基于ICP-MS及多元統(tǒng)計分析相結(jié)合的地黃酵素發(fā)酵前后無機元素特征

何江龍 裴莉昕 張童童 紀(jì)寶玉 婁玉霞 陳隨清 董誠明

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 鄭州 450046)

隨著居民生活水平的提高和保健意識的增強,人們對健康越來越重視,植物性中藥及其制品也受到人們的廣泛關(guān)注和青睞,成為目前保健品市場上備受關(guān)注的一類產(chǎn)品。近年來,人們更加注重食品安全問題,同時又追求天然植物性原料產(chǎn)品,這些因素使得一些純天然的綠色食品受到歡迎[1]。在食品加工領(lǐng)域,越來越多的學(xué)者關(guān)注到這一新型保健食品的功能,國內(nèi)外也都非常重視中藥的開發(fā)利用,特別是在食品領(lǐng)域功能性產(chǎn)品的開發(fā)[2],中藥保健食品行業(yè)也迎來了蓬勃的發(fā)展。

中藥成分復(fù)雜,含有多種化學(xué)成分,具有豐富的營養(yǎng)價值和獨特的藥理生理等活性[3],這些有效成分對人的生命健康起著至關(guān)重要的作用[4],同時也為保健食品的開發(fā)提供了新材料,因而被廣泛開發(fā)成各種保健品。隨著保健食品方面的需求不斷增加,作為傳統(tǒng)中藥之一的地黃也開始逐漸進入大眾視野,其保健作用已被人們所接受[5]。地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根,具清熱涼血、滋陰生津等功效[6]。地黃酵素是以地黃藥材為原料,利用微生物發(fā)酵技術(shù)制備的一種具有多種生物活性的植物多酚物質(zhì),它能促進機體內(nèi)各種酶系和新陳代謝系統(tǒng)活動,具有一定的抗氧化作用。

中藥發(fā)酵是借助微生物的生長代謝作用,在適當(dāng)?shù)臈l件下對中藥進行發(fā)酵,促進有效成分的溶出和成分的轉(zhuǎn)化,改變其原有的特性,增強并產(chǎn)生新的藥效[7]。無機元素廣泛存在于植物中,也是中藥產(chǎn)生臨床療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[8-9],無機元素的測定方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等,由于ICP-MS具有準(zhǔn)確度高、精密度好、抗干擾能力強、檢測限低等優(yōu)點,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域[10-12]。目前關(guān)于發(fā)酵對中藥影響的研究多集中于化學(xué)成分及藥理作用等方面,而對發(fā)酵前后無機元素的影響鮮有報道。為了進一步探討地黃酵素制備過程中無機元素的變化,本研究以不同來源的地黃為原料,利用ICP-MS結(jié)合多元統(tǒng)計學(xué)方法對地黃酵素發(fā)酵前后樣品中的無機元素含量變化特征進行分析,為地黃酵素在功能性食品添加劑方面的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

地黃樣品共4批,產(chǎn)地分別為河南焦作沁陽(S1)、河南焦作沁陽保存45 d(S2)、河南焦作溫縣(S3)、河南許昌鄢陵(S4)。地黃酵素發(fā)酵前樣品由4批地黃樣品用水提取后烘干制得,命名為ST1-ST4;地黃酵素由4批地黃樣品用水提取后經(jīng)乳酸菌及酵母菌發(fā)酵、烘干后制得,命名為SF1-SF4。

1.2 儀器設(shè)備

ICAP RO電感耦合高頻等離子體質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)、MARS 2微波消解儀(培安·CEM微波化學(xué)技術(shù)中心)、GS25石墨趕酸儀(成都奧普樂有限公司)、FA2004N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)、DZF-6021真空干燥箱(上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.3 試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液

Al、As、B、Ba、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、Mn、Mo、Ni、P、Pb、Se、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100 μg/mL,介質(zhì)為15%HCl、5%HNO3,國家有色金屬及電子材料分析測試中心),Na、K、Ca、Mg混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1 000 mg/L,介質(zhì)為5%HNO3,上海源葉生物科技有限公司),Bi、Ge、In、Li內(nèi)標(biāo)儲備溶液(100 μg/mL,介質(zhì)為10%HNO3,Agilent Technologies公司),Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U質(zhì)譜調(diào)諧液(1.00 μg/L,以2%HNO3、0.5%HCl為介質(zhì),Thermo Fisher Scientific公司)。硝酸(上海安譜實驗科技有限公司),實驗用水為蒸餾去離子水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品制備

