河西冷涼地區(qū)芍藥根腐病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

楊克澤， 吳芳， 魏玉杰， 汪亮芳， 常浩，吳之濤，2， 楊憲忠，2

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅省特種藥源植物種質(zhì)創(chuàng)新與安全利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 武威 733006；2.武威市祁連山區(qū)道地中藥材生態(tài)栽培技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 武威 733006）

芍藥（Paeonia LactifloraPall.）是芍藥科芍藥屬著名草本花卉，不僅有極高的觀賞價(jià)值，而且有非常重要的藥用價(jià)值。河西冷涼地區(qū)因具有獨(dú)特的地理優(yōu)勢(shì)與氣候條件，適合種植芍藥，主要分布在武威市古浪縣古豐鎮(zhèn)柳條河與黃羊川鎮(zhèn)、金昌等地區(qū)。近年來(lái)，芍藥種植面積逐年增加，市場(chǎng)前景非常廣闊。在芍藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展過(guò)程中，其病蟲害問(wèn)題日益增多，且危害越來(lái)越嚴(yán)重，不僅降低了芍藥的產(chǎn)量，還嚴(yán)重影響了其觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值等。

目前，河西冷涼地區(qū)芍藥的主要病害種類有白粉病、根腐病、褐斑病等[1-2]，其中根腐病是為害芍藥根部最嚴(yán)重的病害[3-5]。因此，本研究針對(duì)河西冷涼地區(qū)芍藥病害情況展開(kāi)調(diào)查研究，對(duì)引起芍藥根腐病的病原菌進(jìn)行分離和形態(tài)鑒定，同時(shí)開(kāi)展室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，針對(duì)芍藥病害的病原、發(fā)病規(guī)律、危害癥狀進(jìn)行分析，為河西冷涼地區(qū)芍藥根腐病的田間防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芍藥根腐病病株采自甘肅省武威市涼州區(qū)黃羊鎮(zhèn)新鎮(zhèn)路的甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院芍藥種植基地（N 37°67′35″，E 102°85′32″）。

3%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑購(gòu)自先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司，30%丙硫菌唑可分散性懸浮劑購(gòu)自通州先正大農(nóng)藥化工有限公司，24%噻呋酰胺懸浮劑購(gòu)自北京燕化用生生物有限公司，50%多菌靈可濕性粉劑購(gòu)自深圳諾普信公司，43%戊唑醇懸浮劑購(gòu)自上海生農(nóng)生化制品有限公司，20%氟唑菌酰羥胺懸浮種衣劑購(gòu)自先正達(dá)投資有限公司，43%氟菌肟菌脂懸浮劑購(gòu)自拜爾有限公司，25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑購(gòu)自先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司，30%肟菌戊唑醇懸浮劑購(gòu)自拜爾有限公司，10%葉菌唑懸浮劑購(gòu)自安徽久易有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芍藥根腐病病原菌的分離和致病性測(cè)定采集的芍藥根腐病病株逐個(gè)記錄發(fā)病癥狀。采用常規(guī)組織分離法[6]樣品中的病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的菌株稀釋純化進(jìn)行單孢分離，獲得單孢進(jìn)行純培養(yǎng)。將在芍藥根腐病株中分離到的頻率較高的菌落，根據(jù)柯赫氏法則[7]驗(yàn)證分離物的致病性。選擇健康芍藥植株，栽植前剪去過(guò)長(zhǎng)的根系，將根部放入0.1%的升汞液中浸泡3 min后取出，用無(wú)菌水清洗干凈，移栽到裝有基質(zhì)（110 ℃烘箱中高溫消毒）的花盆中，澆水后放入設(shè)施大棚中緩苗；緩苗后，準(zhǔn)備1×107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液進(jìn)行灌根接種，灌根前刺傷芍藥根部，以灌無(wú)菌水作為對(duì)照。接種20 d 后進(jìn)行調(diào)查，并取樣帶回室內(nèi)進(jìn)行再分離[8]。

1.2.2 芍藥根腐病病原菌鑒定 形態(tài)鑒定：將確定了對(duì)芍藥根部有致病性的單孢純系菌落接種于PCA（馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL）培養(yǎng)基，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后測(cè)定菌落直徑并計(jì)算生長(zhǎng)速度；10 d 后觀察培養(yǎng)性狀及色澤，并挑取少量菌絲制成臨時(shí)玻片在顯微鏡下觀測(cè)孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行顯微拍照[9]。形態(tài)鑒定主要依據(jù)Leisle 分類系統(tǒng)并參照Booth和Burgess分類系統(tǒng)[10]。

