胸腔積液lncRNA BLACAT1及l(fā)ncRNA CASC9水平對(duì)肺腺癌的診斷價(jià)值*

邢貞泉,趙光強(qiáng),李柳霞

三亞市人民醫(yī)院/四川大學(xué)華西三亞醫(yī)院呼吸內(nèi)科,海南三亞 572000

肺癌是發(fā)病率、死亡率均較高的惡性腫瘤,大部分患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期,5年總生存率低于10%[1],提高早期診斷率和及時(shí)干預(yù)是改善肺癌患者預(yù)后的重要內(nèi)容。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型,其中約50%為肺腺癌,目前臨床主要采用病理活檢或影像學(xué)手段進(jìn)行早期診斷,但均存在一定局限性[2]。相關(guān)報(bào)道顯示,肺癌是引發(fā)胸腔積液的主要因素,而隨著無創(chuàng)分子診斷技術(shù)的發(fā)展,為胸腔積液中腫瘤特異性分子標(biāo)志物來診斷惡性腫瘤提供了更多選擇[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)但參與腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控的RNA,能進(jìn)入胸腔積液、血液等體液中穩(wěn)定表達(dá),目前已經(jīng)在肺癌診斷及預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮作用。lncRNA膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(BLACAT1)、lncRNA癌癥易感性候選物9(lncRNA CASC9)均已發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中高表達(dá),但關(guān)于其在肺腺癌胸腔積液中表達(dá)的相關(guān)研究較少[4-5]。本研究通過檢測(cè)肺腺癌患者胸腔積液中l(wèi)ncRNA BLACAT1及l(fā)ncRNA CASC9表達(dá),分析其對(duì)肺腺癌的鑒別診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月本院收治的96例肺腺癌合并胸腔積液患者作為肺腺癌組,其中男50例,女46例;年齡36～78歲,平均(58.72±10.36)歲;臨床分期:Ⅰa期9例,Ⅰb期14例,Ⅱa期28例,Ⅱb期21例,Ⅲa期18例,Ⅲb期6例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷為原發(fā)性肺腺癌[6],且影像學(xué)診斷存在胸腔積液;(2)標(biāo)本采集前未進(jìn)行放化療、免疫治療等。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在胸腔引流禁忌證者;(2)合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、心腦血管疾病者;(3)存在其他惡性腫瘤;(4)患者病例資料不全、不配合進(jìn)行檢查或主動(dòng)退出者。另選取該院同期收治的82例肺部感染合并胸腔積液患者為對(duì)照組,其中男43例,女39例;年齡34～80歲,平均(59.19±9.38)歲;肺結(jié)核53例,肺炎29例。兩組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過,所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2胸腔積液采集方法 兩組患者均采用胸腔引流術(shù)干預(yù)并提取胸腔積液標(biāo)本20 mL,1 060 r/min離心5 min后取沉淀;在沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液吹打,并于室溫放置5 min,隨后以520 r/min離心5 min后取沉淀;在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打洗滌,并以1 060 r/min離心5 min,可根據(jù)血紅素含量重復(fù)該步驟,最后獲得的沉淀采用Trizol試劑吹打,并在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)胸腔積液lncRNA BLACAT1及l(fā)ncRNA CASC9表達(dá)水平 將凍存的標(biāo)本室溫放置解凍,取其中500 μL沉淀加入100 μL 氯仿(CHCl3)溶液混勻后放置5 min,隨后以12 000 r/min離心10 min,取白色沉淀并加入75%乙醇清洗,隨后采用7 970 r/min離心5 min后棄去上清液,沉淀在室溫下干燥至無色透明,隨后將其溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)中,測(cè)定提取的總RNA的純度。根據(jù)相關(guān)引物序列逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并以此作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火60 ℃ 5 s,延伸60 ℃ 5 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)3次,lncRNA BLACAT1及l(fā)ncRNA CASC9相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示,內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。引物序列:lncRNA BLACAT1上游引物為5′-GGAGATGTGCTGGTGGTGGAATG-3′,下游引物為5′-GTTATGGAGGAGGCTGGGAGAGAG-3′;lncRNA CASC9上游引物為5′-GGCTGGAGAGTCATTGGCACTATC-3′,下游引物為5′-GCTTCCATTGCTTTGCTGCTGTC-3′;GAPDH上游引物為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游引物為5′-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′。

2 結(jié) 果

2.1肺腺癌組和對(duì)照組胸腔積液lncRNA BLACAT1及l(fā)ncRNA CASC9表達(dá)水平比較 肺腺癌組胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9 比較

2.2不同臨床病理肺腺癌患者胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9表達(dá)水平比較 以lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9在96例肺腺癌患者中相對(duì)表達(dá)水平的平均值(分別為1.72、6.63)為臨界值,將患者分為高、低表達(dá)兩組,其中l(wèi)ncRNA BLACAT1表達(dá)與肺腺癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P<0.05),lncRNA CASC9表達(dá)與患者臨床分期、分化程度有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征肺腺癌組患者胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9表達(dá)比較(n)