將鮮地黃切片烘干后破碎成粉,以1∶40的料液比超聲水提,不經(jīng)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵,離心,濃縮,烘干成粉,得到地黃未發(fā)酵樣品。將鮮地黃切片烘干后破碎成粉,以1∶40的料液比超聲水提,后經(jīng)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵86 h后離心,將發(fā)酵液濃縮,烘干,研磨成粉,得到地黃酵素。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

使用5%的HNO3溶液將100 μg/mL多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋為0.02、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、10.00、20.00、100.00、250.00 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液,將1 000 mg/L的堿金屬混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成0.01、0.05、0.25、0.50、1.00、1.25、2.50、5.00、10.00、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/L的混合堿金屬標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液,將100 μg/mL內(nèi)標(biāo)儲備溶液稀釋成10 μg/L,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.3 供試品溶液制備

準(zhǔn)確稱取每種樣品0.20 g(精確至0.000 1 g)于微波消解罐中,以不加樣品作空白對照,分別向消解罐中加入6 mL HNO3,輕輕搖動使樣品散開,在120 ℃條件下預(yù)消解15 min,冷卻至30 ℃左右,旋緊罐蓋放入微波消解儀中,消解至溶液呈無色透明或淺黃色,打開罐蓋,排氣,將消解罐置于趕酸儀中,130 ℃下趕酸6 h至1～2 mL,透明無殘渣狀態(tài),放冷后將消解液轉(zhuǎn)移,并用少量去離子水將消解罐洗滌3次,合并洗滌液與消解液定容至50 mL,混勻備用。檢測前使用去離子水稀釋50倍。

1.4.4 微波消解程序的設(shè)置

第一階段:爬坡溫度100 ℃,時間8 min,保持5 min;第二階段:爬坡溫度150 ℃,時間5 min,保持5 min;第三階段:爬坡溫度170 ℃,時間2 min,保持10 min;第四階段:爬坡溫度190 ℃,時間2 min,保持30 min后冷卻至室溫。

1.4.5 ICP-MS工作條件

ICP-MS工作條件見表1。

表1 ICP-MS工作參數(shù)Table 1 ICP-MS working parameters

1.4.6 方法學(xué)驗證

1)線性范圍考察:取上述配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,按設(shè)定的參數(shù)測定,以各元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、各元素經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正的信號值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算線性回歸方程并獲得相關(guān)系數(shù)。

2)檢出限:以樣品空白溶液連續(xù)測定6次所產(chǎn)生信號響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差的3倍所對應(yīng)的待測元素濃度表示檢出限。

3)精密度:準(zhǔn)確稱取同一樣品1份,按實驗方法制備樣品溶液,重復(fù)進樣6次,測定并計算其中各元素的含量,計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.7 樣品中無機元素的含量測定

取適量地黃粉末,按實驗方法分別制備地黃發(fā)酵前后的樣品和相應(yīng)的供試品溶液,再按實驗方法分別進樣測定24種無機元素的含量,每份樣品平行測定3次,并按標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法計算其含量。

1.4.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 26軟件進行t檢驗分析,取P<0.05為顯著性。利用ChiPlot軟件對24種元素進行相關(guān)性分析,根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)判斷不同元素之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ICP-MS測定地黃酵素發(fā)酵前后無機元素的方法學(xué)驗證

24種無機元素線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限等結(jié)果列于表2,結(jié)果表明,24種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在測定范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均在0.998以上,可滿足檢測要求。精密度測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13%～4.1%,表明該儀器精密性良好,滿足實驗要求。重復(fù)性測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%～5.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

表2 ICP-MS測定地黃酵素發(fā)酵前后方法學(xué)驗證結(jié)果Table 2 Results of methodology verification before and after rehmannia fermentation determined by ICP-MS

