自動化封閉式CAR-T細胞制備系統(tǒng)研發(fā)與實驗

李衍珂, 李 祥

(上海交通大學 機械系統(tǒng)與振動國家重點實驗室,上海 200240, E-mail: 1302449799@qq.com)

惡性腫瘤嚴重威脅人類的健康和生命,是人類致死疾病的最大病因[1]。嵌合抗原受體T細胞免疫(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)療法被認為是治療癌癥最具潛力的治療方法之一[2],該療法的成功實施需要在體外環(huán)境下制備、擴增CAR-T細胞。盡管具有積極的臨床結果,但CAR-T細胞制備成本高昂,超過25萬美元[3],而且制備工藝涉及開放的人工手動操作流程[4],會帶來極大的污染風險和批次質量差異等問題,因此,全封閉、自動化、可溯源的CAR-T細胞制備系統(tǒng)的研發(fā)迫在眉睫。

目前,歐美國家已開發(fā)出多款CAR-T細胞自動化制備系統(tǒng)。其中,德國Miltenyi公司的CliniMACS ProdigyTM是迄今為止市面上最符合CAR-T細胞全自動制備準則的自動化、集成化的CAR-T制備與監(jiān)測系統(tǒng),它將CAR-T細胞制備過程中所需的全部制備裝置、監(jiān)測系統(tǒng)、動力系統(tǒng)、液體儲存系統(tǒng)、人機接口都集成在一個細胞制備平臺上[5],極大降低了成本、簡化了流程,但是該設備售價昂貴,高達數(shù)百萬元,這無疑極大提高了細胞治療的門檻,不利于CAR-T療法的普及。 國內市場上尚未出現(xiàn)商業(yè)化的CAR-T細胞自動化制備系統(tǒng),東南大學的肖忠黨教授團隊開展了CAR-T 細胞自動化制備系統(tǒng)的設計和軟硬件研發(fā)工作,但是該系統(tǒng)缺乏對溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)濃度的監(jiān)測與控制,并且對培養(yǎng)環(huán)境中溫度、CO2濃度的監(jiān)測控制是使用商品化的獨立模塊,沒有實現(xiàn)系統(tǒng)集成[6]。

根據(jù)CAR-T細胞制備工藝流程,開發(fā)一套符合GMP管理規(guī)范的全封閉自動化CAR-T細胞制備與監(jiān)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)的管路部分包括一次性反應器、密閉管路和一次性醫(yī)用試劑袋,采用無菌接合方式,管路通過0.22 μm過濾器與大氣相通,實現(xiàn)系統(tǒng)整體的全封閉;機電控制部分由程序控制夾管閥的時序開斷和蠕動泵的精確旋轉,實現(xiàn)免疫磁珠、培養(yǎng)液、病毒、蛋白等物料的自動定量添加,程序控制舵機驅動條形磁鐵轉位機構,實現(xiàn)對T細胞的吸附分選;培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控部分由下位機在線采集溫度、pH、CO2濃度、DO濃度傳感器數(shù)據(jù)并實時調控在最適范圍內。

1 系統(tǒng)設計

1.1 系統(tǒng)原理與CAR-T細胞制備流程

CAR-T細胞的制備流程包括采集患者的外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)懸液、免疫磁珠分選、激活、轉導、擴增CAR-T細胞、收集CAR-T細胞并回輸?shù)交颊唧w內[7],整個流程要在符合GMP管理規(guī)范的環(huán)境下進行,并要嚴格做好不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)之間的高效、無菌銜接。

系統(tǒng)原理圖如圖1(a)所示,系統(tǒng)外接PBMC懸液、培養(yǎng)液、生理鹽水、蛋白、磁珠、病毒載體等物質的一次性醫(yī)用儲液袋,以及CAR-T細胞產(chǎn)品收集袋和廢液收集袋。管道、儲液袋和反應器均做到全封閉、一次性,通過0.22 μm過濾器與外界相通,既保證了整個管道系統(tǒng)的氣壓平衡,又防止了外界的污染源進入管道系統(tǒng);根據(jù)初始細胞量和不同階段的增殖量,反應器結構設計為階梯式,內部有各傳感器的固定位置和混合氣體接入口;系統(tǒng)使用夾管閥控制各個位置管路的開合,使用蠕動泵驅動液體在管路內流動,使用步進電機柔和振蕩反應器使得細胞可以充分接觸氧氣和養(yǎng)分,且利于細胞間的通訊[8],磁鐵轉位機構使用舵機驅動條形磁鐵旋轉實現(xiàn)T細胞分選;細胞培養(yǎng)環(huán)境監(jiān)控模塊由溫度、pH、CO2濃度、DO濃度傳感器和加熱膜、流量計構成,傳感器通過數(shù)字口、模擬口和串口與下位機連接,實現(xiàn)實時數(shù)據(jù)采集與反饋,配合控制程序調控培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)穩(wěn)定在最適范圍內。

