陸地棉GhNAC1基因的克隆及抗黃萎病功能分析

張曼， 張進(jìn)， 張新雨， 王國(guó)寧， 王省芬， 張艷

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000）

棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，不僅是紡織工業(yè)的關(guān)鍵原料，還是我國(guó)近億棉農(nóng)的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。黃萎?。╒erticillium wilt）是一種土傳真菌維管束病害，主要由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、黑白輪枝菌（Verticillium albo-atrum）侵染所致[1]。大麗輪枝菌依靠其微菌核結(jié)構(gòu)可在土壤中存活數(shù)年，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)多種作物產(chǎn)生嚴(yán)重維管束病害，引起植物葉片黃化、失水萎蔫甚至整株死亡的癥狀[2-3]。黃萎病自1935 年由美國(guó)傳入我國(guó)后，在黃河流域、長(zhǎng)江流域和西北內(nèi)陸三大棉區(qū)不斷發(fā)展，每年造成的棉花產(chǎn)量損失約占世界皮棉總產(chǎn)量的10%~30%[4]。20 世紀(jì)90 年代后，該病在全國(guó)范圍內(nèi)大暴發(fā)，年發(fā)生面積約300 萬(wàn)hm2，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)12億元[5]。利用基因工程手段進(jìn)行抗病防治是最為經(jīng)濟(jì)有效的措施，然而受限于栽培陸地棉遺傳基礎(chǔ)和抗源狹窄，生產(chǎn)上推廣的棉花品種很少能夠達(dá)到抗病水平。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silence，VIGS）是RNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS），據(jù)此發(fā)展出了適用于多種植物的VIGS 技術(shù)。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，VIGS 技術(shù)具有操作更加簡(jiǎn)便、周期更短、效果明顯、適合高通量等優(yōu)點(diǎn)，在植物功能基因組學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的潛力。Gao 等[6]基于煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）載體體系，構(gòu)建了適用范圍更廣、沉默效果更好的植物VIGS技術(shù)系統(tǒng)?；赥RV 載體體系的VIGS技術(shù)成功應(yīng)用于棉花，使一些重要的棉花黃萎病抗性基因獲得很好的功能分析，如GbRvd[7]、GhLAC15[8]、GhGPA[9]、GhnsLTP[10]等。雖然VIGS 技術(shù)難以保持長(zhǎng)久穩(wěn)定的沉默效果[11]，但是考慮到棉花苗期黃萎病抗性鑒定可以在沉默的幼苗接菌后25~30 d完成，在此過(guò)程中，VIGS 完全可以保證穩(wěn)定的沉默效果，因此利用VIGS 技術(shù)可以高效、快速地鑒定棉花抗黃萎病相關(guān)基因功能。

NAC（no apical meristem）轉(zhuǎn)錄因子是一種含有NAM/ATAF/CUC 保守結(jié)構(gòu)域的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子。NAC 轉(zhuǎn)錄因子于1997 年首次在矮牽牛中被報(bào)道，擬南芥ATAF1/2和CUC2基因編碼蛋白的N 端[12]。研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而且也參與病原菌防御相關(guān)的次生壁形成、乙烯產(chǎn)生等過(guò)程[13-15]。如煙草NbNAC062屬于NAC 類膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，被PVY（potato virus Y, PVY）侵染后其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并可能通過(guò)調(diào)控UPR（unfolded protein response,UPR）相關(guān)基因BiP的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制PVY 的早期侵染[16]。接種橡膠樹白粉菌后，擬南芥NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子ATAF2 上調(diào)，并與EDS1 發(fā)生互作進(jìn)而正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)白粉菌的抗病性[17]。辣椒CaNAC1能夠快速對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、辣椒輕斑駁病毒的侵染和外源激素作出響應(yīng)，表達(dá)量上調(diào)并激活抗病反應(yīng)[18]。

