海雀稗PvCIPK9基因克隆及耐鹽功能鑒定

宋志鋼,劉 穎,劉 瑞,盧少云*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016)

植物在生長發(fā)育過程中會(huì)受到各種不利的環(huán)境脅迫,如高鹽、干旱、寒冷和病原體等。為了應(yīng)對(duì)環(huán)境的波動(dòng)以完成完整的生命周期,植物進(jìn)化出了復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。鈣是植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的第二信使,能夠?qū)⑼饨缧盘?hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信息,從而對(duì)特定的環(huán)境刺激做出相應(yīng)的反應(yīng)[1]。當(dāng)植物遭受到環(huán)境脅迫后,以游離Ca2+的瞬時(shí)變化作為信號(hào)將外界環(huán)境信息傳遞到植物細(xì)胞內(nèi)。這種Ca2+信號(hào)首先被鈣離子感受器感知解碼,再將信號(hào)向下游傳遞。高等植物的鈣感受器已知有三類：鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)、鈣調(diào)素(Calmodulins,CaMs)/類鈣調(diào)素蛋白(Calmodulin-like proteins,CMLs)、類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(Calcineurin B-like proteins,CBLs)[2-3]。CBL是一類獨(dú)特的鈣感受器,CBLs自身沒有酶活性,因此在它結(jié)合Ca2+后,還需要與其下游互作蛋白CIPKs(CBL-interacting protein kinases)結(jié)合才能發(fā)揮應(yīng)有的生物學(xué)功能[4]。CBLs和CIPKs共同形成了以Ca2+介導(dǎo)的CBL-CIPK網(wǎng)絡(luò),這是近十幾年來植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究熱點(diǎn)之一[5]。

CIPKs蛋白主要包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端激酶結(jié)構(gòu)域(Kinase domain)和C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(NAF domain)。N端激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)有一個(gè)激活環(huán)(Activation loop),磷酸化激活環(huán)可激活蛋白激酶的活性。C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域內(nèi)有一個(gè)保守的NAF結(jié)構(gòu)域,NAF結(jié)構(gòu)域既與CIPK分子內(nèi)部的自我抑制相關(guān),又可以與CBL特異性結(jié)合[6-7]。在NAF鄰近位置有一個(gè)相對(duì)保守的PPI基序(Protein phosphatase interaction motif)能夠與2C型蛋白磷酸酶(Protein phoshphatase 2C)之間發(fā)生蛋白互作[8]。

作為植物特有的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),CBL-CIPK信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在植物的生長發(fā)育、生殖及逆境響應(yīng)等方面都發(fā)揮著極其重要的作用。許多CBL或CIPK通過調(diào)控植物體內(nèi)Na+/K+和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)平衡,參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng),例如玉米(Zeamays)ZmCIPK21[9]、小麥(Triticumaestivum)TaCIPK24[10]、大豆(Glycinemax)GmCIPK10[11]等均參與了對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。隨著對(duì)CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)研究的深入,發(fā)現(xiàn)了越來越多的CBL和CIPK蛋白參與調(diào)控植物對(duì)各種逆境脅迫的響應(yīng)。除鹽脅迫以外,CBL、CIPK也參與對(duì)其它逆境的響應(yīng)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCBL1-AtCIPK7,水稻(Oryzasativa)OsCIPK1和OsCIPK3參與植物對(duì)冷脅迫的響應(yīng)[12-13],番茄(Solanumlycopersicum)SlCBL10-SlCIPK6參與植物對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)病原的免疫反應(yīng)[14]。同一個(gè)CBL或CIPK蛋白可以參與植物不同逆境的響應(yīng),比如過表達(dá)MdCIPK6L同時(shí)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性、耐旱性和抗冷性[15],OsCIPK15同時(shí)參與植物對(duì)鹽、低氧脅迫和微生物病原的響應(yīng)[16]。過表達(dá)水稻OsCIPK3提升植株對(duì)冷的耐受力,但會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽敏感[12,17]。大量的研究結(jié)果證明了CBL-CIPK具有多種多樣的抗逆功能,對(duì)CBL-CIPK信號(hào)成分的挖掘和鑒定,不僅有助于解析植物在逆境脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制,同時(shí)為基因工程改良作物的抗逆性提供了基因資源。

