蒺藜苜蓿miR167c調(diào)控生長和花器官發(fā)育的功能驗(yàn)證

張立霞,李 霄,許 蕾,旦真措,劉亞嬌,蘇德畢力格,叢麗麗,楊青川,龍瑞才*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東 青島 266109;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;3.北京林業(yè)大學(xué),北京 100083)

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為20～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA。植物miRNA基因(MIRs)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級轉(zhuǎn)錄本,經(jīng)過一系列剪切過程形成成熟的miRNA[1-3],以序列特異性方式切割或抑制mRNA的翻譯來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[4]。miRNAs主要通過調(diào)控生長素響應(yīng)因子(Auxinresponsefactor,ARF)和IAA-氨基酸水解酶(IAA-Alaresistant3,IAR3)基因發(fā)揮作用[5-9],參與調(diào)控根、莖、葉和花的發(fā)育、開花時(shí)間、胚胎發(fā)育、種子發(fā)育和脅迫響應(yīng)等,在植物的生理和形態(tài)建成過程以及響應(yīng)各種逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用[10-17]。

miR167是植物中高度保守的基因家族之一,具有不同的莖環(huán)前體并產(chǎn)生成熟的miR167序列。在miR167序列中,3′端加工與5′端加工存在顯著差異,初級miR167和成熟miR167在植物中具有不同的表達(dá)模式[18-20]。miR167家族主要存在于被子植物中,且在雙子葉植物中比在單子葉植物中更廣泛,目前在大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、小麥(TriticumaestivumL.)、龍眼(Dimocarpuslongan)和甘蔗(Saccharumofficinarum)等植物中已被鑒定。miR167具有物種特異性,如在擬南芥4個(gè)miR167基因(MIR167a,MIR167b,MIR167c和MIR167d)中,miR167a產(chǎn)生較高水平的miR167成熟體,是miR167基因家族的主要成員,能調(diào)節(jié)雌雄器官的發(fā)育[7,15]。水稻(Oryzasativa)miR167家族由10個(gè)miR167a-j位點(diǎn)編碼,miR167a-c和miR167-j在3′端僅有一個(gè)核苷酸差異。在這10個(gè)基因中,MIR167a,MIR167b和MIR167c能更高效地產(chǎn)生成熟的miR167,其中miR167a-c在水稻中發(fā)揮主要作用,影響植株大小和分蘗數(shù)。在大豆中,miR167家族有11個(gè)高度保守的同源miRNA,可分為miR167a/b/d/e/f/g/h/i/j/k和miR167c兩個(gè)亞組,miR167初級轉(zhuǎn)錄本由不同的基因產(chǎn)生,成熟的miR167在3′端或5′端只有一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的差異,miR167介導(dǎo)了大豆的結(jié)瘤作用[10]。

miR167可以靶向不同的靶基因參與植物生長發(fā)育的調(diào)控,而miR167切割靶基因是一種常見的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式。生長素響應(yīng)因子是調(diào)控生長素響應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,它可以與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)的生長素響應(yīng)元件(Auxin response element,AUXRE)“TGTTC”結(jié)合,激活或抑制生長素響應(yīng)基因,并與第二個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族AUX/IAA阻遏蛋白相互作用,誘導(dǎo)生長素響應(yīng)[21-23]。ARF轉(zhuǎn)錄因子包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：保守的B3家族N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)可以激活或抑制基因的表達(dá)的非保守的中間區(qū)域以及保守的C端結(jié)構(gòu)域(CTD)[24]。ARF的C端結(jié)構(gòu)域與AUX/IAA蛋白的III和IV結(jié)構(gòu)域相似[25]。ARF和生長素(Auxin,AUX)吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)可以通過該結(jié)構(gòu)域形成二聚體[26]。ARF家族成員的數(shù)量因物種而異,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[27]和水稻[28]中分別有23和25個(gè)ARF家族成員。在番茄(Solanumlycopersicum)[29]、玉米[30]、油菜(Brassicanapus)[31]、大豆[32]和木薯(Manihotesculenta)[33-34]等植物中也鑒定到ARF基因。生長素在從種子胚胎發(fā)生到植物衰老的整個(gè)生命過程中發(fā)揮重要作用,其功能主要由ARF和AUX/IAA[35-36]介導(dǎo)。生長素響應(yīng)因子ARF6和ARF8在營養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育中起保守作用,調(diào)控根和莖的發(fā)育、雄蕊花絲的伸長、花藥的開裂、雌蕊的成熟和開花時(shí)間[37-39]。在擬南芥中,miR167靶向AtARF6/8基因的互補(bǔ)位點(diǎn)并進(jìn)行剪切來調(diào)控花藥和胚珠的正常發(fā)育[7]。酰胺水解酶家族成員IAR3也被證明是miR167的靶基因[8],擬南芥IAA酰胺水解酶家族包含7個(gè)基因,包括IAR3,ILL1,ILL2,ILL3,ILL5,ILL6和ILR1[40]。IAR3是一種編碼IAA-Ala的水解酶,可以從無活性的IAA-Ala中釋放具有生物活性的生長素,調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生長素平衡,并受茉莉酸(Jasmonic acid,JA)的誘導(dǎo)[41],在根、莖和花中表達(dá)最強(qiáng)。

