),對(duì)種群更新及環(huán)境的適應(yīng)性都有重要意義[7-8]。近年來(lái),花苜蓿越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的關(guān)注,有關(guān)花苜蓿的研究報(bào)道多集中在遺傳多樣性、破除種子硬實(shí)、抗性評(píng)價(jià)以及響應(yīng)非生物脅迫方面[9-12],而針對(duì)不同種源地種子特性的相關(guān)報(bào)道卻很少。本研究對(duì)21份不同種源野生花苜蓿種子特征及萌發(fā)特性進(jìn)行分析,以期揭示不同種源野生花苜蓿種子性狀之間的差異及其與萌發(fā)特性間的相關(guān)性,挖掘野生花苜蓿優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源,為花苜蓿新品種培育和種子生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和優(yōu)異種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料來(lái)源

供試材料為2021年9月在種子完熟期于野外采集的21份野生花苜蓿種質(zhì)資源,地理信息及原生氣候條件詳見(jiàn)表1。采集后的莢果經(jīng)通風(fēng)晾干、剝離果皮并去除雜質(zhì),純凈種子于4℃低溫貯藏。

表1 花苜蓿種子采集信息Table 1 Collection information of Medicago ruthenica seed

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1單莢粒數(shù)的測(cè)定 隨機(jī)選取每種源花苜蓿無(wú)裂莢的莢果10個(gè),統(tǒng)計(jì)每莢種子粒數(shù),3次生物學(xué)重復(fù),共30個(gè)果莢,取平均值。

1.2.3種子硬實(shí)率的測(cè)定 隨機(jī)選取50粒種子,室溫條件下加蒸餾水浸泡48 h,統(tǒng)計(jì)未吸脹種子數(shù),3次生物學(xué)重復(fù)。公式如下：

1.2.4種子形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 利用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精確度0.01 mm)分別測(cè)量21份扁蓿豆材料種子的長(zhǎng)度、寬度及厚度。種子長(zhǎng)度是種子縱向最大距離,寬度是橫向最大距離,厚度是腹面和背面的最大距離。從每份材料中隨機(jī)選取10粒種子,3次生物學(xué)重復(fù),共30粒種子,取平均值。

1.2.5種子萌發(fā)試驗(yàn) 試驗(yàn)前將所有供試材料種子均用砂紙打磨,以破除硬實(shí),用75%的酒精消毒30 s,蒸餾水沖洗1 min,再用2%的NaClO溶液浸泡10 min,蒸餾水沖洗1 min,備用。挑選籽粒飽滿、大小均勻一致的種子50粒,置于鋪有兩層濾紙的消毒培養(yǎng)皿(12 cm)中,每培養(yǎng)皿加入等量5 mL蒸餾水,3次重復(fù),室溫下培養(yǎng)。每天定時(shí)記錄種子發(fā)芽數(shù)(發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根突破種皮即為萌發(fā))并及時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)失去的水分。由于試驗(yàn)前對(duì)所有種子已進(jìn)行了破除硬實(shí)處理,加快了種子的發(fā)芽速度,在發(fā)芽第3天,已基本達(dá)到發(fā)芽高峰,在發(fā)芽第5天,所有供試種質(zhì)資源發(fā)芽情況基本穩(wěn)定,不再有新發(fā)芽種子,故本次試驗(yàn)在發(fā)芽第3天測(cè)定發(fā)芽勢(shì),第7天計(jì)算發(fā)芽率。公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)分析及評(píng)價(jià)方法

利用ArcMap 10.6.1提取有關(guān)氣候數(shù)據(jù),采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,運(yùn)用SPSS進(jìn)行單因素及相關(guān)性分析,Origin作圖。

利用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法,對(duì)21份不同種源花苜蓿種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),公式如下所示。

若測(cè)定指標(biāo)與種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣呈正相關(guān)關(guān)系,則隸屬函數(shù)值K=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin);若指標(biāo)與種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,則隸屬函數(shù)值K=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中,X表示測(cè)定值,Xmax和Xmin分別表示指標(biāo)的最大值和最小值。

隸屬函數(shù)值平均值=∑Kj/m。

2.2.2 上瞼下垂不同程度患者先天性心臟病發(fā)病率比較 結(jié)果(表 1)表明：重度組先天性心臟病的發(fā)病率(5.83%)高于輕度(1.15%)及中度組(2.46%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中度與輕度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重度組復(fù)合先天性心臟病發(fā)生率高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