鹽生植物海雀稗(Paspalumsvaginatium)是禾本科(Gramineae)黍族(Paniceae)雀稗屬(Paspalum)的一種多年生草本植物[18]。海雀稗兼具多種優(yōu)良特性,如耐鹽、耐澇、耐踐踏和耐修剪等,對(duì)極端酸性土壤、堿性土壤等非生物脅迫也具有較高的耐性[18]。目前對(duì)海雀稗的研究主要集中在種間或品種間的耐逆性評(píng)價(jià)[19-20],在海雀稗關(guān)鍵耐鹽基因的克隆和功能研究方面較少[21],因此挖掘海雀稗的耐鹽基因資源,揭示海雀稗耐鹽分子機(jī)制迫在眉睫。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)在海雀稗鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,PvCIPK9基因可能參與響應(yīng)鹽脅迫。為了深入研究PvCIPK9基因,克隆得到了PvCIPK9序列全長,并對(duì)其蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)。為驗(yàn)證PvCIPK9基因在抗逆中的作用,本研究構(gòu)建了過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得了過表達(dá)PvCIPK9擬南芥植株,驗(yàn)證了過表達(dá)PvCIPK9對(duì)擬南芥耐鹽性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海雀稗(PaspalumvaginatumO.Swartz)品種‘Sea Spray’植株及擬南芥野生型(Col-0)種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 海雀稗PvCIPK9基因克隆與生物信息學(xué)分析

本研究以海雀稗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的序列為參考序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以海雀稗cDNA為模板,利用PCR擴(kuò)增PvCIPK9基因CDS序列。采用生物信息學(xué)網(wǎng)站(https：//web.expasy.org/protparam/)分析該蛋白的理化性質(zhì)。根據(jù)在線網(wǎng)站SignalP-4.1(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對(duì)PvCIPK9進(jìn)行信號(hào)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),使用在線網(wǎng)站TMHMM-2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)PvCIPK9蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用在線軟件SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模。使用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。從NCBI網(wǎng)站獲取模式植物擬南芥和水稻的CIPK家族蛋白序列,使用軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,構(gòu)建方法使用鄰接法。

1.3 啟動(dòng)子元件分析

通過植物基因組網(wǎng)站(https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/)獲取PvCIPK9基因上游約1 500 bp序列,利用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對(duì)PvCIPK9基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

1.4 PvCIPK9基因表達(dá)模式分析

參照Zhang等[22]的方法,構(gòu)建PvCIPK9與GFP融合表達(dá)載體,以mCherry作為Marker蛋白,同時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體,28℃黑暗條件下培養(yǎng)20～24 h后,利用熒光顯微鏡下觀察GFP和mCherry熒光。其中GFP的激發(fā)光和發(fā)射光分別為488 nm和507 nm,mCherry的激發(fā)光和發(fā)射光分別為587 nm和610 nm。

取長勢(shì)良好且一致的海雀稗幼苗,洗凈根部泥土,置于1/2霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)一周左右。使用含200 mmol·L-1NaCl的營養(yǎng)液中進(jìn)行鹽處理,以不含NaCl的營養(yǎng)液為對(duì)照,在處理2,6,12,24 h時(shí)分別對(duì)根和葉進(jìn)行取樣,液氮速凍后于-80℃冰箱中保存,待提RNA。

選取生長健壯的海雀稗精心培養(yǎng)至抽穗開花,對(duì)海雀稗的根、莖、葉、小穗進(jìn)行取樣,液氮速凍后保存在-80℃冰箱中,待提RNA。

使用RNA提取試劑盒RNAiso plus(9109,Takara)進(jìn)行植物總RNA的提取。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A,Takara)進(jìn)行反應(yīng),獲得第一鏈cDNA。以cDNA為模板,參照qRT-PCR試劑盒Tli RNaseH Plus(RR820A,Takara)使用說明書,將反應(yīng)組分離心混勻后使用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min;95℃ 5 s,55℃ 30 s,進(jìn)行39個(gè)循環(huán);插入熔解曲線65℃ 5 s,95℃ 5 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線,以海雀稗Actin作為內(nèi)參基因計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量,數(shù)據(jù)由軟件Bio-Rad CFX Manager(Version3.0)分析并收集。