近年來,miR167因其在調(diào)控植物生長發(fā)育和非生物脅迫中的作用而被廣泛研究。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,在蒺藜苜蓿中過表達(dá)Mt-miR167c,導(dǎo)致植株矮化,果莢變小[42]。為了進(jìn)一步明確miR167c的生物學(xué)功能和可能的調(diào)控機(jī)制,本研究根據(jù)蒺藜苜蓿miR167c合成了其互補(bǔ)序列,構(gòu)建海綿載體,抑制miR167c的表達(dá)。Mt-miR167c與At-miR167c僅前兩個(gè)堿基存在差異,故兩者均可受到海綿序列的抑制。由于擬南芥生長周期短,優(yōu)先探究了At-miR167c在擬南芥中的功能,并對其進(jìn)行靶基因表達(dá)量檢測和轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析,明確miR167c參與擬南芥株型和花器官發(fā)育分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

擬南芥種子(生態(tài)型Col-0)用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min,無菌水清洗6～7次后種于1/2 MS固體培養(yǎng)基中,于4℃春化2 d后,移入人工氣候培養(yǎng)箱中(溫度22℃/20℃,相對濕度60%,光照16 h/黑暗8 h)培養(yǎng)14 d后,將其移入土(營養(yǎng)土∶蛭石=2∶3)中生長。

1.2 miR167c靶基因的預(yù)測與篩選

利用在線網(wǎng)站psRNAtarget(http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget)預(yù)測At-miR167c靶標(biāo)基因,將最大期望值設(shè)置為5.0,依據(jù)評分結(jié)果進(jìn)行篩選。

1.3 miR167c海綿序列的設(shè)計(jì)與合成

研究表明,miR167家族在不同物種中具有較高的保守性,且蒺藜苜蓿miR167c與擬南芥中miR167a/b/c/d的序列相似度為93.96%,Mt-miR167c與At-miR167c僅前兩個(gè)堿基存在差異[41]。在miR167c成熟體的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)2個(gè)堿基凸起,以防止RNA干擾型切割和海綿RNA被蛋白Argonaute 2(AGO2)降解。為提高結(jié)合效率,將海綿序列設(shè)置10次重復(fù),并用4個(gè)相同的堿基進(jìn)行分隔。為避免與海綿序列的第一個(gè)及最后一個(gè)核苷酸重復(fù),使用了4個(gè)胸腺嘧啶殘基作為間隔。另外,在海綿序列兩端加上與pCAMBIA3301載體連接的接頭序列。將所設(shè)計(jì)序列發(fā)送至生物公司進(jìn)行合成。

1.4 海綿載體構(gòu)建與擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

利用無縫克隆試劑盒(CloneSmarter)將海綿序列連接至pCAMBIA3301載體,將pCAMBIA3301-miR167c-Sponge轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Vazyme)中,挑取陽性單克隆送至生物公司測序。轉(zhuǎn)化測序正確重組載體至GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞(華越洋生物)。用YEB液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8,離心收集菌體,用5%蔗糖溶液(含0.02% SilwetL-77)重懸浮菌體,采用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥,收獲T0代種子備用。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性鑒定與At-miR167c的表達(dá)量分析