式中,m為指標(biāo)數(shù)量性狀,Kj為第j個(gè)性狀隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單莢粒數(shù)與千粒重分析

從圖1可知,21份不同種源花苜蓿種子中有7份種質(zhì)資源單莢粒數(shù)的均值大于3,其中7號(hào)和9號(hào)種子單莢粒數(shù)最多,分別為3.55和3.53;6號(hào)種子單莢粒數(shù)最少為1.95。在千粒重方面,10號(hào)和11號(hào)種子千粒重較大,分別為3.22和3.50 g。結(jié)合二者分析,單莢粒數(shù)與千粒重之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.2 不同種源花苜蓿種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)

發(fā)芽率是評(píng)判種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)。研究表明,21份不同種源花苜蓿種子發(fā)芽率具有顯著差異(圖2),平均發(fā)芽率為87.17%,其中,有2份供試種子的發(fā)芽率低于80.00%,11份分布在80.00%～90.00%中,8份達(dá)到90.00%以上。14號(hào)種子的發(fā)芽率最高,高達(dá)97.33%;21號(hào)種子的發(fā)芽率最低,為69.33%。

為了進(jìn)一步探究種子生活力強(qiáng)弱以及出苗是否一致,對(duì)不同種源花苜蓿種子的發(fā)芽勢(shì)進(jìn)行測(cè)定。圖3表明,21份供試材料的發(fā)芽勢(shì)具有顯著差異,3份種子發(fā)芽勢(shì)高于90.00%,分別為9號(hào)、12號(hào)、17號(hào),其中9號(hào)種子的發(fā)芽勢(shì)最高,為92.67%;3號(hào)、5號(hào)、1號(hào)種子的發(fā)芽勢(shì)較低,其中3號(hào)的發(fā)芽勢(shì)最低,為41.33%。

圖1 不同種源花苜蓿種子單莢粒數(shù)與千粒重Fig.1 The number of seeds per pod and 1000-grain weight of Medicago ruthenica seeds from different provenances注：不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著。下同Note：Different lowercase letters indicate a significant difference at the 0.05 level.The same as below

圖2 不同種源花苜蓿種子發(fā)芽率Fig.2 Germination rate of M. ruthenica seeds from different provenances

2.3 不同種源花苜蓿種子的硬實(shí)率

硬實(shí)是指種皮致密、不透水或透水性差而不能吸脹發(fā)芽且保持原來(lái)大小狀態(tài)的種子[14]。對(duì)21份不同種源花苜蓿種子硬實(shí)率的測(cè)定結(jié)果表明(圖4),野生花苜蓿種子平均硬實(shí)率高達(dá)94.00%,存在嚴(yán)重的硬實(shí)現(xiàn)象。在21份材料中,有18份種子硬實(shí)率達(dá)90.00%及以上,其中18號(hào)種子的硬實(shí)率最高,達(dá)98.67%;11號(hào),12號(hào)和15號(hào)材料的種子硬實(shí)率相對(duì)較低,為88.00%。

圖3 不同種源花苜蓿種子發(fā)芽勢(shì)Fig.3 Germination potential of M. ruthenica seeds from different provenances

圖4 不同種源花苜蓿種子的硬實(shí)率Fig.4 Hardness rate of M. ruthenica seeds from different provenances

2.4 不同種源花苜蓿種子形態(tài)指標(biāo)

由表2可知,不同種源野生花苜蓿種子的長(zhǎng)、寬、厚均存在顯著差異,種子長(zhǎng)度均值為2.47 mm,變化范圍在2.15～2.87 mm之間,種子寬度均值為1.77 mm,變化范圍在1.63～1.95 mm,其中,11號(hào)材料的種子長(zhǎng)和種子寬均為最大,6號(hào)材料最小。種子厚度均值為0.93 mm,變化范圍在0.72～1.04 mm,其中,1號(hào)材料種子最厚,21號(hào)種子最薄。

表2 不同種源花苜蓿種子形態(tài)指標(biāo)Table 2 Seed morphological indicators of M.ruthenica from different provenances

2.5 不同種源花苜蓿種子性狀相關(guān)性分析

為了較全面地探究花苜蓿種子特征及萌發(fā)特性之間的相關(guān)性,本研究對(duì)不同種源21份花苜蓿種質(zhì)資源的8個(gè)種子特征指標(biāo)與4個(gè)生境信息結(jié)合進(jìn)行相關(guān)性分析。由表3可知,發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)、千粒重、單莢粒數(shù)以及種子形態(tài)指標(biāo)均呈正相關(guān)關(guān)系,其中,與種子厚度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),即種子越飽滿,發(fā)芽率越高。發(fā)芽勢(shì)與千粒重、種子寬度及經(jīng)緯度均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與種子長(zhǎng)度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。硬實(shí)率與千粒重、種子長(zhǎng)度與寬度以及生境地指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,但未達(dá)顯著水平。千粒重與種子長(zhǎng)度、寬度均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與種子厚度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。單莢粒數(shù)與千粒重、種子長(zhǎng)度與寬度均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,但未達(dá)顯著水平。

