滇西槽舌蘭內(nèi)生真菌多樣性及其共生真菌對(duì)疊鞘石斛種子萌發(fā)的效應(yīng)

李愛花， 王濤， 王苗苗， 鄧軍育， 劉佳， 亞吉東， 張毓

（1.國(guó)家植物園北園，植物遷地保護(hù)國(guó)家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心，北京100093； 2.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)，昆明 650201）

蘭科植物是被子植物的第二大科，由于生物多樣性喪失、人類過度采集等原因，許多蘭科植物生存狀況受到威脅，是全球生物多樣性保護(hù)的“旗艦”類群。植物內(nèi)生真菌對(duì)植物的生長(zhǎng)、適應(yīng)性、進(jìn)化及植物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生影響[1-3]。多數(shù)蘭科植物與真菌共生，其種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育需要依賴共生真菌[4]，且大多數(shù)蘭科植物在成年階段也會(huì)維持這種共生關(guān)系[5-6]。高度依賴于特異共生真菌的蘭花，往往會(huì)因?yàn)槠錆撛谏车目捎眯院头植枷拗?，?dǎo)致物種瀕危[7]。

滇西槽舌蘭[Holcoglossum rupestre(Hand.-Mazz.) Garay]是中國(guó)特有物種，僅發(fā)現(xiàn)2~3 個(gè)居群，位于金沙江干熱河谷地帶高山櫟樹上。由于工程建設(shè)、全球氣候變化、人為破壞等原因，滇西槽舌蘭所依存的高山櫟林正處在快速消失中，因此，目前滇西槽舌蘭被評(píng)為極度瀕危物種，并被列入國(guó)家極小種群植物名錄（2002 版）。如果沒有搶救性措施，滇西槽舌蘭有可能成為長(zhǎng)江流域滅絕的蘭科植物[8]。因此，亟需對(duì)滇西槽舌蘭及其生態(tài)環(huán)境開展保護(hù)性研究。了解滇西槽舌蘭的內(nèi)生真菌多樣性及其與蘭科植物的共生關(guān)系，可以為滇西槽舌蘭的物種瀕危原因提供理論參考，但相關(guān)研究較少。Tan等[9]對(duì)9個(gè)槽舌蘭屬物種進(jìn)行了內(nèi)生真菌的分離和鑒定，共鑒定得到46 株內(nèi)生真菌，但是滇西槽舌蘭中僅鑒定得到5株，且均為非共生真菌。因此，有必要對(duì)已知分布地及栽培地滇西槽舌蘭的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和多樣性分析，并進(jìn)行功能鑒定，為滇西槽舌蘭的保育及瀕危機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2021年5—6月，從云南香格里拉、楚雄、昆明盤龍、昆明呈貢4 個(gè)生長(zhǎng)地收集健康、新鮮、粗壯滇西槽舌蘭植株的氣生根3~7段，用濕紙巾包裹，放到干凈的盒子內(nèi)，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑及儀器

采用PDA 培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)。配置方法如下：PDA 培養(yǎng)基粉末46.0 g，加入到1.0 L超純水中，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，制備固體PDA 培養(yǎng)基。18S rDNA 擴(kuò)增所用試劑均購(gòu)自TaKaRa 公司；PCR Purification Kit 購(gòu)自Promega 公司；PCR 儀為Biometra 公司生產(chǎn)的Tgradient；凝膠成像分析儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生菌的分離 選用組織塊分離法分離內(nèi)生真菌，流程如下：首先用自來水沖洗干凈根段，去除根表面泥土及附屬物，用吸水紙吸干水分；然后將根切成2~3 cm 的小段，用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗1 次，5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）NaClO 消毒5 min，無菌水沖洗3 次，吸干水分；最后用無菌雙面刀片將根段切成1~2 mm的薄片，放到PDA培養(yǎng)基中，每皿放置12小片，密封放置在25 ℃暗培養(yǎng)。及時(shí)觀察培養(yǎng)皿中菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，待菌絲長(zhǎng)出后用接種針挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基中進(jìn)一步純化，待菌落無雜菌，生長(zhǎng)均勻后，進(jìn)行保藏和檢測(cè)。