圖1 系統(tǒng)圖

首先將一次性管路、生物反應器等接入系統(tǒng)設定位置;利用條碼槍掃描患者PBMC儲液袋的條形碼,系統(tǒng)自動讀取患者信息;然后,系統(tǒng)按照預設程序開始CAR-T細胞的自動化制備,自動化制備流程如下:泵入患者PBMC至反應器,將CD3/28免疫分選磁珠泵入反應器并柔和振蕩,促使免疫磁珠與T細胞的充分結合,磁鐵轉位機構轉入反應器底部,充分吸附固定磁珠,排出廢液,完成對T細胞的分選;泵入15 mL細胞培養(yǎng)液,自動加入病毒載體以轉導T細胞;開啟細胞培養(yǎng)擴增,期間持續(xù)柔和振蕩反應器,維持液體溫度在(37±0.5)℃范圍內,實時在線監(jiān)控pH、CO2濃度、DO濃度并及時補充新鮮培養(yǎng)液、磁珠、蛋白;細胞培養(yǎng)擴增結束后,開啟細胞收集,磁鐵轉位機構轉入反應器底部,排出廢液,分離CAR-T細胞與雜質,泵入生理鹽水,完成對CAR-T細胞的洗滌,將殘留在8 μm濾膜的CAR-T細胞充分轉移至反應器內,最后將CAR-T細胞泵入細胞收集袋,CAR-T細胞制備過程結束。系統(tǒng)當前所處的CAR-T細胞制備流程、加入試劑的種類與體積、操作者的軟件操作記錄都以日志文件的形式被詳細記錄下來,便于溯源。CAR-T細胞自動化制備系統(tǒng)原型樣機實物圖如圖1(b)所示。

1.2 機電控制系統(tǒng)架構設計

機電系統(tǒng)設計架構圖如圖2所示,使用電腦作為上位機、Arduino Mega 2560控制板作為下位機。上位機接入條碼槍掃描患者條形碼、讀取患者信息,系統(tǒng)當前所處的CAR-T細胞制備流程、加入試劑的種類與體積、操作者的軟件操作記錄都以日志文件的形式被詳細記錄下來,便于溯源;下位機連接控制繼電器、步進電機驅動器,控制夾管閥、蠕動泵、步進電機和舵機的時序動作;上位機與下位機之間通過串口RS-232進行實時通信。溫控模塊采用加熱膜、液體溫度傳感器、位式控制技術將細胞培養(yǎng)液的穩(wěn)定控制在(37±0.5)℃;pH控制模塊使用pH傳感器和平衡控制程序實時監(jiān)控反應器中細胞培養(yǎng)液的pH值變化,并將pH數(shù)據(jù)實時傳送給下位機,維持培養(yǎng)體系的弱堿性;CO2濃度控制模塊使用CO2濃度傳感器配合夾管閥,結合反饋控制算法,使得反應器內CO2濃度始終維持在適于細胞生長的5%;DO控制模塊使用DO傳感器獲取培養(yǎng)液中DO的實時濃度數(shù)據(jù),并結合CO2濃度數(shù)據(jù)決定氣瓶閥門的開閉以更新反應器內氣體環(huán)境。

圖2 機電控制系統(tǒng)架構設計圖

1.3 生物反應器設計

利用Catia軟件建立生物反應器三維模型如圖3(a)所示,反應器包含一個液體輸入輸出接頭;根據(jù)初始細胞量和不同階段的增殖量,設計階梯式反應器結構,確保每個階段的最佳細胞密度和懸液容積。如圖3(b)所示為反應器內部結構圖,初始培養(yǎng)區(qū)位于液體接頭處,該區(qū)域有利于減少磁珠的損耗、增強磁場力對磁珠的吸附作用,便于細胞分選過程的高效進行;為了便于控制,使用步進電機[8]帶動反應器正反旋轉,配合容器內的葉片結構,形成對培養(yǎng)液的柔和振蕩,從而使得細胞可以充分接觸氧氣和養(yǎng)分,細胞之間的通訊信號聯(lián)系更為容易,且使用步進電機具有精度高、速度范圍寬等特點[9]。反應器底部的溫控模塊用于對反應器內的液體進行加熱、保溫,為細胞增殖提供適宜的溫度環(huán)境。磁鐵轉位機構驅動條形磁鐵進入反應器底部,吸附固定磁珠,實現(xiàn)分選T細胞的功能。反應器外部有孔徑8 μm的聚丙烯濾膜過濾器,用于T細胞的過濾分離。