本課題組培育的抗病高產(chǎn)品種農(nóng)大601（ND601）2006年通過(guò)河北省品種委員會(huì)審定，多年多點(diǎn)田間病圃與培養(yǎng)室抗病性鑒定結(jié)果均顯示，該品種黃萎病抗性穩(wěn)定且達(dá)到抗病級(jí)別，能夠?qū)⒖共∨c高產(chǎn)性狀有效協(xié)調(diào)，保證其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。因此，以農(nóng)大601 為材料，深入挖掘其含有的黃萎病抗性基因?qū)τ诿藁共∮N及解析抗病與產(chǎn)量之間的協(xié)調(diào)關(guān)系意義重大。本課題組前期從黃萎病菌脅迫處理后的抗病陸地棉農(nóng)大601 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)GhNAC1對(duì)大麗輪枝菌的侵染響應(yīng)快速，推測(cè)其可能在早期防御反應(yīng)中發(fā)揮作用?；诖?，本研究從農(nóng)大601 中克隆GhNAC1，利用生物信息學(xué)等手段分析該基因的特征，利用實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）明確GhNAC1在黃萎病菌處理后的表達(dá)模式，應(yīng)用VIGS技術(shù)研究該基因的抗病功能，為進(jìn)一步探索GhNAC1的抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉抗黃萎病品種農(nóng)大601 用于克隆GhNAC1，農(nóng)大棉8 號(hào)因具有較高的沉默效果而用于VIGS試驗(yàn)，6個(gè)抗病品種（湯棉7401、慈棉9號(hào)、蘇遠(yuǎn)04-3、魯890）和6 個(gè)感病品種（奎屯系353、73-782、仁洞67-86、73-184、湖南麻陽(yáng)洋棉花）用于分析不同種基因表達(dá)差異，均由本課題組提供。利用濃硫酸對(duì)棉花種子進(jìn)行脫絨處理，清水中浸泡種子過(guò)夜，待種子露白后在濕潤(rùn)的毛巾上催芽，挑選發(fā)芽一致（約0.5 cm）的種子播種于裝有蛭石的六棱缽中，于光照培養(yǎng)室中生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件為16 h 光照、8 h 黑暗，光強(qiáng)6 000～6 500 lx，晝溫28 ℃、夜溫22 ℃，相對(duì)濕度40%～50%。

供試大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）為生產(chǎn)上強(qiáng)致病力菌系臨西2-1[19]，由本課題組分離鑒定，并繼代保存于PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基。

1.2 基因克隆

棉苗根組織用液氮研磨，使用EASYspi 植物RNA 快 速 提 取 試 劑 盒（AidLab，北 京）和EasyPure?植物DNA提取試劑盒（TransGen，北京）分別提取總RNA 和DNA，應(yīng)用PrimeScript? ⅡcDNA 合成試劑盒（Takara，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)Cotton FGD database（https://cottonfgd.org/）中陸地棉TM-1 的同源序列設(shè)計(jì)引物（表1），并在農(nóng)大601 中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系20 μL：1 μL DNA/cDNA 模板（< 100 ng），正反向引物（表1）各1 μL（10 μmol·L-1），10 μL 10 ×Ex TaqBuffer（Takara，大連）和7 μL 滅菌雙蒸水。PCR 程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，膠回收后克隆到pMD?18-T 載體（Takara，大連），轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 后經(jīng)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，送金為智公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers used in this experiment

1.3 生物信息學(xué)分析

利用Cotton FGD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cottonfgd.org/）進(jìn)行Blast 比對(duì)，同時(shí)在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中分析目的基因編碼蛋白的功能域。通過(guò)在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)蛋白氨基酸組成（amino acid composition）、分子量（molecular weight）、理論等電點(diǎn)（theoretical pI）、不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）、脂肪指數(shù)（aliphatic index）和總平均親水性（grand average of hydropathicity）等，利用在線軟件SignalP 4.0（http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP）預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；利用TMpred 在線工具（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）分析蛋白跨膜域；利用在線工具CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用NovoPro（https://www.novopro.cn/tools/）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 亞細(xì)胞定位

利用Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物NAC1-G-F/R（表1），以抗病品種農(nóng)大601 的cDNA 為模板，克隆基因并使用賽默飛世爾Gateway? BP Clonase?Ⅱ Enzyme mix 試劑盒連接到pDONR207 入門載體，測(cè)序正確后，使用賽默飛世爾Gateway? LR Clonase? Ⅱ Enzyme mix 試劑盒，連接到pMDC43（含GFP）用于亞細(xì)胞定位。將構(gòu)建好的亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，將單克隆搖勻后加入到50 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖 床150 r·min-1振 蕩 培 養(yǎng) 至OD600為0.8～1.2。菌液以5 000 r·min-1離心10 min，棄上清并用無(wú)菌水重懸后混勻，離心10 min，參照Sparkes等[20]方法配置緩沖液重懸菌液，將沉淀用緩沖液進(jìn)行重懸，靜止15 min 后備用。使用1 mL 注射器在5～6 周的本氏煙草葉片下表皮上進(jìn)行注射，23 ℃過(guò)夜避光培養(yǎng)，采用激光共聚焦顯微鏡（Fluo View FV1000, Olympus）觀察熒光信號(hào)，GFP 激發(fā)光和發(fā)射光分別為488和550 nm。