1.3.2 內(nèi)生真菌的鑒定 分離的共生真菌分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[10]和分子鑒定。通過光學(xué)顯微鏡（Olimpus CX31）觀察內(nèi)生真菌的菌絲形態(tài)，方法如下： 用透明膠帶粘取少量菌絲，置于涂有10%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）KOH 的載玻片上，觀察菌絲的直徑、分枝、念珠狀細(xì)胞、孢子、隔膜等特征。

采用通用菌類18S rDNA 鑒定方法[11]進(jìn)行分子鑒定。樣品DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序均由北京博友順生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。引物為真菌通用引物組合ITS1/ITS4，由上海生工有限公司合成。PCR 體系包括：處理后的樣品(20 ng·μL-1)模板2 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 2.5 μL，引物(20 μmol·L-1)各1.5 μL，10×ExTaqBuffer (Mg2+plus ) 5 μL，Ex Taq 酶（5U·μL-1）0.2 μL，ddH2O 補(bǔ)足到50 μL。PCR 程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）瓊脂糖檢測(cè)后，回收目的條帶，純化后，用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測(cè)序。獲得的序列在GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，查找相似性最高的序列信息，并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，以確定真菌種類。當(dāng)所測(cè)菌株的ITS 序列與NCBI庫(kù)中片段相似性大于99%，則認(rèn)為是同一物種；所測(cè)菌株ITS 序列與NCBI 庫(kù)中片段相似性大于95%，則認(rèn)為是同一屬的物種；相似性小于95%，認(rèn)為是未鑒定物種[12]。

1.3.3 膠膜菌對(duì)疊鞘石斛種子共生萌發(fā)的作用膠膜菌菌株P(guān)2、P24、P35、P47 用無菌打孔器打成直徑5 mm左右的圓片；將約八成成熟的疊鞘石斛果實(shí)滅菌后，接種到放有纖維網(wǎng)的固體燕麥培養(yǎng)基上，將菌株圓片放到播種的燕麥培養(yǎng)基上，每皿放4 塊；同時(shí)設(shè)置1 個(gè)陰性處理（僅燕麥培養(yǎng)基），1 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（1/2MS 固體培養(yǎng)基）。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過Mega 11.0 軟件利用Kimura2-parameter模型進(jìn)行系統(tǒng)分析。使用NJ（neighbour-joining)法[13-14]構(gòu)建系統(tǒng)樹，Bootstrap 設(shè)置為500。用分離率（isolation frequency，IF）來衡量特定植物組織樣品中內(nèi)生真菌的豐度以及植物組織樣品中多重侵染的頻率[14]；內(nèi)生真菌的多樣性通過香農(nóng)多樣性指數(shù)（H）表示，計(jì)算公式如下。

式中，i=1……k,k指滇西槽舌蘭的第k個(gè)生長(zhǎng)地，Pi指第i個(gè)生長(zhǎng)地滇西槽舌蘭內(nèi)生真菌個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌的分離

從滇西槽舌蘭根部分離得到94 個(gè)菌落，香格里拉、楚雄、呈貢、盤龍分別獲得22、12、8、52個(gè)（表1）。

表1 4個(gè)分布地/栽培地滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌分離結(jié)果Table 1 Isolation results of fungal isolates from roots of Holcoglossum rupestre in 4 localities

2.2 滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌的分子鑒定

分子鑒定結(jié)果（表2）顯示，從滇西槽舌蘭根部共鑒定內(nèi)生真菌68 株，其中盤龍居群最多，為29 株；香格里拉和楚雄居群次之，分別為18 和12株；呈貢居群最少，為9株。68株內(nèi)生真菌經(jīng)初步分子生物學(xué)鑒定歸屬于18個(gè)屬。 其中27.94%屬于鐮刀菌屬（Fusarium）；10.29%屬于間座殼屬（Diaporthe）；8.82%屬于膠膜菌屬（Tulasnella）；8.82%屬于角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium）；8.82%屬于交鏈孢屬（Alternaria）（表2）。鐮刀菌屬真菌在楚雄和呈貢居群的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌中均占50%以上，在香格里拉和盤龍居群中的占比也較高；膠膜菌屬真菌僅在盤龍居群分離得到，占比19.35%；角擔(dān)菌屬真菌僅在香格里拉居群分離得到，占比31.58%（圖1）。