圖3 反應器圖

2 實驗

2.1 培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控實驗

人體細胞生長增殖最適宜的溫度范圍為(37±0.5)℃[10],因此需要確保反應器中的培養(yǎng)液溫度上升到該范圍內并持續(xù)保溫。實驗中間隔向反應器通入培養(yǎng)液,使得反應器的液體量分別達到15 mL、30 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL,以模擬細胞增殖過程中,不斷向反應器添加新鮮培養(yǎng)液的過程。每加入一次培養(yǎng)液后,加熱膜依據(jù)Arduino Mega 2560所采集到的液體溫度數(shù)據(jù)進行通斷加熱,使其溫度始終維持在(37±0.5)℃范圍內?？販剡^程采用位式控制技術并對溫度范圍分段,設定細胞培養(yǎng)液(25～33)℃為快速升溫階段、(33～36.5)℃為緩慢加熱階段、到達36.5 ℃時為保溫階段。有機玻璃薄板溫度過高容易變形,并且傳熱路徑有熱損耗,因此在快速升溫階段,加熱膜的表面溫度被控制在60 ℃;在緩慢加熱階段,加熱膜的表面溫度被控制在45 ℃;在保溫階段,加熱膜的表面溫度被控制在42 ℃。由于液體具有一定程度的熱慣性[11],達到保溫階段的液體還會有較小幅度的溫升,所以溫度控制下限為36.5 ℃。

體外培養(yǎng)人體細胞最適宜的pH范圍為7.2～7.4[12],過酸或者過堿都會影響細胞的正常生長,因此需要控制培養(yǎng)體系的pH穩(wěn)定在該范圍之內。以每次加入0.02 mL pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffered Saline, PBS)、每隔5 min加入一次的策略,模擬細胞在擴增狀態(tài)下乳酸的釋放與堆積導致培養(yǎng)體系pH下降的過程,設置pH的控制下限為7.15,pH傳感器的讀數(shù)低于控制下限后,加入5 mL pH 7.5的PBS(模擬添加新鮮培養(yǎng)液),一方面使得培養(yǎng)體系的pH回升到適宜細胞生長的7.3左右,另一方面起到稀釋細胞的作用,防止因為密度過大、營養(yǎng)物質匱乏而阻礙細胞的進一步擴增,整個實驗過程中柔和振蕩反應器,充分混合內部液體。

氣體環(huán)境對于細胞的呼吸作用有著重要的作用。體外條件下,氣體環(huán)境應該保持為5%CO2[13-14]+95%空氣的混合氣體狀態(tài)。本實驗使用CO2濃度傳感器和閥門來控制反應器氣體環(huán)境,當傳感器讀數(shù)低于設定值4.9%,下位機控制閥門11開啟,釋放5%CO2的混合氣體進入反應器,更新氣體環(huán)境。裝有混合氣體的氣瓶經(jīng)過減壓閥、流量計降壓降速至流速(0～100)mL/min,再經(jīng)過閥門11連接到反應器的氣體接頭,閥門9常閉,CO2傳感器安裝在反應器內部,下位機采集CO2數(shù)據(jù)并據(jù)此控制閥門11通斷以調節(jié)CO2濃度,當監(jiān)測到傳感器讀數(shù)低于4.9%時,下位機控制閥門11開啟3 s,當讀數(shù)高于4.9%時,閥門11保持關閉狀態(tài)。

充足的氧氣供應是細胞進行呼吸作用的必要條件[15]。在CAR-T制備體系中,細胞的生長環(huán)境是培養(yǎng)液,因此需要監(jiān)控培養(yǎng)液中DO濃度。在37 ℃的液體溫度環(huán)境下,本實驗使用DO傳感器研究振蕩過程對DO濃度的影響。本實驗在靜態(tài)條件下監(jiān)測DO濃度,后以5 r/min的轉速柔和振蕩反應器,在動態(tài)條件下監(jiān)測DO濃度,再重復一次上述靜態(tài)-動態(tài)過程,采集DO濃度數(shù)值并繪制曲線圖。