1.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)含有Xba I和Bamh I酶切位點(diǎn)的引物(表1),擴(kuò)增PvCIPK9基因CDS序列,得到帶有酶切位點(diǎn)的目的基因片段。用Xba I和Bamh I雙酶切該基因片段和pCAMBIA3301質(zhì)粒載體,經(jīng)T4 DNA連接酶連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)PCR驗(yàn)證,挑選陽性克隆送生物公司測(cè)序,將測(cè)序正確的pCAMBIA3301重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105。用花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,在含有Basta的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因抗性植株,使用CTAB抽提法提取DNA,通過PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因植株陽性苗。再經(jīng)過自交和篩選后得到T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性分析

挑選籽粒飽滿、大小均勻的擬南芥種子,放于2 mL離心管內(nèi)。在超凈工作臺(tái)內(nèi),加入75%乙醇消毒5 min,滅菌水清洗。加入15%次氯酸鈉溶液消毒15 min期間須多次振蕩。使用無菌水沖洗6～8次。將消毒后的種子均勻的點(diǎn)在1/2 MS培養(yǎng)基上,放于4℃冰箱春化處理2～3 d。將培養(yǎng)皿置于溫度25℃,光暗周期為16 h∶8 h,光照為200 μmol·m-2·s-1的人工智能培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d的幼苗,選擇長勢(shì)一致的幼苗轉(zhuǎn)至土壤中培養(yǎng)。將生長三周左右的幼苗進(jìn)行鹽處理,先用50 mmol·L-1NaCl澆灌4天,再把處理濃度提高至100 mmol·L-1NaCl,觀察擬南芥生長表型。

1.6.1種子萌發(fā)率 取野生型和2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系,消毒處理后,無菌水清洗種子,分別播種于1/2 MS培養(yǎng)基(對(duì)照)和含有100 mmol·L-1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基(鹽脅迫),每皿播種40粒種子,三次重復(fù)。春化三天后,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況,連續(xù)統(tǒng)計(jì)5天,計(jì)算萌發(fā)率。以種子萌發(fā)突破種皮露白5 mm視為萌發(fā)。

1.6.2相對(duì)生長量 取WT和2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行消毒,無菌水清洗種子,然后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上。播種7天后,取長勢(shì)一致的幼苗移到培養(yǎng)瓶中,內(nèi)含等量的1/2MS培養(yǎng)基(分別含有0,100,150 mmol·L-1NaCl),每瓶放5株,光下生長20 d后,分別稱根系鮮重和地上部鮮重,計(jì)算整株鮮重、相對(duì)生長量。

1.6.3抗氧化酶活性 粗酶液提?。喝?.1 g擬南芥葉片,加入2 mL的緩沖液(SOD、CAT緩沖液(50 mM PBS含1%的PVP,pH7.8)、APX緩沖液(50 mmol·L-1PBS含15 mmol·L-1AsA,0.1 mmol·L-1EDTA,1%的PVP,pH值7.0)),冰上研磨成勻漿,4℃,12 000 r·min-1離心10 min,上清液即為酶的粗提液。參照Chen和Zhuo的方法[23-24]進(jìn)行超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),過氧化氫酶(Catalase,CAT),抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定酶粗提液的蛋白質(zhì)含量[25]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次重復(fù),利用IBM SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用方差分析差異顯著性,計(jì)算各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤,數(shù)據(jù)均采用3個(gè)獨(dú)立樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用Excel作圖,Word制表。不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)中用到的所有引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì),引物序列見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 海雀稗PvCIPK9基因的克隆及生物信息學(xué)分析

通過克隆獲得海雀稗PvCIPK9基因的CDS全長序列(圖1a),PvCIPK9基因的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)全長為1 332 bp,編碼443個(gè)氨基酸,蛋白分子量為49.87 KDa,理論等電點(diǎn)為8.02,不穩(wěn)定指數(shù)36.34,屬于穩(wěn)定蛋白,親水性總平均值(GRAVY)為-0.412,屬于親水性蛋白(圖1b)。PvCIPK9蛋白沒有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(圖1c),預(yù)測(cè)該蛋白在第197～216個(gè)氨基酸間存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1d)。該蛋白具有典型的激酶結(jié)構(gòu)域和NAF結(jié)構(gòu)域(圖1f)。