在含有4 mg·L-1草銨膦的1/2 MS固體培養(yǎng)基中初步篩選T0代轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥植株,轉(zhuǎn)入土培15 d后提取葉片DNA,以35S-F和Sponge-R為引物(表1)進(jìn)行PCR陽性鑒定。使用Trizol提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的總RNA,使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN)反轉(zhuǎn)錄,以U6和At-miR167c成熟體序列為引物(表1),用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量檢測,鑒定不同轉(zhuǎn)基因株系中At-miR167c的表達(dá)水平。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),2-ΔΔCT方法進(jìn)行表達(dá)量數(shù)據(jù)分析,LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株At-miR167c靶基因表達(dá)量分析

Trizol法提取T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的總RNA,反轉(zhuǎn)錄(UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR,Genesand)后,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量(aq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix,Vazyme)檢測,鑒定轉(zhuǎn)基因株系中At-miR167c靶基因的表達(dá)水平。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),2-ΔΔCT方法進(jìn)行表達(dá)量數(shù)據(jù)分析,LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析

T2代幼苗由培養(yǎng)基移至盆土中記作1日齡,觀察統(tǒng)計(jì)超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的開花時(shí)間、花序數(shù)和花苞數(shù),并測定植株生物量、蓮座葉數(shù)、株高、分枝數(shù)和果莢數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果以平均值表示。IBM SPSS Statistics 25、Excel 2016和Graphpad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 At-miR167c靶基因預(yù)測結(jié)果分析

利用在線軟件psRNAtarget預(yù)測At-miR167c的靶標(biāo)基因,結(jié)果顯示擬南芥miR167c有105個(gè)靶基因,選擇評分較高的ARF6/8、類受體蛋白激酶家族蛋白(Receptor-likeproteinkinase-relatedfamilyprotein,RPK)和IAR3基因(表2)作為后續(xù)研究對象。

表2 At-miR167c的靶基因預(yù)測Table 2 Target genes prediction of At-miR167c

2.2 miR167c-Sponge海綿載體模式圖

在pCAMBIA3301載體中,將與miR167c成熟體互補(bǔ)的海綿序列插入由CaMV 35S啟動子驅(qū)動的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)報(bào)告基因的5′端,構(gòu)建miR167c海綿抑制表達(dá)載體P35S：miR167c-Sponge(圖1)。海綿序列由中間間隔4個(gè)胸腺嘧啶的10個(gè)miR167c成熟體互補(bǔ)序列串聯(lián)排列,其中以4個(gè)胸腺嘧啶殘基作為間隔,長度為246 bp。

圖1 miR167c-Sponge海綿載體模式圖Fig.1 Pattern diagram of miR167c-Sponge vector

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性鑒定和At-miR167c及其靶基因表達(dá)量分析

構(gòu)建P35S：miR167c-Sponge載體,采用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代種子在含4 mg·L-1草銨膦的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行初步的陽性篩選,挑選正常發(fā)芽的幼苗移栽至花盆中。待轉(zhuǎn)基因株系生長至10 d后,提取葉片DNA后進(jìn)行PCR陽性檢測。PCR結(jié)果顯示,共鑒定出12個(gè)miR167c-Sponge過表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因株系(圖2A)。隨機(jī)選擇其中的5個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因株系,通過RT-qPCR在轉(zhuǎn)錄水平檢測轉(zhuǎn)基因株系中At-miR167c的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與野生型相比,所選的5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中At-miR167c的表達(dá)水平均下降(圖2B),且不同株系中表達(dá)水平存在差異。miR167c-Sponge過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系L3中的At-miR167c表達(dá)量最低,較野生型(WT)降低53.6%;株系L7次之,表達(dá)量降低46.4%;其余株系的表達(dá)量相較于WT降低10.9%～43.8%。