2.2 細胞過濾分離實驗

CAR-T制備流程中需要多次清洗細胞產(chǎn)品,去除雜質成分。T細胞屬于懸浮細胞系,粒徑10 μm左右,本實驗中使用粒徑10 μm、密度1.05 g/cm3的聚苯乙烯乳膠微粒代替T細胞,測試基于8 μm濾膜過濾方案的分離效果。設x為稀釋倍數(shù),單個微球體積為V0,人體外周血中T細胞的密度a為2.4×109/L,乳膠微粒分散體系密度c為25 mg/mL,聚苯乙烯的密度ρ為1.05 g/cm3,微球半徑R為5 μm,由濃度換算關系得:

(1)

其中:

(2)

得到x=18.958,取x=19。

根據(jù)上述計算得到的結果,將50 μL乳膠微粒懸濁液加入950 μL培養(yǎng)液中混勻,作為模擬PBMC懸液使用。將PBMC懸液泵入反應器的初始培養(yǎng)區(qū);開啟閥門3和9,泵入4mL培養(yǎng)液;開啟閥門10,反應器內的液體通過8 μm濾膜泵出至細胞培養(yǎng)板中,標記為A1;打開閥門3和9,泵入適量的培養(yǎng)液,將殘留在8 μm濾膜的細胞回流至反應器內。CAR-T細胞制備流程中, T細胞的清洗過程往往需要三次重復的清洗步驟,因此再重復兩次上述操作,液體泵出至細胞培養(yǎng)板中,分別標記為A2、A3;最后向反應器泵入5 mL培養(yǎng)液,打開閥門9,泵出反應器內的所有液體至細胞培養(yǎng)板中,標記為A4,將細胞培養(yǎng)板放入恒溫箱中干燥48 h,在200倍光學顯微鏡下拍照并計數(shù)微球數(shù)量,觀察細胞過濾分離效果。

2.3 磁珠吸附固定實驗

獲取患者的PBMC之后,需加入特定抗體修飾的CD3磁珠以分選T細胞[16]。該過程有兩個關鍵點:一是抗體修飾的磁珠能夠準確識別T細胞并牢固結合,二是磁珠與T細胞結合后,外加磁場可以將磁珠牢固吸附在反應器底部,使其不會隨著液體的流動而移動。磁珠與T細胞識別并結合后,一旦磁珠被吸附固定,相應的T細胞也就完成了分選的過程。

CAR-T細胞制備過程中常用的CD3免疫分選磁珠為直徑5 μm的微球,微球表面偶聯(lián)有CD3抗體以陽性分選CD3+T細胞[17]。與CD3免疫磁珠相似,SiO2磁珠具有超順磁性,與CD3免疫磁珠有著相同的磁場行為,且兩種磁珠的密度相似(1.7 g/cm3左右)。本實驗中采用粒徑5 μm的球形SiO2磁珠(百納泰科,中國)代替CD3免疫磁珠。設y為稀釋倍數(shù),臨床上的CD3/28免疫分選磁珠的濃度為1.7×108/mL,SiO2磁珠(百納泰科,中國)的濃度為10 mg/mL,磁珠密度為1.82 g/cm3,磁珠半徑為2.5 μm,按照與公式(1)、(2)相同的計算方法得出y=2。CAR-T制備流程中需要加入200 μL磁珠,根據(jù)上述計算結果,將100 μL SiO2磁珠懸濁液泵入反應器,開啟閥門3和9,將4.9 mL培養(yǎng)液泵入反應器。靜置30 s后,磁鐵轉位機構將條形磁鐵轉入反應器底部。充分吸附2 min后,開啟閥門9,將液體泵入細胞培養(yǎng)板中,標記為B1。磁鐵轉位機構轉出,開啟閥門3和9,將5 mL培養(yǎng)液泵入反應器,柔和振蕩反應器并向其中通入空氣產(chǎn)生大量氣泡(模擬吹打細胞操作以促進分散),打開閥門9,將反應器內的液體全部泵出至細胞培養(yǎng)板中,標記為B2。