2.2 地黃酵素發(fā)酵前后無機元素的含量分析

發(fā)酵液和原液中的無機元素來源大致可以分為三類:原料、微生物與發(fā)酵環(huán)境(生產(chǎn)設(shè)備、用水、空氣等)的引入[13]。其中,地黃原料及發(fā)酵環(huán)境是發(fā)酵中金屬無機元素的主要來源。地黃酵素以地黃為主要原料,這些原料在生長過程中一方面吸收了土壤中含有無機元素的肥料,另一方面也富集了土壤中污染的無機元素,因此地黃原料中無機元素的特點在一定程度上反映了地黃產(chǎn)地的土壤特征,也決定了地黃酵素?zé)o機元素的含量和組成。地黃酵素發(fā)酵前后無機元素的含量測定結(jié)果(表3)表明,除個別元素外,24種無機元素均可以在地黃酵素發(fā)酵前后的樣品中檢測到,但是四個產(chǎn)地的地黃相應(yīng)樣品中無機元素的含量差異較大。另外,地黃酵素發(fā)酵前后樣品中無機元素的含量特征也存在差異,發(fā)酵前含量較高的元素為K、Ca、Na、P、Mg,這幾種元素與植物生長必須的元素相一致,其次為Fe、Pb、Al、Sr、Ti、Ba、B、Se、Mn、Zn、Cu等,其含量在2.77～28.19 mg/kg,其余8種元素的含量均較低,其中Cd、Co、V三種元素的平均含量均低于0.1 mg/kg;發(fā)酵后含量較高的元素為K、Na、Ca、Mg、P,其次為Fe、Al、Pb、Mn、Sr、B、Se、Ba、Ti、Zn等,其含量在3.56～34.66 mg/kg,其余9種元素的含量均較低,其中Cd、Co、Ni三種元素的平均含量均低于0.1 mg/kg。比較發(fā)酵前和發(fā)酵后地黃液中對應(yīng)24種無機元素的平均含量,可以看出,發(fā)酵前Mg、P、K、Ca、Ti、V、Cr、Ni、Cu、As、Mo、Sn、Ba和Pb元素含量高于發(fā)酵后,而發(fā)酵后B、Na、Al、Mn、Fe、Co、Zn、Se、Sr和Cd元素則高于發(fā)酵前。以上結(jié)果表明,地黃酵素發(fā)酵前后,雖然含量較高的元素種類基本沒有發(fā)生變化,但各元素的含量在發(fā)酵前后卻發(fā)生了變化,因此發(fā)酵對地黃原料中無機元素的種類沒有影響,但對無機元素的含量影響較大。

表3 地黃酵素發(fā)酵前后樣品中無機元素含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of inorganic elements in samples before and after rehmannia fermentation /(mg·kg-1)

2.3 地黃酵素發(fā)酵前后無機元素含量的差異性分析

為了進一步探討地黃酵素發(fā)酵前后無機元素的差異性規(guī)律,利用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件,采用最大方差旋轉(zhuǎn)法對24種元素在地黃酵素發(fā)酵前后樣本中的組成進行因子分析。圖1為各元素在主成份因子分析所提取的前三個主成分上的載荷所繪制的三維因子分布圖,各元素的對應(yīng)載荷值差異反映了其在相應(yīng)主成分上的相似性,在三維因子分布圖上越靠近,表明這些元素相似程度越高[14]。從各元素在發(fā)酵前地黃溶液中的因子載荷分布在因素1和因素2(這兩個主成分對因子分析的貢獻率最高)組成的平面上的投影可以看出,在發(fā)酵前的地黃酵素樣品中24種元素大致可以分為三組:Al、Cd、Co和Se等4種元素為第一組,P、Ni、Ti、Ca和Pb等5種元素為第二組,剩余15種元素為第三組。發(fā)酵后的地黃酵素樣品中的各元素組成同樣可以分為三組:第一組為Na、Ca、Sn、Cr、Cu、V、Mn、Ni、Ba、Mo和K 等11種元素,第二組為Co、Pb、B、Al和Ti等4種元素,剩余6種元素則為第三組。比較分析發(fā)酵前后地黃酵素樣品中各簇元素組成特點發(fā)現(xiàn),盡管各元素的相對含量排序在兩組樣品中基本相同,但在發(fā)酵前后24種元素的分類特征卻明顯不同,這表明根據(jù)因子分析結(jié)果的多元素分組并不完全依賴各元素的含量高低。

圖1 地黃酵素發(fā)酵前(a)及發(fā)酵后(b)24種無機元素的因子載荷分布圖Figure 1 Factor loading distribution of 24 inorganic elements before(a)and after(b)rehmannia fermentation.