分子鑒定：根據(jù)致病性測(cè)定和形態(tài)鑒定結(jié)果，選擇代表性的菌株委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增引物分別為ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，將測(cè)序獲得的序列在NCBI 上通過(guò)BLAST 比對(duì)后，根據(jù)同源性對(duì)分離菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的近緣鐮孢菌采用鄰接法[11]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 芍藥根腐病病原菌室內(nèi)藥劑篩選 采用含毒介質(zhì)法[12]進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，具體方法如下。分別量取50 mL PDA 培養(yǎng)基，裝入250 mL 的三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌，滅菌后冷卻至50 ℃左右，分別量取5 mL 3%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑、30%丙硫菌唑可分散性懸浮劑、24%噻呋酰胺懸浮劑、50%多菌靈可濕性粉劑、43%戊唑醇懸浮劑、20%氟唑菌酰羥胺懸浮種衣劑、43%氟菌肟菌脂懸浮劑、25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑、30%肟菌戊唑醇懸浮劑和10%葉菌唑懸浮劑加入裝有PDA 培養(yǎng)基的三角瓶，搖勻后倒入90 mm的培養(yǎng)皿中；用消過(guò)毒的打孔器打取直徑為6 mm的病原菌菌片，將其移入冷卻后的PDA 平板中央，以加水作空白對(duì)照。每種藥劑分別設(shè)置5個(gè)劑量處理（表1），每個(gè)處理重復(fù)4次。在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，然后測(cè)量菌落直徑（mm），計(jì)算菌絲生長(zhǎng)相對(duì)抑制率（%）；以藥劑濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(x)，相對(duì)抑制率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)(y)，用Microsoft Excel 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和抑制中濃度(EC50)，比較不同藥劑的毒力。

表1 10種藥劑的施用劑量處理Table 1 Dosage treatments of 10 Insecticides

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，采用MEGA 5 的鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥根腐病發(fā)病癥狀

芍藥發(fā)生根腐病后，根系腐爛，地上葉片出現(xiàn)褪綠或死亡，植株矮小。在根莖及其以下部位發(fā)病，老根發(fā)病較重，部分細(xì)根、新根也有感病。發(fā)病初期，根部產(chǎn)生不規(guī)則黑色或褐色病斑；然后病斑逐漸擴(kuò)展并凹陷，至大部分根變黑腐爛，嚴(yán)重的根部全部腐爛、地上部分干枯全株死亡（圖1）。

圖1 芍藥根腐發(fā)病癥狀Fig. 1 Symptom of root rot of Paeonia lactiflora

2.2 病原菌的形態(tài)特征

自芍藥根部分離的病原物生長(zhǎng)速率較快，在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d 后，菌落直徑為6.6 cm。菌落正面呈白色絮狀，菌絲放射狀生長(zhǎng)，絨狀；菌落背面中心呈紫色，邊緣呈白色（圖2）。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，小型分生孢子數(shù)量較多，呈卵圓形或腎形，0~1 個(gè)隔膜，假頭狀著生在產(chǎn)孢細(xì)胞上，大小為(2.37~3.14) μm×(6.51~9.28) μm；大型分生孢子數(shù)量較少，呈鐮刀狀，較均勻，3~5 個(gè) 隔 膜，孢 子 大 小 為(3.99~4.74) μm×(22.60~45.94) μm（圖3A 和B）；產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，較短（圖3C）；厚垣孢子球形，表面光滑，單個(gè)或多個(gè)著生于菌絲間（圖3D）。

圖2 病原菌形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of pathogenic bacteria

圖3 產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of sporogenic cells

2.3 致病性測(cè)定結(jié)果

用分離到的高頻率菌株SY2020-2 的孢子懸浮液灌根接種，20 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，芍藥根部出現(xiàn)黑褐色病斑，病斑沿刺傷傷口處縱橫擴(kuò)展，而對(duì)照根部的刺傷處無(wú)病斑。取病健交接處進(jìn)行再分離、純化、培養(yǎng)并與接種菌株進(jìn)行比較，菌落顏色以及孢子形態(tài)相似，故SY2020-2 對(duì)芍藥根具有致病性（圖4）。