2.3胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯(lián)合診斷肺腺癌模型 采用Logistic回歸模型建立胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯(lián)合鑒別診斷肺腺癌模型:Logit(P)=1.933×lncRNA BLACAT1+0.448×lncRNA CASC9-3.987。見表3。

表3 胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯(lián)合診斷肺腺癌模型

2.4lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9對(duì)肺腺癌的診斷價(jià)值 建立ROC曲線,分析結(jié)果顯示胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9診斷肺腺癌的曲線下面積(AUC)分別為0.782、0.789,二者聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.878,高于單項(xiàng)指標(biāo)診斷。見表4。

表4 胸腔積液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9對(duì)肺腺癌的診斷價(jià)值

3 討 論

肺癌是目前發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤之一,早期無特異性臨床癥狀,病理活檢是其診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但部分患者接受度不高[7-8]。胸腔積液是肺腺癌常見并發(fā)癥,標(biāo)本獲取更為簡(jiǎn)單,且對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)也是臨床診斷的重要依據(jù)[9]。近年來,隨著臨床檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)展,胸腔積液中腫瘤標(biāo)志物表達(dá)情況檢測(cè)為惡性腫瘤診斷提供了新的途徑。

lncRNA表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后不良有關(guān),lncRNA BLACAT1是一種定位在染色體1q32.1上的具有促癌作用的lncRNA,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌、宮頸癌、膀胱癌等惡性腫瘤患者血清及癌組織中表達(dá)上調(diào),且血清lncRNA BLACAT1表達(dá)對(duì)大多數(shù)腫瘤的診斷效能更高[10-12]。目前關(guān)于lncRNA BLACAT1在NSCLC患者中表達(dá)的研究主要集中在癌組織及體外實(shí)驗(yàn)中。有研究發(fā)現(xiàn),NSCLC患者組織中l(wèi)ncRNA BLACAT1表達(dá)高于健康人,且lncRNA BLACAT1高表達(dá)患者總生存期明顯短于低表達(dá)患者[13];相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,lncRNA BLACAT1高表達(dá)能促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。本研究檢測(cè)了肺腺癌患者及肺部良性病變患者胸腔積液lncRNA BLACAT1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌組胸腔積液lncRNA BLACAT1相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,且與肺腺癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān),證實(shí)了lncRNA BLACAT1在肺腺癌患者中表達(dá)上調(diào),這可能來自胸膜上轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生lncRNA BLACAT1并將其釋放到胸腔積液中[15]。有研究發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA BLACAT1基因表達(dá)能通過上調(diào)miR-374b-5p來抑制肺腺癌細(xì)胞A549的增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達(dá)[16];還有研究顯示,下調(diào)lncRNA BLACAT1在耐藥NSCLC細(xì)胞中表達(dá)后能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)阿法替尼耐藥性[17]。以上研究均證實(shí),lncRNA BLACAT1與肺腺癌發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。本研究中,ROC曲線分析結(jié)果顯示,lncRNA BLACAT1診斷肺腺癌的AUC為0.782,提示其在肺腺癌診斷中具有一定的臨床價(jià)值。

lncRNA CASC9也是一種常見的促癌lncRNA,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在NSCLC組織及細(xì)胞中高表達(dá),且其在癌組織中表達(dá)水平與患者生存期有關(guān)[18]。有研究顯示,lncRNA CASC9能通過調(diào)控miR-195-5p/CDK6信號(hào)來參與肺鱗癌進(jìn)展[19]。有研究發(fā)現(xiàn),lncRNA CASC9能通過調(diào)控miR-335-3p/miR-195-5信號(hào)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[20]。本研究結(jié)果顯示,lncRNA CASC9在肺腺癌患者胸腔積液中表達(dá)上調(diào),且與患者臨床分期、分化程度有關(guān),提示lncRNA CASC9在胸腔積液中的表達(dá)水平可在一定程度上反映肺腺癌的發(fā)生及進(jìn)展。有學(xué)者通過檢測(cè)胸腔積液中l(wèi)ncRNA CASC9表達(dá)發(fā)現(xiàn)其診斷胸腔積液良惡性的AUC為0.794。本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),lncRNA CASC9診斷肺腺癌的AUC為0.789,而lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯(lián)合診斷肺腺癌的AUC為0.878,高于單項(xiàng)指標(biāo)診斷,提示lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9聯(lián)合應(yīng)用對(duì)診斷肺腺癌具有較高的臨床價(jià)值。

綜上所述,lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9在肺腺癌患者胸腔積液表達(dá)均上調(diào),且與肺腺癌患者臨床病理有關(guān),二者聯(lián)合對(duì)肺腺癌具有較好的臨床診斷價(jià)值。但本研究尚有不足之處,一是樣本量較少,二是與肺腺癌關(guān)系相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不明確,后續(xù)將擴(kuò)大樣本量,并對(duì)相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。