圖2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of the transgenic Arabidopsis注：A,轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性植株P(guān)CR檢測;B,轉(zhuǎn)基因擬南芥中At-miR167c的相對表達(dá)量。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),下同Note：Panel A,PCR assay of transgenic Arabidopsis resistant plants;Panel B,Relative expression of At-miR167c in transgenic Arabidopsis.Different letters indicate a significant difference at 0.05 level,the same as below

選取轉(zhuǎn)基因株系L3和L7為后續(xù)研究對象,并鑒定At-miR167c潛在靶基因的表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示,在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中,4個(gè)靶基因表達(dá)水平與WT相比均顯著升高(圖3)。其中,靶基因At-ARF6表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因株系L3和L7中分別較野生型增加86.4%和67.0%(圖3A);At-ARF8的表達(dá)量分別為WT的2.09倍和2.41倍(圖3B)。轉(zhuǎn)基因株系L3中At-RPK和At-IAR3表達(dá)量分別為WT的2.81倍及2.85倍(圖3C,3D),在株系L7中,At-RPK和At-IAR3表達(dá)水平分別為WT的1.78倍和2.47倍。miR167c-Sponge過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系L3和L7中,At-miR167c相對表達(dá)量降低1倍左右,而At-miR167c靶基因表達(dá)量上調(diào)1倍以上。

圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥At-miR167c靶基因表達(dá)量鑒定Fig.3 Expressional identification of the target genes of At-miR167c in the transgenic Arabidopsis

2.4 超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析

觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥開花時(shí)間發(fā)現(xiàn),超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥開花時(shí)間早于WT(圖4)。相同生長條件下,WT在移栽至花盆18.6 d后開花,而轉(zhuǎn)基因株系L3和L7開花時(shí)間分別為14.3 d和15.0 d,平均開花時(shí)間較WT分別提前4.3 d及3.6 d(圖4A,4C),表明抑制At-miR167c的表達(dá)可能影響了轉(zhuǎn)基因株系的開花時(shí)間。在轉(zhuǎn)錄水平檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中開花相關(guān)基因At-REM16、At-SOC1和At-FT的表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示,在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中,3個(gè)開花相關(guān)基因的表達(dá)水平與野生型相比均顯著升高(圖5)。其中,At-REM16表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因株系L3和L7中分別較WT增加70.4%和47.0%(圖5A);At-SOC1的表達(dá)水平分別較WT增加46.3%和39.2%(圖5B)。在轉(zhuǎn)基因株系L3和L7中,At-FT的表達(dá)量分別為野生型的1.48倍和2.00倍(圖5C)。同時(shí),還觀察到超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥的花器官形態(tài)發(fā)生變異,與WT相比,生長30 d的轉(zhuǎn)基因植株花序緊湊,花苞數(shù)量增多(圖4B)。WT在開花12 d后的花苞數(shù)為42.3個(gè),而株系L3和L7的花苞數(shù)量分別為80.0個(gè)和81.3個(gè),其數(shù)量增加了近1倍(圖4D)。除此之外,轉(zhuǎn)基因擬南芥的花序數(shù)量也明顯增加(圖4E,4F)。轉(zhuǎn)基因擬南芥L3和L7兩個(gè)株系(35 d)的花序數(shù)量分別為8.3個(gè)和8.6個(gè),而野生型的花序數(shù)僅4.3個(gè)(圖4F),轉(zhuǎn)基因株系花器官的數(shù)量較對照增加了近1倍。上述結(jié)果表明,At-miR167c可能對擬南芥花器官的發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。

21日齡的超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥的蓮座葉數(shù)量增多,葉片增大。轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L3及L7的蓮座葉數(shù)平均值分別為30.3片和31.0片,而WT蓮座葉數(shù)為19.3片(圖6B)。轉(zhuǎn)基因株系L3和L7的蓮座葉面積明顯增大(圖6A),葉片平均鮮重分別為0.453 g及0.502 g,而WT葉片平均鮮重為0.132 g(圖6C);株系L3,L7和WT的平均干重分別為0.058 g,0.067 g及0.022 g(圖6D)。以上結(jié)果表明抑制At-miR167c的表達(dá)可一定程度上促進(jìn)擬南芥葉片生長。