圖1 不同地區(qū)滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌的相對(duì)豐度Fig. 1 Relative abundance of cultured endomycetes in root of Holcolglossum repestre from different regions

表2 不同地區(qū)滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌的種類及數(shù)量Table 2 Fungal taxon and amount in roots of Holcoglossum rupestre from different regions

香格里拉和盤龍居群可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的Shannon 多樣性指數(shù)較高，分別為2.93 和3.23，不同種群在不同屬間分布較均勻；楚雄和盤龍居群的Shannon 多樣性指數(shù)僅為1.38 和1.44，即分離的內(nèi)生真菌種類少且分布不均勻，僅分布在3個(gè)屬。

系統(tǒng)聚類分析（圖2）表明，68 株內(nèi)生真菌屬于2 門、3 綱、8 目、12 科（圖2）。其中有12 株內(nèi)生真菌屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）；有56 株內(nèi)生真菌屬于子囊菌門（Ascomycota）。在綱水平，分 別 屬 于 傘 菌 綱（Agaricomycetes）、座 囊 菌 綱（Dothideomycetes）和糞殼菌綱（Sordariomycetes）。屬于傘菌綱的12 個(gè)菌株中，菌株P(guān)2、P21 與美孢膠膜菌（Tulasnella calospora）序列的一致性較高，菌株P(guān)24、P35、P12、P49 與膠膜菌屬（Tulasnella）序列的一致性較高，因此將其鑒定為膠膜菌屬；菌株D4、D5、D6、D10、D13、D19 與 角 擔(dān) 菌 屬（Ceratobasidium）具有較高的相似性，因此將其鑒定為角擔(dān)菌屬真菌，這些菌株聚為1 支，屬于雞油菌目（Cantharellales）。

圖2 滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌的系統(tǒng)聚類樹Fig. 2 Phylogenetic tree of cultured endomycetes in root of Holcolglossum rupestre

在屬于糞殼菌綱的47 株內(nèi)生菌中，除毛殼菌屬（Chaetomium）的菌株P(guān)17、P19 外，其他45 株內(nèi)生菌被聚為4 個(gè)分支。其中，屬于鐮刀菌屬、木霉屬（Trichoderma）和生赤殼屬（Clonostachys）的23個(gè)菌株被聚為1 支（Ⅰ），屬于肉座菌目（Hypocreales）；屬于炭角菌屬、Obolarina、炭墊菌屬（Nemania）、Biscogniauxia、擬 盤 多 毛 孢 屬（Pestalotiopsis） 和 新 擬 盤 多 毛 孢 屬（Neopestalotiopsis）的13 個(gè)菌株被聚為1 支（Ⅱ），屬于炭角菌目（Xylariales）；菌株D2 單獨(dú)聚為1 支（Ⅲ），它屬于刺盤孢屬(Colletotrichum）、小叢殼目（Glomerellales）；屬于間座殼屬和擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）的8 個(gè)菌株被聚為1 支（Ⅳ），屬于間座殼目（Diaporthales）。

屬于座囊菌綱的9 個(gè)菌株被聚為2 個(gè)分支。其中，菌株D12 和P29 被聚為1 支（Ⅰ），屬于新殼梭孢屬；屬于交鏈孢屬（Alternaria）和旋孢腔菌屬（Cochliobolus）的7 個(gè)菌株及屬于糞殼菌綱毛殼菌屬的P17、P19被聚在1支（Ⅱ）。

2.3 疊鞘石斛種子共生萌發(fā)的效應(yīng)