圖1 PvCIPK9的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of PvCIPK9注：(a)克隆PvCIPK9基因(b)海雀稗PvCIPK9蛋白親水性分析;(c)海雀稗PvCIPK9蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè);(d)海雀稗PvCIPK9蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);(e)海雀稗PvCIPK9蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型;(f)海雀稗PvCIPK9蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Note：(a)Clone PvCIPK9 gene;(b)Analysis of hydrophilicity of PvCIPK9 protein in P.vaginatum;(c)Prediction of PvCIPK9 protein signal peptide in P.vaginatum;(d)Prediction of transmembrane domain of PvCIPK9 protein in P.vaginatum;(e)Tertiary structure model of PvCIPK9 protein in P.vaginatum;(f)Prediction of the conserved domain of PvCIPK9 protein in P.vaginatum

將PvCIPK9分別與擬南芥26個(gè)CIPKs以及水稻33個(gè)CIPKs家族成員構(gòu)建進(jìn)化樹。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,PvCIPK9分別與擬南芥AtCIPK9(圖2a)和水稻OsCIPK9親緣關(guān)系最近(圖2b)。

圖2 PvCIPK9與擬南芥和水稻CIPKs的進(jìn)化分析Fig.2 Evolutionary Analysis of PvCIPK9 and Arabidopsis CIPKs and Rice CIPKs注：(a)PvCIPK9與AtCIPKs的進(jìn)化分析;(b)PvCIPK9與OsCIPKs的進(jìn)化分析Note：(a)Evolutionary Analysis of PvCIPK9 and AtCIPKs;(b)Evolutionary Analysis of PvCIPK9 and OsCIPKs

2.2 啟動(dòng)子分析

在海雀稗基因組數(shù)據(jù)中獲取PvCIPK9基因上游基因約1 500 bp序列,利用plantCARE對(duì)海雀稗PvCIPK9基因啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)參與光反應(yīng)的元件如G-Box,ARE等;多種激素響應(yīng)元件如生長素反應(yīng)元件TGA-element,脫落酸響應(yīng)元件ABRE,水楊酸響應(yīng)元件TCA-element,茉莉酸響應(yīng)元件TGACG-motif,CGTCA-motif;逆境脅迫響應(yīng)元件如LTR,ABRE等。

圖3 海雀稗PvCIPK9基因啟動(dòng)子元件分析Fig.3 Gene promoter element analysis of PvCIPK9

2.3 PvCIPK9的表達(dá)模式分析

2.3.1PvCIPK9的亞細(xì)胞定位 將融合載體和mCherry共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體,以GFP和mCherry共轉(zhuǎn)為對(duì)照,通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)出現(xiàn)部位。結(jié)果顯示,PvCIPK9-GFP熒光信號(hào)與mCherry熒光信號(hào)明顯重疊在細(xì)胞核(圖4),表明PvCIPK9主要存在于細(xì)胞核中。

2.3.2PvCIPK9的組織特異性表達(dá)分析 利用RT-qPCR檢測(cè)海雀稗不同器官組織中的PvCIPK9基因表達(dá)量,結(jié)果表明,正常生長條件下,PvCIPK9基因在根、莖、葉、穗中均有不同程度的表達(dá),在葉中的表達(dá)量最高且顯著高于其他組織(圖5)。

2.3.3海雀稗PvCIPK9鹽脅迫響應(yīng)分析 以野生型海雀稗作為材料,通過qRT-PCR分析200 mmol·L-1NaCl鹽脅迫不同時(shí)間對(duì)葉片和根系中PvCIPK9基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,與正常生長條件下的海雀稗相比較,鹽處理后,海雀稗葉片中的PvCIPK9基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì),在根中,PvCIPK9的基因表達(dá)量在2,6,24 h時(shí)顯著上升(P<0.05),在12 h時(shí)無顯著差異(圖6)。

圖5 PvCIPK9的組織特異性表達(dá)分析Fig.5 Analysis of tissue specific expression of PvCIPK9

圖6 海雀稗PvCIPK9鹽響應(yīng)脅迫分析Fig.6 Analysis of salt response of Paspalums vaginatium PvCIPK9注：海雀稗葉片(a)和根(b)中PvCIPK9的基因表達(dá)分析。不同小寫字母表示處理組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)Note：Analysis of gene expression of PvCIPK9 in leaves (a) and roots (b) of Paspalums vaginatium. Different minuscule indicate significant difference between treatment group and control group (P<0.05)