超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥的株型也表現(xiàn)出明顯差異,主要表現(xiàn)在株高和分枝數(shù)方面(圖7)。轉(zhuǎn)基因擬南芥L3及L7株系的植株高度顯著增加,其平均株高為47.6 cm和45.6 cm,分別比野生型植株高出16.3 cm和14.3 cm(圖7C)。株系L3,L7的植株分枝數(shù)平均值為11.6個(gè)和11.0個(gè),而WT的分枝數(shù)為6.0個(gè),僅為轉(zhuǎn)基因植株的一半(圖7B)。以上結(jié)果表明,At-miR167c表達(dá)水平下調(diào)可能促進(jìn)擬南芥株高和分枝數(shù)的增加。

在本研究中,我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟期的果莢數(shù)量顯著增加。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,WT的果莢平均數(shù)為106.6個(gè),轉(zhuǎn)基因株系L3,L7的果莢平均數(shù)分別為235.6,223.0個(gè)(圖8D),轉(zhuǎn)基因株系的果莢數(shù)量分別為野生型的2.20倍和2.09倍。結(jié)果表明,At-miR167c可能對擬南芥的生殖生長也有重要作用。

3 討論

miR167廣泛存在于植物中,在調(diào)控植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。本研究構(gòu)建了miR167c的海綿互補(bǔ)序列,獲得了過表達(dá)miR167c海綿互補(bǔ)序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,并對轉(zhuǎn)基因株系的表型進(jìn)行了觀察和統(tǒng)計(jì),探究了miR167c在擬南芥生長發(fā)育中的調(diào)控作用。初步研究結(jié)果表明,miR167可能通過調(diào)控其主要靶基因ARF6/8和IAR3的表達(dá),參與調(diào)控?cái)M南芥株型和花器官的發(fā)育,在擬南芥的營養(yǎng)生長和生殖生長階段發(fā)揮重要調(diào)控作用。

開花是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的重要過程,是開花植物生殖繁育的關(guān)鍵環(huán)節(jié),受植物內(nèi)在因素和環(huán)境條件的協(xié)同調(diào)控[43]。有研究表明,通過人工miRNA靶標(biāo)模擬技術(shù)合成與miR167堿基互補(bǔ)的靶標(biāo)模擬物(MIM167)轉(zhuǎn)化擬南芥,導(dǎo)致ARF6/8表達(dá)量上調(diào)和晚花表型[45]。與此研究結(jié)果一致,擬南芥miR167a缺失突變體同樣表現(xiàn)出開花延遲的表型[15]。而本研究中,超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥中ARF6/8表達(dá)量上調(diào),但出現(xiàn)了與報(bào)道結(jié)果相反的早花表型。靶基因預(yù)測結(jié)果顯示,AP2/B3類轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白基因(AP2/B3-liketranscriptionalfactorfamilyprotein)為At-miR167c的潛在靶基因(表2)。有研究表明,REM16轉(zhuǎn)錄因子作為AP2/B3類轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,在開花途徑中作用于開花激活基因SOC1和FT的上游,通過直接激活SOC1和FT促進(jìn)開花[46]。本研究認(rèn)為,miR167c可能通過介導(dǎo)REM16的表達(dá)來調(diào)控?cái)M南芥的開花時(shí)間,而REM16的過量表達(dá)正是促進(jìn)開花的原因之一。At-miR167c的表達(dá)受抑制后REM16的表達(dá)水平升高(圖5A),同時(shí)激活SOC1和FT,從而增加二者的表達(dá)量(圖5B,5C)促進(jìn)擬南芥開花。