2.6 綜合評(píng)價(jià)

為了更加全面的評(píng)價(jià)21份不同種源花苜蓿種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣,本研究對(duì)千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、硬實(shí)率、單莢粒數(shù)5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià),計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,將每份材料各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加,取其平均值。根據(jù)各材料隸屬函數(shù)平均值大小確定種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣,平均值越大,種子質(zhì)量越好。由于硬實(shí)率的高低對(duì)花苜蓿的人工栽培利用具有負(fù)向影響,故在進(jìn)行隸屬函數(shù)分析時(shí),硬實(shí)率按負(fù)向效應(yīng)計(jì)算。由表4可知,12號(hào)種子平均隸屬值達(dá)0.79,排名第一,質(zhì)量最好;21號(hào)種子平均隸屬值僅達(dá)0.27,質(zhì)量最差。

表3 花苜蓿種子性狀相關(guān)性分析Table 3 Correlation analyses on M. ruthenica seed indicators

表4 隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)Table 4 Comprehensive evaluation of membership function

3 討論

種子質(zhì)量是衡量牧草產(chǎn)量與品質(zhì)優(yōu)劣的重要基礎(chǔ)與前提,而發(fā)芽率、千粒重、硬實(shí)率等又是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)[15]。種子萌發(fā)是決定所有農(nóng)作物繁衍與生存的關(guān)鍵。發(fā)芽率主要反映種子的生活力,發(fā)芽勢(shì)則主要反映種子的發(fā)芽速率和出苗的整齊度[16],發(fā)芽率越高,表示種子的活力越強(qiáng);發(fā)芽勢(shì)越高,則表示種子發(fā)芽越快,種子生命力越強(qiáng),且出苗越整齊。田宏等[17]研究發(fā)現(xiàn),不同種源截葉鐵掃帚(Lespedezacuneata)種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無(wú)論與種子長(zhǎng)、寬還是千粒重均呈正相關(guān)關(guān)系。于春雷等[18]研究發(fā)現(xiàn),種子質(zhì)量與采集地的緯度及海拔顯著相關(guān)。本研究與2位學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果基本一致,21份不同種源花苜蓿種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)、硬實(shí)率、千粒重和單莢粒數(shù)相關(guān)性均不顯著,但發(fā)芽勢(shì)與種子采集地的經(jīng)緯度呈顯著正相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明花苜蓿種子特征及萌發(fā)特性與自身生長(zhǎng)環(huán)境或遺傳背景息息相關(guān)。

已有研究表明,花苜蓿種子硬實(shí)率高達(dá)80.00%以上,自然發(fā)芽率僅有20.00%[19],本研究中,21份不同種源花苜蓿種子平均硬實(shí)率高達(dá)94.00%,最高達(dá)98.67%,比報(bào)道的硬實(shí)率更高。在牧草栽培利用時(shí),不同的利用目的,其硬實(shí)率的高低代表的意義也不同[20-21]。以人工栽培育種為主時(shí),若硬實(shí)率過(guò)高,則存在出苗障礙問(wèn)題,需在播種前對(duì)種子進(jìn)行破除硬實(shí)處理。因此,低硬實(shí)率的種質(zhì)資源為較優(yōu)資源,可節(jié)約用種、節(jié)省勞力、降低種植成本。在自然條件下,硬實(shí)率越高,則種子對(duì)自身保護(hù)能力越強(qiáng),代表種子對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng),種子壽命也越長(zhǎng),有利于植物的遠(yuǎn)距離傳播和種群繁衍,對(duì)種質(zhì)資源的保存十分重要[22]。因此,在種質(zhì)資源保護(hù)及生態(tài)修復(fù)利用時(shí),高硬實(shí)率的種質(zhì)資源為較優(yōu)資源。在利用硬實(shí)率這一指標(biāo)評(píng)價(jià)種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣時(shí),應(yīng)結(jié)合實(shí)際利用目的進(jìn)行合理運(yùn)用。在本研究中,花苜蓿種子質(zhì)量評(píng)價(jià)的目的為篩選較優(yōu)資源用于后續(xù)栽培育種利用,因此低硬實(shí)率的種子質(zhì)量較好。牧草種子的高硬實(shí)率嚴(yán)重影響種子萌發(fā)以及出苗的一致性,因此,破除花苜蓿硬實(shí)十分重要。伊風(fēng)艷等[23]在探究破除花苜蓿種子硬實(shí)方法的試驗(yàn)中,采用了切割、砂紙打磨、酸處理等7種物理及化學(xué)破除方法,結(jié)果表明,切割、砂紙打磨、濃硫酸處理等方法均可有效破除花苜蓿種子硬實(shí),其中,切割處理能夠完全破除種子硬實(shí),使種子發(fā)芽率達(dá)到99.00%。本研究中,選用了砂紙打磨法破除硬實(shí),經(jīng)砂紙打磨,21份不同種源花苜蓿種子平均發(fā)芽率達(dá)87.17%,有效提高了野生花苜蓿種子的發(fā)芽率。需注意的是,砂紙打磨法操作簡(jiǎn)單,但只適用于種子量較少時(shí),否則將耗費(fèi)大量的人力及時(shí)間。