1.5 黃萎病菌脅迫處理

將大麗輪枝菌LX2-1 接種到PDA 固體培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，然后將菌塊接種到PDB（potato dextrose broth）液體培養(yǎng)基[21]中，于25 ℃、150 r·min-1搖床中培養(yǎng)5～7 d。培養(yǎng)好的懸浮孢子液用雙層紗布過(guò)濾后，再用滅菌蒸餾水將懸浮孢子液濃度調(diào)至1 × 107cfu·mL-1，備用。采用底部注射菌液定量接種法[22]接菌，每缽接種8 mL 菌液，接菌后的棉苗置于晝溫25 ℃、夜溫22 ℃，相對(duì)濕度65%～70%，光照不變的條件下繼續(xù)培養(yǎng)[23]，其間定期澆灌Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液[24]以補(bǔ)充養(yǎng)分。分別在接菌后6、12、24、36 和48 h 取棉苗根組織，保存在-80 ℃?zhèn)溆?。每個(gè)樣本取3 棵整齊一致的棉苗混樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以蒸餾水代替孢子懸浮液處理的棉苗作為對(duì)陰性照組。

1.6 RT-PCR

采用液氮研磨和EASYspi 植物RNA 快速提取試劑盒提取棉苗RNA。通過(guò)瓊脂糖電泳和NanoDrop2 000 超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific）對(duì)RNA 的質(zhì)量和含量進(jìn)行檢測(cè)。利用PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）并參照說(shuō)明書完成cDNA 的合成，并用于RT-PCR。RT-PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：1 μL cDNA 模板（< 100 ng），10 μL SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa），正、反向引物（表1）各0.8 μL（10 μmol·L-1），7.4 μL 滅菌雙蒸水。反應(yīng)在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）中 進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃ 15 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。以陸地棉UBQ14（Ghir_D1 0G001850）作為內(nèi)參，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法[25]進(jìn)行相對(duì)定量分析，并利用GraphPad Prism?6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

1.7 病級(jí)統(tǒng)計(jì)

接種后25 d，采用5級(jí)分類法[20]對(duì)棉苗進(jìn)行病級(jí)統(tǒng)計(jì)：0級(jí)，植株無(wú)病癥；1級(jí)，子葉發(fā)病，真葉無(wú)病癥；2 級(jí)，子葉以上的第一片真葉發(fā)病；3 級(jí)，兩片及以上真葉發(fā)病，新葉無(wú)病癥；4 級(jí)，植株生長(zhǎng)點(diǎn)或整株枯死。病情指數(shù)（disease index, DI）的計(jì)算公式[26]如下。

1.8 棉花VIGS試驗(yàn)

設(shè)計(jì)引物NAC1-V-F/R（表1），在GhNAC1序列兩端引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和KpnⅠ，以含有GhNAC1ORF 的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆至pMD?18-T 載體，再經(jīng)雙酶切，將回收目的片段克隆至VIGS 載體（pTRV2）。采用凍融法將pTRV2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞[27]。參照Gao 等[28]的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，GhNAC1沉默效果通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，方法同1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhNAC1的克隆與生物信息學(xué)分析

從黃萎病菌脅迫處理后的陸地棉農(nóng)大601 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選到與棉花抗黃萎病相關(guān)的基因Ghir_A01G000170（GhM_A01G0037），該基因含有NAM 結(jié)構(gòu)域，命名為GhNAC1。根據(jù)陸地棉TM-1 基因組中GhNAC1的序列信息，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得約800 bp 的目的片段。經(jīng)測(cè)序，獲得GhNAC1的ORF 全長(zhǎng)序列840 bp，該基因編碼279 個(gè)氨基酸殘基。在NCBI 上BLAST 結(jié)果顯示，GhNAC1屬于NAM 超級(jí)家族，NAM 結(jié)構(gòu)域在10～130 aa位置。

GhNAC1蛋白分子量32.4 kD，理論等電點(diǎn)pI為8.91，包括4 542 個(gè)原子，分子式C1456H2264N388O421S13。在組成GhNAC1 蛋白的20 種氨基酸中，賴氨酸（Lys）所占比例最高（9.3%），而半胱氨酸（Cys）所占的比例最低（1.1%）。GhNAC1 的不穩(wěn)定指數(shù)47.78，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)72.33；總平均親水性-0.592。GhNAC1 沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)（圖1A 和B），亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GhNAC1定位在細(xì)胞核。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，GhNAC1含有10個(gè)α螺旋和10個(gè)β折疊（圖1C）。