擬南芥的花序調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程,當(dāng)生長過程轉(zhuǎn)換到生殖生長階段,其營養(yǎng)生長的莖尖分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L的花序分生組織。目前尚未有研究報(bào)道m(xù)iR167對花序的調(diào)控作用。但有研究表明,miR172通過抑制其靶基因APETALA2(AP2)的表達(dá),調(diào)控花序分生組織細(xì)胞的大小和數(shù)量,進(jìn)而影響花器官發(fā)育[47]。在本研究中,At-miR167c的預(yù)測靶基因AP2/B3為AP2基因編碼的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)亞族[48]。AP2/ERF參與調(diào)控花序分生組織的大小、花芽的分化和花器官生長發(fā)育的過程[49]。由此推測,海綿序列抑制At-miR167c的表達(dá)后,其靶基因AP2/B3的表達(dá)量上調(diào),促進(jìn)了花序分生組織的形成與花苞的分化,增加了過表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥花序和花苞的數(shù)量。

在胚胎發(fā)育早期,種皮中生長素的生物合成增加。有研究報(bào)道,miR167靶向ARF6/8影響胚胎發(fā)育過程中生長素的合成與局部運(yùn)輸,從而調(diào)控?cái)M南芥體胚發(fā)生[50]。本研究發(fā)現(xiàn),超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥的果莢數(shù)較野生型增加了近1倍,相應(yīng)地,其種子產(chǎn)量也增加了1倍,該結(jié)果可能與miR167c的靶基因ARF6/8的表達(dá)量增加有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),生長素輸入載體基因OsAUX3控制果莢粒長和粒重增加,而OsARF6是OsAUX3的上游轉(zhuǎn)錄因子,OsARF6可以直接與OsAUX3啟動子上的生長素響應(yīng)元件結(jié)合,通過調(diào)控OsAUX3基因的轉(zhuǎn)錄,改變籽粒細(xì)胞的縱向生長以及生長素的分布和含量來控制籽粒長度[51]。由此推測,本研究中轉(zhuǎn)基因擬南芥可能同樣通過miR167c-ARF-AUX網(wǎng)絡(luò)調(diào)控果莢的發(fā)育。

miR167還參與調(diào)控植物營養(yǎng)器官的發(fā)育,如在轉(zhuǎn)基因水稻中過表達(dá)miR167,OsARF6/12/17/25的轉(zhuǎn)錄水平會顯著降低,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻植株矮化,分蘗數(shù)顯著減少[11]。在番茄中過表達(dá)miR167a降低了細(xì)胞長度,增加了細(xì)胞數(shù)量,且最終節(jié)間和葉片皺縮[37]。本研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中過表達(dá)miR167c-Sponge,At-miR167c表達(dá)水平顯著降低,轉(zhuǎn)基因擬南芥株高增加,分枝數(shù)增加。ARF在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中與AUX/IAA基因相互作用,參與植物激素信號傳導(dǎo)途徑[52],調(diào)控植物生長的多種過程。其中,生長素是調(diào)控植物生長發(fā)育最重要的激素之一[53]。吲哚-3-丙酮酸(Indole-3-pyruvate,IPA)途徑是植物體內(nèi)IAA生物合成的主要途徑,廣泛存在于大多數(shù)植物體中。有研究表明,YUC是IAA生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶編碼基因[54]。At-miR167c靶基因的預(yù)測結(jié)果中沒有YUC基因,但是,在Mt-miR167c靶基因預(yù)測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了YUC6,后期將檢測該基因在超表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因蒺藜苜蓿中的表達(dá)量及生長素含量,重點(diǎn)解析miR167c、靶基因YUC6和生長素含量三者的關(guān)系,進(jìn)一步探究miR167c在調(diào)控植物生長過程中的作用。

4 結(jié)論

本研究在擬南芥中超表達(dá)海綿載體miR167c-Sponge,降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥中miR167c的表達(dá)水平,并初步分析了轉(zhuǎn)基因株系中其預(yù)測靶基因At-ARF6,At-ARF8,At-RPK和At-IAR3的表達(dá)水平。過表達(dá)miR167c-Sponge轉(zhuǎn)基因擬南芥開花提前,花序和花苞數(shù)量增多,株高增加,分枝數(shù)量和果莢數(shù)量均增多。研究結(jié)果表明miR167c可能在植物生長發(fā)育過程發(fā)揮重要調(diào)控作用,對解析miRNA介導(dǎo)的植物株型和花器官發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了更多依據(jù)。