2.4 過表達(dá)PvCIPK9遺傳材料的表型鑒定

2.4.1過表達(dá)PvCIPK9擬南芥植株的獲得 用花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,在含有Basta的培養(yǎng)基上篩選得到兩個(gè)株系。以轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA為模板,采用引物Bar-F和Bar-R進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定,檢測(cè)結(jié)果符合Bar基因的片段大小(圖7a)。進(jìn)一步采用引物擴(kuò)增載體上啟動(dòng)子部分片段和目的片段全長,擴(kuò)增長度1 756 bp,電泳結(jié)果符合預(yù)期(圖7b)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,過表達(dá)株系的目的基因表達(dá)量均顯著高于野生型擬南芥(圖7c)。為方便我們把PvCIPK9-1和PvCIPK9-8轉(zhuǎn)基因株系分別命名為OE1和OE8。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的檢測(cè)鑒定Fig.7 Detection and Identification of Transgenic Arabidopsis注：(a)PCR檢測(cè)Bar基因(b)PCR檢測(cè)PvCIPK9基因(c)定量PCR檢測(cè)PvCIPK9基因表達(dá)量。M,DL2000 Marker;—,野生型;+,pCAMBIA3301-PvCIPK9質(zhì)粒;1,8,過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系Note：(a) PCR for Bar gene (b) PCR for PvCIPK9 gene (c) PvCIPK9 gene expression by qPCR.M,DL2000 Marker;—,Wild type;+,pCAMBIA3301-PvCIPK9 vector;1,8,Overexpression of transgenic Arabidopsis lines

2.4.2鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率的影響 連續(xù)統(tǒng)計(jì)5天的種子萌發(fā)率(圖8a),不含NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥均在第2天開始萌發(fā),第4天時(shí)轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的萌發(fā)率分別為87%,94%和82%,且無顯著性差異(圖8a)。在含100 mmol·L-1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上,所有株系在第3天開始萌發(fā),第 4天時(shí),野生型株系的萌發(fā)率僅有8%～10%,而過表達(dá)株系的萌發(fā)率分別為40%～64%,60%～73%,顯著高于野生型(圖8b)。說明鹽處理對(duì)過表達(dá)PvCIPK9擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用顯著小于野生型。

2.4.3鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)生長量的影響 正常條件下,過表達(dá)PvCIPK9轉(zhuǎn)基因株系的整株、地上部和根的鮮重略低于野生型,但差異不顯著。在含鹽培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因株系的整株、地上部和根的鮮重顯著高于野生型(圖9a,9b,9c)。進(jìn)一步計(jì)算相對(duì)生長量,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系的整株,地上部及根的相對(duì)生長量均顯著高于野生型。以上結(jié)果說明過表達(dá)PvCIPK9提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

圖9 鹽脅迫處理對(duì)野生型與過表達(dá)PvCIPK9擬南芥的生長影響Fig.9 Effect of salt stress treatment on the growth of PvCIPK9 transgenic Arabidopsis and WT注：鹽處理后整株(A)、地上部(B)和根(C)的鮮重;(D)將7天齡的幼苗分別在含0,100,150 mmol·L-1 NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上生長18 d后的生長狀況Note：After salt treatment,fresh weight of whole plant (A),shoot (B) and root (C);(D) The growth status of 7-day-old seedlings after growing on 1/2 MS medium containing 0,100 and 150 mmol·L-1 NaCl for 18 days

2.4.4鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗氧化酶活性的影響 正常條件下,轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的SOD酶活性沒有顯著性差異。鹽處理后,與WT相比,過表達(dá)PvCIPK9株系的SOD酶活性顯著提高(圖10a);在正常條件下,過表達(dá)株系的CAT活性與野生型無顯著差異,鹽處理后,過表達(dá)株系的CAT活性顯著高于野生型(圖10b);無論是在正常生長條件還是鹽脅迫條件下,所有株系間的APX活性均無顯著性差異(圖10c)。上述結(jié)果說明過表達(dá)PvCIPK9提高了鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥SOD和CAT的活性,對(duì)APX的活性無影響。

圖10 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗氧化酶活性的影響Fig.10 Effect of the antioxidant enzyme activity of transgenic Arabidopsis under salt stress注：鹽處理14天后,測(cè)定擬南芥的SOD(A)、CAT(B)和APX(C)的活性Note：After 14 days of salt treatment,the activities of SOD (A),CAT (B) and APX (C) were measured in Arabidopsis