圖4 致病性測(cè)定Fig. 4 Pathogenicity determination

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將SY2020-2 測(cè)序獲得的微管蛋白序列在NCBI 上通過(guò)BLAST比對(duì)，根據(jù)同源性相似度對(duì)其與數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的近源菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖5）顯示，SY2020-2 與登錄號(hào)為MN417204.1（Fusariumoxysporum）和 MN417203.1（Fusarium oxysporum）聚為1 支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株SY2020-2鑒定為尖孢鐮孢菌（Fusariumoxysporum）。

圖5 基于微管蛋白序列構(gòu)建的相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree of related strains based on tubulin sequences

2.5 不同殺菌劑對(duì)芍藥根腐病菌尖孢鐮孢菌的毒力回歸分析

由表2可知，供試的10種藥劑對(duì)SY2020-2均具有較好的毒力效果，其中EC50小于10 mg·L-1的藥劑有6種，由強(qiáng)到弱分別為30%丙硫菌唑、43%氟菌·肟菌脂、50%多菌靈、10%葉菌唑、20%氟唑菌酰胺和30%肟菌·戊唑醇，EC50分別為0.1、1.2、2.7、3.5、4.8和6.4 mg·L-1；43%戊唑醇和24%噻呋酰胺的EC50分別是13.6 和16.8 mg·L-1；25 g·L-1咯菌腈和3%苯醚甲環(huán)唑的EC50分別為124.4和600.2 mg·L-1。

表2 不同殺菌劑對(duì)芍藥根腐病菌尖孢鐮孢菌的毒力回歸分析Table 2 Regression analysis of virulence of different fungicides against Fusarium oxysporum

3 討論

芍藥根腐病是危害芍藥生長(zhǎng)的主要病害之一，不但會(huì)造成大面積傳播，而且危害程度較大。由尖孢鐮孢菌為主要病原菌引起的芍藥根腐病在芍藥種植過(guò)程中普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重。本研究通過(guò)實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，芍藥根腐病在河西冷涼地區(qū)發(fā)生普遍，因此對(duì)其病原菌進(jìn)行了分離與鑒定，并進(jìn)一步在室內(nèi)進(jìn)行了藥劑篩選和毒力測(cè)定。李麗[13]研究表明，導(dǎo)致芍藥根腐病致病菌為茄腐皮鐮孢菌（F. solani），且茄腐皮鐮孢菌可與鐮孢菌屬內(nèi)的其他鐮孢菌混合侵染引起根腐病。李艷梅等[14]通過(guò)接種試驗(yàn)，證實(shí)茄腐皮鐮孢菌和尖孢鐮孢菌為大花蕙蘭根腐病的主要病原菌，且混合接種后的發(fā)病率高于單獨(dú)接種。本研究從河西冷涼地區(qū)的芍藥根腐病病株中分離得到SY2020-2 菌株，通過(guò)其形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，將該菌株鑒定為尖孢鐮孢菌；選用的10 種殺菌劑對(duì)尖孢鐮孢菌都有一定的抑制作用，且隨著用量的增大，抑制率逐漸增強(qiáng)。其中對(duì)尖孢鐮孢菌毒力最強(qiáng)的藥劑是丙硫菌唑（0.1 mg·L-1），氟唑菌酰胺（4.8 mg·L-1）、氟菌·肟菌脂（1.2 mg·L-1）、多菌靈（2.7 mg·L-1）、肟菌·戊唑醇（6.4 mg·L-1）、葉菌唑（3.5 mg·L-1）的毒力較強(qiáng)；而咯菌腈（124.4 mg·L-1）和苯醚甲環(huán)唑（600.2 mg·L-1）對(duì)尖孢鐮孢菌的毒力相對(duì)較差。

目前，芍藥根腐病的防治主要是在農(nóng)業(yè)措施的基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)防治。本研究對(duì)河西冷涼地區(qū)芍藥根腐病病原進(jìn)行了鑒定，并對(duì)優(yōu)勢(shì)病原菌進(jìn)行了室內(nèi)藥劑篩選，為芍藥根腐病的田間防治提供了理論依據(jù)；篩選出了對(duì)尖孢鐮孢菌毒力較強(qiáng)的藥劑，今后，需對(duì)其田間防治效果進(jìn)行進(jìn)一步地驗(yàn)證。