2.2 GhNAC1的亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GhNAC1定位于細(xì)胞核。為進(jìn)一步確定GhNAC1 在細(xì)胞中的位置，將其與GFP 蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。在CaMV 35S 啟動(dòng)子的控制下，構(gòu)建了GhNAC1 與GFP 的融合蛋白，并在煙草表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。GhNAC1-GFP 融合蛋白侵染煙草表皮后，熒光成像顯示定位在細(xì)胞核上(圖2)，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖2 GhNAC1亞細(xì)胞定位Fig. 2 Subcellular localization of GhNAC1

圖2 GhNAC1蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Structure analysis of GhNAC1 protein

2.3 GhNAC1的表達(dá)模式分析

在四葉期取棉苗不同組織進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示GhNAC1在葉中的表達(dá)顯著高于根和莖（圖3A）。對(duì)于抗黃萎病品種ND601，在檢測(cè)的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，GhNAC1的表達(dá)在6、12 和24 phi（hours post infection）均顯著上調(diào)（圖3B）。GhNAC1在6 個(gè)抗病和6 個(gè)感病品種的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，GhNAC1在抗病品種的表達(dá)水平顯著高于感病品種（圖3C），進(jìn)一步證明GhNAC1參與了棉花對(duì)黃萎病的抗病反應(yīng)，且可能是參與棉花抗病反應(yīng)的正調(diào)控因子。

圖3 GhNAC1的表達(dá)模式Fig. 3 Expression pattern of GhNAC1

2.4 GhNAC1正調(diào)控棉花黃萎病抗性

利用VIGS 處理農(nóng)大棉8 號(hào)7 d 后，沉默CLA1基因的棉苗呈現(xiàn)出新生真葉白化現(xiàn)象（圖4A），表明本研究成功建立了VIGS技術(shù)體系。此時(shí)，通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)GhNAC1的沉默效果，如圖4B 所示，與對(duì)照（CK）棉苗相比，GhNAC1基因在沉默棉苗中的表達(dá)量顯著下調(diào)，表明棉花內(nèi)源GhNAC1得到有效沉默，這些沉默植株繼續(xù)用于抗黃萎病功能分析。沉默植株與對(duì)照植株分別接種臨西2-1，接菌20 d 后發(fā)現(xiàn)GhNAC1沉默植株較對(duì)照呈現(xiàn)出更加嚴(yán)重的葉片黃化、萎蔫等典型的黃萎病癥狀（圖4C）。病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，沉默植株病指為44.1（感?。?，顯著高于對(duì)照植株27.9（耐?。▓D4D）。植株莖桿縱切觀察顯示，沉默植株的維管束褐化程度較對(duì)照植株更嚴(yán)重（圖4E）。由此可見，抑制GhNAC1基因的表達(dá)可顯著降低棉花對(duì)黃萎病的抗性，表明GhNAC1正調(diào)控棉花抗黃萎病反應(yīng)。

圖4 沉默GhNAC1降低了棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性Fig. 4 Silencing GhNAC1 reduced the resistance to V. dahliae in cotton

2.5 沉默GhNAC1 后降低了水楊酸通路相關(guān)基因表達(dá)

水楊酸（salicylic acid，SA）能夠誘導(dǎo)植物被病原菌侵染后相關(guān)蛋白的合成，從而提高植物的抗病性，SA 相關(guān)信號(hào)途徑被認(rèn)為是參與生物脅迫的重要抗病路徑[29]。對(duì)GhNAC1沉默植株中SA 通路相關(guān)的基因進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沉默植株中SA通路主要標(biāo)志基因（PAD4、NDR1、NPR1、和PR1）的表達(dá)水平顯著下降(圖5)，推測(cè)GhNAC1 通過(guò)激活SA 信號(hào)通路增強(qiáng)棉花黃萎病抗性。

圖5 GhNAC1沉默棉花接菌后水楊酸途徑基因表達(dá)分析Fig. 5 Analysis of gene expression of salicylic acid pathway in GhNAC1 silenced cotton after inoculation