2.4.5鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察 通過土壤栽培,觀察自然環(huán)境下轉(zhuǎn)基因材料對(duì)鹽脅迫的耐受性,由圖11所示,鹽脅迫條件下,野生型植株葉片稀疏,葉面細(xì)小,受到明顯的傷害,而轉(zhuǎn)基因株系的葉片較大且數(shù)量多,長勢(shì)更好,鹽處理對(duì)過表達(dá)PvCIPK9擬南芥植株的傷害較小,表明過表達(dá)PvCIPK9基因能夠提高擬南芥的耐鹽性。

3 討論

海雀稗作為具有極強(qiáng)耐鹽性的鹽生植物之一,在鹽堿地改良與修復(fù)上有著巨大的應(yīng)用潛力[21]。但是關(guān)于海雀稗耐逆性,特別是耐鹽性的機(jī)制研究報(bào)道甚少。作為植物特有的蛋白激酶,CIPKs(CBL相互作用蛋白激酶)家族在解碼和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫產(chǎn)生的Ca2+信號(hào)中發(fā)揮著重要作用[26]。本文從鹽生植物海雀稗中克隆得到一個(gè)CIPKs家族的新成員—PvCIPK9。該基因與水稻和擬南芥中的OsCIPK9和AtCIPK9同源關(guān)系較近。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PvCIPK9在海雀稗根、莖、葉和小穗中均有表達(dá),廣泛的空間分布表明PvCIPK9可能參與了多種生理響應(yīng)過程,其中葉中表達(dá)量最高,這與AtCIPK9主要在根中表達(dá)不同[27],這可能與海雀稗作為鹽生植物獨(dú)有的鹽腺有關(guān)[28]。分析PvCIPK9在鹽脅迫下的表達(dá)水平,結(jié)果表明根系和葉片中PvCIPK9的轉(zhuǎn)錄水平均隨著鹽脅迫的誘導(dǎo)而上調(diào),與擬南芥AtCIPK9和水稻OsCIPK9受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)的結(jié)果一致[27,29]。

不同基因的啟動(dòng)子區(qū)含有不同功能的順式作用元件,植物響應(yīng)環(huán)境脅迫與這些順式作用元件有關(guān)[30]。進(jìn)一步分析PvCIPK9上游1 500 bp左右的啟動(dòng)子元件,發(fā)現(xiàn)海雀稗PvCIPK9的啟動(dòng)子區(qū)含有多種順式作用元件,包括多種光反應(yīng)響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件等,但并未發(fā)現(xiàn)僅對(duì)鹽脅迫有響應(yīng)的順式作用元件,如GT-1。同一順式作用元件也不只對(duì)同一種環(huán)境脅迫做出響應(yīng),如ABRE不僅對(duì)ABA有響應(yīng),還響應(yīng)干旱和鹽,DRE不只響應(yīng)干旱,也對(duì)ABA、低溫、高鹽有響應(yīng)[31]。本文中海雀稗PvCIPK9雖不含特定的鹽響應(yīng)元件,但可能會(huì)通過其他順式作用元件對(duì)鹽脅迫作出響應(yīng)。

一般認(rèn)為CIPK的亞細(xì)胞定位取決于CBL-CIPK復(fù)合體中CBL的亞細(xì)胞定位[32]。同一個(gè)CIPK與不同的CBL相互作用,有著不同的亞細(xì)胞定位,從而發(fā)揮不同的功能[33]。當(dāng)CIPK單獨(dú)存在時(shí),一般在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上廣泛分布,CIPK在細(xì)胞內(nèi)的廣泛分布有利于其與不同的CBL結(jié)合發(fā)揮不同的功能,與大多數(shù)CIPK不同的是,PvCIPK9的亞細(xì)胞定位僅定位于細(xì)胞核中,推測(cè)PvCIPK9可能會(huì)與同樣定位于核中的某一個(gè)或幾個(gè)CBLs特異性結(jié)合發(fā)揮特定的功能。