地黃酵素發(fā)酵前后樣品中24種無機元素的因子載荷分析表明,兩種樣品的無機元素在組成特征上存在差異,為了進一步尋找引起差異的無機元素,利用發(fā)酵前后4個樣品24種無機元素的平均含量作為分析對象,使用SPSS軟件的配對t檢驗法對發(fā)酵前后樣品中無機元素的差異性進行檢驗(表4)。結(jié)果表明,地黃提取液經(jīng)過發(fā)酵后,Na、P、Mn、Se、Sr和Cd等6種元素的含量差異在統(tǒng)計學(xué)上達顯著水平(p<0.05),盡管發(fā)酵后地黃液中B、Al、Fe、Co和Zn元素含量高于發(fā)酵前樣品,但是兩者之間的含量差異并未達到顯著水平。

表4 地黃酵素發(fā)酵前后樣品中各無機元素平均含量的配對t檢驗結(jié)果Table 4 Paired t-test results of average contents of inorganic elements in samples before and after rehmannia fermentation

2.4 地黃酵素發(fā)酵過程中無機元素變化趨勢的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析是對兩個或多個變量進行分析,從而衡量兩個變量因素的相關(guān)密切程度[10]。地黃酵素發(fā)酵前后無機元素含量分析表明,地黃發(fā)酵過程中無機元素發(fā)生了不同的變化過程,為了分析地黃酵素發(fā)酵過程中24種無機元素之間的變化關(guān)系,將24種元素在發(fā)酵過程中的變化趨勢進行Pearson相關(guān)性分析(圖2)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,Ca和Ti、Ni,As和Zn、Cr,Al和B的變化趨勢存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系,Pearson相關(guān)系數(shù)在0.90以上,其中,Ca和Ti之間的Pearson相關(guān)系數(shù)達到0.97;Ti和Ni,Cr和Ba、Sn,Se和Sr、Cd,Na和Mn存在顯著的正相關(guān)關(guān)系,Pearson相關(guān)系數(shù)在0.80以上;而P和Mn,Ba和Pb存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,Pearson相關(guān)系數(shù)在-0.80以下。因此,地黃酵素發(fā)酵過程中各無機元素之間的代謝相互影響。

圖2 地黃汁發(fā)酵前后各元素之間相關(guān)性的Pearson 分析系數(shù)Figure 2 Pearson analysis coefficient for the correlation between elements before and after fermentation of rehmannia juice.

3 討論

Ca和P是植物生長所必須的元素,Ca被植物吸收后,大部分與生物配體結(jié)合后以配合物的形式存在,依據(jù)Ca是否與配體結(jié)合,將Ca的存在形式分為自由離子態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種,而P元素在植物體內(nèi)則主要是以植酸磷的形式存在,結(jié)合態(tài)的Ca和植酸磷溶解度較差。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過發(fā)酵制備的地黃酵素中Ca和P含量均降低,其中P降低比較明顯,這可能由于在地黃酵素的制備過程中,在微生物的作用下產(chǎn)生一些可以與游離態(tài)Ca和P結(jié)合的化學(xué)成分,導(dǎo)致溶液中游離態(tài)元素的含量降低。另外,發(fā)酵后Na含量明顯增加,這可能是經(jīng)乳酸菌和酵母發(fā)酵后地黃內(nèi)的Na以離子態(tài)釋放到提取液中,使得地黃酵素Na的含量升高。Pb、As、Cr和Cd等元素常被視為食品中的有害元素,其濃度超標(biāo)可能帶來健康威脅,通過對四批地黃提取物和地黃酵素中As、Cr、Cd、Pb等4種有害元素進行檢測,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地和發(fā)酵過程影響4種有害元素的含量,發(fā)酵可使地黃中部分有害元素As、Cr、Pb含量降低,發(fā)酵后Cd元素含量雖有所上升,但符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》GB 2762—2017中食品中污染物的限量規(guī)定。

4 結(jié)論

本研究利用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法對地黃酵素發(fā)酵前后樣品中24種無機元素的含量進行測定,結(jié)果表明采用微波消解法對地黃酵素實際樣品進行前處理,可以實現(xiàn)批量處理,操作簡便快速,試劑用量少,消解效果好,具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,可以應(yīng)用于地黃酵素樣品中無機元素的含量測定,該研究為地黃酵素在功能性食品添加劑方面的研究和地黃酵素的制備開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐,同時為其他中草藥功能性保健食品中無機元素的檢測提供方法參考。

在研究中發(fā)現(xiàn),在地黃酵素的發(fā)酵過程中由于微生物的引入、生長和遷移,以及發(fā)酵代謝產(chǎn)物的生成、擴散和轉(zhuǎn)移,部分無機元素的存在狀態(tài)可能會隨著發(fā)酵的進行而發(fā)生變化,但具體的變化機理還有待于進一步研究。