膠膜菌P2 與疊鞘石斛種子的共生萌發(fā)試驗(yàn)顯示， P2 對(duì)疊鞘石斛種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，即共生菌P2能夠促進(jìn)疊鞘石斛種子萌發(fā)（圖3）。萌發(fā)60 d后，對(duì)照種子全部處于萌發(fā)第1階段（圖3C）；與膠膜菌P2 共生的疊鞘石斛種子已長(zhǎng)出生長(zhǎng)點(diǎn)（圖3D），處于典型附生蘭種子萌發(fā)的第3階段[15]；1/2MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)的疊鞘石斛部分原球莖也長(zhǎng)出生長(zhǎng)點(diǎn)，但仍有少量種子僅吸水膨大，處于萌發(fā)的第1 階段（圖3E）。與P2 共生菌共生萌發(fā)處理的種子86.16%處于種子萌發(fā)第2 階段，13.84%處于種子萌發(fā)第3階段；對(duì)照大部分種子萌發(fā)至第2階段（84.09%），仍有15.01%種子胚處于第1 階段（圖3F）。綜上所述，膠膜菌菌株P(guān)2對(duì)疊鞘石斛種子萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用。

圖3 膠膜菌菌株P(guān)2與疊鞘石斛種子的共生萌發(fā)Fig. 3 Myco-germination of Dendrobium denneanum with mycorrhiza fungus P2

3 討論

本研究在4 個(gè)生長(zhǎng)地的滇西槽舌蘭根內(nèi)均分離得到多種內(nèi)生真菌，且不同生長(zhǎng)地分離得到的內(nèi)生真菌存在差異，鐮刀菌屬、間座殼屬、膠膜菌屬、角擔(dān)菌屬、鏈格孢屬是占比較高的真菌類群；且不同分布地的內(nèi)生真菌在屬水平也存在差異。其中，角擔(dān)菌屬、刺盤孢屬、生赤殼屬和旋孢腔菌屬為香格里拉居群的特有菌屬；膠膜菌屬、擬盤多毛孢屬、新擬盤多毛孢屬、炭角菌屬、炭墊菌屬、毛殼菌屬、擬莖點(diǎn)霉屬、Obolarina為盤龍居群的特有菌屬；而楚雄和呈貢居群未檢測(cè)到特有菌屬。這可能與居群所在地（栽培地）的環(huán)境有關(guān)，同時(shí)與采樣的廣度和強(qiáng)度也有關(guān)[16]。

對(duì)滇西槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌進(jìn)行ITS rDNA序列測(cè)定，鑒定其親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在門水平分離菌株分別屬于擔(dān)子菌門和子囊菌門2 大類；在目水平屬于雞油菌目、肉座菌目、炭角菌目、糞殼菌目、葡萄座腔菌目、格孢腔菌目、Glomerellales、間座殼目8 個(gè)目，這幾個(gè)目也是熱帶、亞熱帶附生蘭常見的內(nèi)生真菌類群[11]；在屬水平，間座殼屬、角擔(dān)菌屬、Biscogniauxia、擬盤多毛孢屬、木霉屬、新擬盤多毛孢屬、炭角菌屬、新殼梭孢屬、旋孢腔菌屬、炭墊菌屬、毛殼菌屬、Obolarina等內(nèi)生菌屬，均為槽舌蘭屬植物首次報(bào)道的內(nèi)生真菌類群。其中，蘭科典型的共生真菌膠膜菌屬、角擔(dān)菌屬為首次在滇西槽舌蘭中分離得到，且角擔(dān)菌屬還是首次在槽舌蘭屬植物中分離得到。膠膜菌屬中的無性態(tài)瘤菌根菌屬（Epulorhiza）曾 在 短 距 槽 舌 蘭（Holcoglossum flavescens）、舌唇槽舌蘭（Holcoglossum subulifolium）、維西槽舌蘭（Holcoglossum weixiense）、中華槽舌蘭（Holcoglossum sinicum）中分離得到[9]。