張娜等[24]研究發(fā)現(xiàn),不同種源血人參(IndigoferastachyodesLindl.)種子的千粒重與硬實(shí)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究中,不同種源花苜蓿種子也表現(xiàn)出相同趨勢(shì),千粒重越大,種子越飽滿,種皮相對(duì)容易吸脹萌發(fā),故硬實(shí)率越低。與種子采集地的生境信息結(jié)合進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),生態(tài)環(huán)境越好的地區(qū),即水分、光照條件較為優(yōu)越的地區(qū),例如草原,林地等,每個(gè)莢果中包含的種子數(shù)量越多,但種子較小;生態(tài)環(huán)境越差的地區(qū),如沙地、護(hù)坡、退化草場(chǎng)等,每個(gè)莢果中包含的種子數(shù)量越少,但種子較大。該研究結(jié)果說(shuō)明,不同種源花苜蓿種子在長(zhǎng)期適應(yīng)生態(tài)環(huán)境時(shí)導(dǎo)致種子特性存在一定的差異。當(dāng)環(huán)境較好時(shí),花苜蓿以擴(kuò)大群體為主,故種子較小但數(shù)量較多。當(dāng)環(huán)境條件較差時(shí),花苜蓿以生存為主,大種子更有利于生存,故種子較大但數(shù)量較少。

我國(guó)野生花苜蓿種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。本研究通過(guò)對(duì)不同種源野生花苜蓿種質(zhì)材料進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是不同種源或是相近種源之間,不同材料的種子特征及萌發(fā)特性均有差異,這些差異可能是種子在長(zhǎng)期適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)所致,也可能是因種子自身遺傳變異所致。內(nèi)蒙古做為花苜蓿自然分布地區(qū)之一,早在20世紀(jì)90年代,國(guó)外學(xué)者Campbell等[25]已將內(nèi)蒙古溫帶草原和荒漠草原地區(qū)收集的90份種子引入美國(guó)的馬里蘭州,并對(duì)其生長(zhǎng)特性及與苜蓿的遺傳多樣性展開(kāi)研究,發(fā)現(xiàn)花苜蓿蘊(yùn)藏豐富的抗逆基因資源。目前,我國(guó)在花苜蓿的抗性研究方面還處于初級(jí)階段,對(duì)花苜蓿抗逆基因資源的挖掘和利用還有廣闊的研究空間。未來(lái)需要加大研究力度,合理利用花苜蓿在內(nèi)蒙古廣泛分布,野生資源較為豐富的這一優(yōu)勢(shì),不斷挖掘評(píng)價(jià)與利用優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

不同種源野生花苜蓿種子在發(fā)芽率、硬實(shí)率、千粒重等方面均存在差異,且各指標(biāo)之間均存在一定的相關(guān)性。本次研究中,11號(hào)材料的種子千粒重最大,7號(hào)材料的種子單莢粒數(shù)最多,14號(hào)材料種子的發(fā)芽率最高,9號(hào)材料種子的發(fā)芽勢(shì)最高,12號(hào)材料種子的硬實(shí)率最低。結(jié)合隸屬函數(shù)總體綜合評(píng)價(jià),12號(hào)材料種子排名第一,質(zhì)量最優(yōu);21號(hào)種子排名最后,質(zhì)量較差,利用價(jià)值最低。