為進(jìn)一步探究PvCIPK9的耐鹽性功能,將PvCIPK9過表達(dá)轉(zhuǎn)化擬南芥,對(duì)獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行鹽脅迫下的耐受性分析。結(jié)果表明,鹽脅迫下,與野生型WT相比,過表達(dá)PvCIPK9轉(zhuǎn)基因擬南芥株系葉片更大,且數(shù)量較多,受到的傷害更小。進(jìn)一步測(cè)定種子萌發(fā)率和相對(duì)生長量也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系有著更高的萌發(fā)率和相對(duì)生長量,表明過表達(dá)PvCIPK9能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受性,有研究表明白刺(Nitrariatangutorum)NtCIPK9與植物耐鹽性有關(guān),過表達(dá)NtCIPK9擬南芥株系在鹽脅迫下表現(xiàn)出更高的種子萌發(fā)率以及更長的根長[34]。此外,擬南芥AtCIPK9參與K+穩(wěn)態(tài),且AtCIPK9與VDAC3互作調(diào)節(jié)擬南芥的氧化應(yīng)激反應(yīng)[35],還有報(bào)道油菜(Brassicanapus)BnCIPK9在介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)化和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的相互作用以調(diào)節(jié)油菜籽中的油代謝中發(fā)揮著重要作用[36],這些與PvCIPK9同源關(guān)系較近的基因報(bào)道的各種基因功能,為研究PvCIPK9除鹽脅迫耐受性以外的功能提供了借鑒,說明PvCIPK9具有潛在的功能多樣性,為后續(xù)探索PvCIPK9的其他功能提供了理論基礎(chǔ)。

逆境脅迫下,植物自身可以通過一系列復(fù)雜的抗氧化防御體系來減輕和修復(fù)因逆境產(chǎn)生的活性氧造成的傷害[37]。在本研究中對(duì)過表達(dá)PvCIPK9擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PvCIPK9擬南芥的SOD,CAT酶活性顯著高于野生型,這說明在鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥具有更強(qiáng)的活性氧清除能力,可以減輕鹽脅迫對(duì)擬南芥的傷害。有研究表明番茄中過表達(dá)SOD基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因番茄的耐鹽性[38],在鹽脅迫條件下,與鹽敏感的黃瓜(Cucumissativus)植株相比,耐鹽黃瓜的抗氧化酶活性顯著提高[39],說明植株的高耐鹽性與較強(qiáng)的抗氧化酶活性的有關(guān)。綜上,可推測(cè)提高抗氧化酶活性是PvCIPK9提高植物耐鹽性的一種途徑。

鹽超敏感(Salt overly sensitive,SOS)途徑是植物中最先被發(fā)現(xiàn)的CBL-CIPK通路,參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng),該通路的作用機(jī)制主要是通過排出細(xì)胞內(nèi)多余的Na+,從而維持體內(nèi)的Na+/K+平衡,提高耐鹽性[40-41]。AtCIPK9已經(jīng)被證實(shí)是低K+脅迫相關(guān)的調(diào)節(jié)因子[42],后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),AtCIPK9可靶向下游的VDAC3,AP2C1或HAK5等調(diào)節(jié)K+穩(wěn)態(tài)[35,43-44],根據(jù)進(jìn)化分析的結(jié)果,PvCIPK9與AtCIPK9同源性較高,作為同源基因,PvCIPK9可能具有同樣的功能,即通過調(diào)節(jié)K+穩(wěn)態(tài)來維持Na+/K+平衡,進(jìn)而提高植物耐鹽性,這為進(jìn)一步探究PvCIPK9具體的分子調(diào)控機(jī)制提供了方向。

4 結(jié)論

本研究通過前期海雀稗鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出對(duì)鹽脅迫有響應(yīng)的PvCIPK9基因,對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)模式等分析,發(fā)現(xiàn)該基因編碼穩(wěn)定的親水性蛋白,無信號(hào)肽結(jié)構(gòu),存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域;PvCIPK9定位于細(xì)胞核中;PvCIPK9在海雀稗的根、莖、葉和穗均有表達(dá),在葉中的基因表達(dá)量最高;鹽脅迫下PvCIPK9在根和葉中表達(dá)均上調(diào)。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理,測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫條件下的種子萌發(fā)率、相對(duì)生長量、抗氧化酶酶活性等生理指標(biāo),結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性明顯優(yōu)于野生型擬南芥,說明過表達(dá)PvCIPK9提高了擬南芥的耐鹽性,這為揭示海雀稗耐鹽機(jī)制及挖掘新的耐鹽基因資源奠定了基礎(chǔ)。