3 討論

黃萎病是土傳真菌病害，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，降低作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。黃萎病每年對(duì)棉花造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失與品質(zhì)下降[4]。培育抗病品種是防治黃萎病最有效的途徑，挖掘黃萎病抗性基因，闡明基因的抗病功能一直是棉花抗病育種的重要研究?jī)?nèi)容。近年來(lái)研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和形態(tài)發(fā)生等多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并廣泛參與不同植物激素、多種非生物和生物脅迫響應(yīng)的信號(hào)通路[30]。在模式植物和大田作物中，均有報(bào)道NAC基因響應(yīng)病原菌的感染而誘導(dǎo)表達(dá)[31]。本研究在黃萎病菌脅迫處理的cDNA 文庫(kù)中鑒定了GhNAC1基因，該基因定位在細(xì)胞核，能夠在根部快速響應(yīng)黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)量顯著升高，并在抗病品種的表達(dá)水平顯著高于感病品種，表明GhNAC1基因參與了棉花對(duì)黃萎病的抗性，為棉花抗性育種提供新的候選基因。過(guò)表達(dá)或沉默NAC基因?qū)е轮仓陮?duì)病原菌的抗性增強(qiáng)或減弱[32-33]，表明NAC 轉(zhuǎn)錄因子可以正向或負(fù)向地調(diào)節(jié)植物的抗病/防御反應(yīng)。OsNAC6是參與水稻抗病的NAC 轉(zhuǎn)錄因子，過(guò)表達(dá)OsNAC6的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻瘟病、缺水和高鹽脅迫的耐受性都有提高[34]。在水稻中過(guò)表達(dá)OsNAC111、OsNAC58和OsONAC066可以提高水稻對(duì)稻瘟病的抗性[19,35]；在小麥中，沉默TaNAC2可在條銹菌（Puccinia striiformis f.sp.Tritici,Pst）與小麥互作早期顯著增加H2O2的合成，降低菌絲生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)植株對(duì)條銹病的抗性[36]；沉默番茄SlSRN1（solanum lycopersicum stress-related NAC1）降低了番茄對(duì)灰葡萄球菌（Botrytis cinerea）的抗性，表明SlSRN1是番茄對(duì)灰葡萄球菌防御反應(yīng)的正調(diào)控因子[37]。馬鈴薯中的StNACb4被證明能夠增強(qiáng)對(duì)青枯病的抗性[38]。上述研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子參與了植株對(duì)多種病原菌的抗病反應(yīng)。本研究對(duì)陸地棉GhNAC1基因進(jìn)行沉默后發(fā)現(xiàn)，相較于TRV∶00植株，TRV∶GhNAC1沉默植株葉片褪綠更明顯，整體表現(xiàn)為萎蔫，大多數(shù)沉默植株表現(xiàn)出較高的病害等級(jí)（2、3、4），莖稈被真菌侵染力度更大。因此，沉默GhNAC1顯著降低了棉花對(duì)黃萎病的抗性，表明GhNAC1正向調(diào)控棉花黃萎病抗性，進(jìn)一步擴(kuò)充了NAC 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)的內(nèi)容。

SA 是重要的信號(hào)分子，在許多植物病原體相互作用中激活防御反應(yīng)，特別是針對(duì)生物營(yíng)養(yǎng)體和半生物營(yíng)養(yǎng)體[39-40]。SA的生物合成途徑有2種，分別是異分支酸途徑（isochorismate synthase，ICS）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）途徑，它們都是從分支酸鹽開始的[41]，SA合成主要通過(guò)ICS途徑，發(fā)生在葉綠體中，約占SA合成的90%[42]。此外，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）試驗(yàn)表明，在ICS1和SAGT1啟動(dòng)子中均含有NAC 核心結(jié)合位點(diǎn)，且被ANAC019沉淀富集。 因此，ANAC019、ANAC055、ANAC072可能分別通過(guò)抑制ICS1和誘導(dǎo)SAGT降低擬南芥SA 的合成，增強(qiáng)SA的代謝，成為SA 積累的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[43]。本研究對(duì)沉默植株SA 信號(hào)通路相關(guān)基因（PAD4、NDR1、NPR1和PR1）的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诔聊仓曛忻黠@受到抑制，表明GhNAC1參與了SA 介導(dǎo)的抗病信號(hào)通路。上述結(jié)果為深入研究GhNAC1的抗病機(jī)制及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

本研究克隆了GhNAC1，并驗(yàn)證了其在黃萎病抗性中的作用。GhNAC1是棉花黃萎病抗性的正調(diào)控基因，可能通過(guò)參與SA信號(hào)途徑增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病抗性，為棉花抗病育種提供新的候選基因。