3 結果與分析

3.1 培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控實驗

溫度、pH、CO2、DO傳感器讀數(shù)曲線圖如圖4所示。從溫度變化曲線可以看出,培養(yǎng)液一共分為6次加入,最終的液體體積量為400 mL。每一次加入液體的瞬間,液體溫度有較大下降?？刂瞥绦蚣皶r響應使得液體進入快速加熱階段,液體立刻以較快速率升溫;當液體溫度高于33 ℃時,為了避免控溫超調、減小液體系統(tǒng)的熱慣性,進入緩慢加熱階段,最終維持在(37±0.5)℃的范圍內,該溫度范圍是細胞增殖的最適溫度范圍。從pH變化曲線可以看出,初始液體是15 mL pH 7.5的PBS,由于外加pH 6.5 PBS的影響(模擬細胞在增殖過程中乳酸產(chǎn)生、堆積的過程)培養(yǎng)體系的pH會逐漸下降,當?shù)陀诳刂葡孪?.15時,反饋程序調節(jié)向反應器內補充5 mL pH 7.5的PBS,其作用一是使得pH回升至最適宜的7.2～7.4,二是起到稀釋細胞的作用,防止細胞因過度密集、養(yǎng)料匱乏而阻礙進一步擴增。從CO2濃度變化曲線可以看出,初始狀態(tài)下CO2濃度讀數(shù)遠低于目標值5%,程序控制氣閥打開,CO2氣體迅速進入反應器,并維持在5%的水平,當CO2濃度出現(xiàn)±0.1%的波動時,程序控制氣閥自動開啟以更換反應器內的氣體,使CO2濃度始終維持在5%。從DO濃度變化曲線可以看出,在37 ℃的液體溫度環(huán)境下,靜態(tài)DO濃度處于比較低的4 mg/L水平;開始振蕩(5 r/min)后, DO濃度會增加到接近6 mg/L的水平,并最終穩(wěn)定在6 mg/L;停止振蕩后,DO濃度又恢復為4 mg/L;再次開始振蕩后,DO濃度仍會增加并保持穩(wěn)定。說明對反應器的柔和振蕩有利于提升培養(yǎng)液中DO濃度。

圖4 培養(yǎng)環(huán)境核心參數(shù)監(jiān)控曲線圖

3.2 細胞過濾分離實驗

細胞培養(yǎng)板A1、A2、A3、A4標記位置的顯微觀察照片如圖5所示。

圖5 A1、A2、A3、A4標記位置的顯微觀察照片

A1、A2、A3分別為CAR-T細胞制備工藝三次洗滌流程結束后廢液中微球的顯微照片,照片中微球數(shù)量越少,代表廢液中殘留的T細胞數(shù)量越少;A4為反應器內部液體中微球的顯微照片,從照片中可以看出,微球密密麻麻鋪滿整個視野而且分布在不同焦平面層上,數(shù)量十分巨大。采用五點取樣法對各個位置的微球密度進行計數(shù),得到各標記位置的微球密度如表1所示。

表1 各標記位置的微球密度計算表/(個/ mm2)

由表1可以得出如下結果:

(1) 洗滌廢液和反應器內液體的微球密度,有著數(shù)量級上的差別。經(jīng)過三次洗滌過程,廢液中所包含的微球密度總和約占反應器內微球密度的2.13%,反應器內微球占微球總數(shù)的97.91%。

(2) 洗滌過程中,隨著洗滌次數(shù)的增加,廢液中微球密度成倍數(shù)減少。

實驗表明基于8 μm濾膜的細胞過濾分離結構配合液體回流方法能夠實現(xiàn)T細胞與廢液的充分分離。

3.3 磁珠吸附固定實驗

細胞培養(yǎng)板B1、B2位置的顯微照片如圖6所示,照片顯示廢液中磁珠數(shù)量很少,只有零星聚集,而反應器內磁珠數(shù)量很多,在視野中呈分散式均勻分布,磁珠團聚較少。對比兩張圖片,可以看出廢液和反應器中磁珠數(shù)目有著很大區(qū)別,并且反應器內磁珠分散較均勻,團聚現(xiàn)象很少出現(xiàn)。綜上所述,條形磁鐵的磁珠吸附固定方案能夠有效地完成對T細胞的分選過程,并且在很大程度上避免磁珠團聚,增強磁珠的分散程度。

圖6 磁珠顯微照電

4 結論

本文研發(fā)了一套符合GMP規(guī)范的封閉式、自動化CAR-T細胞制備與監(jiān)控原型樣機,系統(tǒng)能夠實現(xiàn)反應器內細胞培養(yǎng)液溫度、pH、CO2濃度、DO濃度等核心參數(shù)的在線監(jiān)測與調控;基于8 μm濾網(wǎng)的細胞過濾清洗方案和基于磁鐵轉位機構的磁珠吸附分選方案,能夠實現(xiàn)對T細胞的分離清洗和免疫磁珠分選,除此之外該系統(tǒng)還具有物料自動定量添加、細胞收集等功能。

綜上所述,本文所開發(fā)的全封閉、自動化CAR-T細胞制備與監(jiān)控原型樣機能滿足CAR-T細胞制備的基本要求,應用于CAR-T細胞的自動化生產(chǎn)有廣闊的前景。