Tan 等[9]在9 個(gè)槽舌蘭屬物種中分離得到16個(gè)屬的內(nèi)生真菌，其中赤殼屬（Cosmospora）、枝孢屬（Cladosporium）、擬隱孢殼屬（Cryptosporiopsis）、亞格孢殼屬（Didymella）、小球腔菌屬（Leptosphaeria）、蟻霉屬（Myrmecridium）、擬盾殼霉屬（Paraconiothyrium）、須殼孢屬（Pyrenochaeta）、Stephanonectria在本研究中未檢測(cè)到；而本研究分離得到的間座殼屬、角擔(dān)菌屬、擬盤多毛孢屬、木霉屬、新擬盤多毛孢屬、炭角菌屬、新殼梭孢屬、旋孢腔菌屬、炭墊菌屬、毛殼菌屬、Obolarina共12個(gè)屬的內(nèi)生真菌在Tan 等[9]的研究中未檢測(cè)到。說明槽舌蘭屬植物的內(nèi)生真菌具有較高的物種多樣性，且已分離得到的內(nèi)生真菌與宿主間的專一性較低。

研究表明，植物組織狀態(tài)、水分、碳氮營(yíng)養(yǎng)條件等均影響蘭科植物根際真菌多樣性[17-19]。本研究在香格里拉居群分離得到鐮孢菌屬、間座殼屬、角擔(dān)菌屬等共10個(gè)屬的菌株，而Tan等[9]于2011年在該地采集的滇西槽舌蘭中僅分離得到4 個(gè)菌屬。其中，僅鐮刀菌屬是2 個(gè)研究中都分離到的菌屬，且本研究中該居群分離得到較多前人未報(bào)道的菌株類群，包括蘭科典型的共生真菌角擔(dān)菌屬。這可能是因?yàn)樘m科植物內(nèi)生真菌的多樣性會(huì)隨生長(zhǎng)季節(jié)的變化而變化，從而滿足植株生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需求[20]。

Jacquemyn 等[21]認(rèn)為，親緣關(guān)系較近的蘭科物種中的共生真菌相似性較高，即蘭科植物與共生真菌間存在一定的專一性。附生蘭大多與膠膜菌科、角擔(dān)菌科、臘殼菌科等擔(dān)子菌門的真菌類群有較強(qiáng)的專一性[22-24]。在香格里拉的滇西槽舌蘭居群分離得到角擔(dān)菌屬、盤龍居群分離得到膠膜菌屬，這些是典型的蘭科共生真菌類群，而在Tan等[9]研究的滇西槽舌蘭中未分離到這類菌群。由此可見，滇西槽舌蘭內(nèi)可培養(yǎng)共生真菌在屬水平上具有較低的物種專一性，這可能是由于蘭科根部共生真菌對(duì)生境具有較高敏感性，進(jìn)一步表明光合自養(yǎng)型蘭科植物具有較低的內(nèi)生真菌專一性[21]。

膠膜菌是典型的蘭科植物共生真菌，它們可顯著促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[25-26]；分離自兜唇石斛（D. aphyllum）和硬葉蘭（Cymbidium mannii）的內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)齒瓣石斛（D. devonianum）的種子萌發(fā)及圓球莖形成[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，6 株膠膜菌中，有2 株（P2、P47）能夠顯著促進(jìn)疊鞘石斛種子萌發(fā)，縮短疊鞘石斛種子的萌發(fā)時(shí)間，增加種子萌發(fā)的一致性，與前人研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)檫@2 株共生菌能夠提供疊鞘石斛種子萌發(fā)過程所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。滇西槽舌蘭中分離的共生菌能夠促進(jìn)疊鞘石斛種子萌發(fā)，說明菌株P(guān)2 和P47 對(duì)宿主植物在種水平上不存在專一性，即宿主特異性較低，這在一定程度上支持Hadley[28]關(guān)于蘭科植物與共生菌不存在專一性的觀點(diǎn)。關(guān)于蘭科植物與共生真菌之間的互作關(guān)系，一直以來是蘭科植物的研究熱點(diǎn)和爭(zhēng)論焦點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，滇西槽舌蘭內(nèi)生真菌的多樣性較高，且內(nèi)生真菌的宿主植物具有廣泛性，由此表明，滇西槽舌蘭與內(nèi)生真菌間的共生關(guān)系存在廣泛性。